Método de preparación de muestras histológicas

Fijación

Fundamentos:

• Producir el cese de la actividad biológica

• Remplazar las débiles uniones intermoleculares por otras más estables preservando las estructuras y componentes químicos de las células

• Proveer al tejido de la consistencia óptima para su manipulación

• En algunos casos otorgar contraste

Características del fijador ideal:

• Capacidad para bloquear de inmediato la autolisis

• Efecto microbicida

• No provocar distorsiones en la arquitectura

• Inducción de cambios en la composición tisular que

• favorezcan inclusión, corte y coloración

Tipos de fijación:

• Histológica: Conservación de estructura

• Histoquímica: Preservación de composición química

Por perfusión

Por inmersión

Química

Física

Químicos

• Estables

• Técnica simple

• No requieren equipamiento especial

• No son caros

• Se puede conservar el material en fijador

• Pueden ser coagulantes o no aditivos (etanol, acetona)

• No coagulantes o aditivos (formol, glutaraldehído, OsO4)

PARAFORMALDEÍDO O FORMOL:

• El más pequeño (CH2O)

• Precipita las proteínas fijándose al los grupos aminos.

• Ácidos grasos insaturados (doble enlace etilénico)

• Se puede asociar a otros fijadores

• Rápida penetración, fijación lenta

• Es reversible (crosslink debil)

• No provee electrodensidad

• Dilución 10 % (4%)

DIALDEHÍDO GLUTÁRICO O GLUTARALDEHÍDO:

• Estabiliza las proteínas sin alterar la estructura terciaria.

• Actúa solo sobre los fosfolípidos con un grupo amino libre.

• Penetración lenta.

• Irreversible

• Inactiva algunas enzimas y antígenos.

• No provee electrodensidad.

• Principal fijador para microscopía electrónica.

• Dilución 1 al 8%

Tetróxido de Osmio (OsO4):

• Penetración muy lenta

• Potente oxidante (inactiva enzimas y Ag)

• Soluble en medio polar y no polar (hidrofóbicos e hidrofílicos)

• Produce electrodensidad

• Actúa sobre lípidos insaturados

• Muy tóxico

• El volumen del líquido debe superar 20 veces el tamaño de la muestra

• Dilución 1%

Alcohol etílico 95%:

• Gran velocidad de penetración

• Precipita glucógeno y proteínas

• Buen conservante (bactericida)

• Extracción parcial de los lípidos

• Fijación inadecuada de los ácidos nucleicos

• Endurecimiento y retracción excesiva de los tejidos

Ácido acético:

• Soluciones descalcificantes

• Fija mucoproteínas y ácidos nucleicos

• Mal fijador de membranas

• Destruye mitocondrias

• Dilución 1 – 5%

Ácido pícrico:

• Preserva muy bien ultraestructura

• Velocidad de penetración: lenta

• Velocidad de fijación : muy buena

• Conserva lípidos y glucógeno

• Otorga color amarillento al tejido

• Dilución: Solución saturada

Acetato de Uranilo:

• Se adhiere a radicales fosfatos de ácidos nucleicos y fosfolípidos

• Destaca aspecto trilaminar de las membranas

• Reduce extracción de proteínas en la deshidratación

• Precipita con el fosfato y cacodilato LAVAR BIEN

• Dilución 0,5 % (solución acuosa)

Soluciones buffers:

• Fosfato

• Cacodilato

• Colidina

• Aditivos con efectos protectors

• Cloruro de Calcio: preserva membranas

• Digitonina: estabiliza colesterol

• Permanganato de K: preserva mielina

• Ácido pícrico: inmunocitoquímica

• Rojo de rutenio: mucosustancias

• Ácido tánico: realza membranas y citoesqueleto

Físicos – Calor

Desecación – SEM

Microondas : Radiación no ionizada que interactúa con moléculas bipolares (agua, proteínas) causando rotación de180º de las moléculas a más de 2 billones de ciclos/s. A medida que la agitación molecular aumenta, el índice de difusión de las moléculas en solución, incluido los fijadores, aumenta Además se realzan las reacciones orgánicas por la radiación. Como resultado de la fricción molecular se genera calor, pero este no es la razón de la rápida fijación ya que por si solo no provee la adecuada preservación ultraestructural.

Ventajas:

• Disminución del tiempo de fijación

• Mejora la preservación estructural

• Evita pérdida de lípidos y proteínas solubles

• Preserva actividad antigénica

• Menor tiempo de polimerización de plásticos

Parámetros importantes para la fijación con microondas

A- Exponer los especimenes por no más de 30 a 60 segundos

B- Mantener la temperatura por debajo de 55 ºC

C- Controlar el tamaño del recipiente y del espécimen

D- Determinar el lugar apropiado del MO para colocar el espécimen

E- colocar un recipiente con agua para que absorba el exceso de energía

Físicos – Frio

Criófijación : TEM Rápida: N (-160ºC) Ultrarápida: He (-270ºC)

Seguida de criomicrotomía se utiliza para microanálisis o inmunocitoquímica. Para evitar la formación de cristales se coloca el material en concentraciones crecientes de sacarosa o glicerol (10-30 %).

Criosustitución: Tejido es mantenido en mezcla de solventes orgánicos (acetona – alcohol) y fijador a -80 ºC por días o semanas, el frío inactiva al fijador y durante este tiempo el agua de los tejidos es reeemplazada lentamente por la mezcla. Al aumentar la temperatura el fijador se activa fijando toda la pieza al mismo tiempo .Fijación simultanea

Criodesecación frío + vacío : SEM

Reglas a tener en cuenta para una buena fijación

• Se debe realizar lo más rápido posible

• Tamaño pequeño para favorecer la penetración

• Líquido fijador abundante 40 veces el tamaño de la pieza

• El tiempo de la fijación depende del tamaño de la pieza y de la velocidad de penetración del fijador escogido

Deshidratación

Reemplaza el agua de los tejidos por solventes orgánicos en soluciones crecientes. Para resinas hidrofílicas no es necesaria la deshidratación total.

INCLUSIÓN:

Consiste en infiltrar el tejido fijado y deshidratado en sustancias tue le otorguen la rigidez necesaria para obtener cortes los suficientemente finos como para ser observados al microscopio

Hidrofílicos

• Gelatina

• Polietilenglicol (carbowax)

• Durcupan

• Epon acuoso

• Lowicryl

• LRWhite

Hidrofóbicos

• Parafina

• Celoidina

• Metacrilatos

• Resinas Epoxi (Araldita – Epon – Spurr)

• Resina poliester (Vestopal – Rogilac)

CORTE

Fenómeno de interferencia de ondas luminosas reflejadas por el corte

Amarillo 280 – 320 nm

Verde 240 – 280 nm

Azul 190 – 240 nm

Púrpura 150 – 190 nm

Dorado 120 – 150 nm

Oro pálido 90 – 120 nm

Plateado 60 – 90 nm

Gris menos 60 nm

Coloración

COLORANTES:

• Grupo auxocromo (capacidad de teñir) Básico NH+ Ácido COOH-

• Grupo cromóforo (color)

• Colorantes básicos: Hematoxilina (núcleo violeta)

• Colorantes ácidos: Eosina (citoplasma rosado)

• Colorantes neutros: Giemsa (sangre – médula ósea)

• Colorantes metacromáticos: Azul de toluidina

• Acetato de uranilo: ácidos nucléicos y proteínas

• Citrato de plomo: membranas, ribosomas, glucógeno

• Rojo de rutenio: mucoproteínas

• Hidróxido de lantano: sustancia intercelular

• Peroxidasa: membrana plasmática

Técnica para el procesamiento de material para microscopia de luz. Rutina

Técnica para el procesamiento de material para microscopía electrónica de barrido SEM

Enviado por:

Ing.+Lic. Yunior Andrés Castillo S.

"NO A LA CULTURA DEL SECRETO, SI A LA LIBERTAD DE INFORMACION"®

Santiago de los Caballeros,

República Dominicana,

2016.

"DIOS, JUAN PABLO DUARTE, JUAN BOSCH Y ANDRÉS CASTILLO DE LEÓN – POR SIEMPRE"®

Autor:

Ing.+Lic. Yunior Andrés Castillo S.