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Diseño y elaboración de los medios de cultivo microbiológicos

Enviado por Carlos Rojas Maragoto



  1. Los tipos que existen de medios de cultivo
  2. El aislamiento microbiano en un cultivo puro
  3. Los métodos para aislar cultivos puros
  4. Sobre el Agar-Agar
  5. Las excelencias del agar como medio de cultivo
  6. Diferenciación en los medios de cultivo

Breve introducción

Concisa descripción sobre los medios de cultivo microbiológicos y los factores que la influye, así como una introducción al medio agar.

1. Introductorio a los medios de cultivo: factores influyentes, tipos de medios y aislamiento microbiano

Factores influyentes en diseño de un medio de cultivo

Llamamos factores influyentes aquellos como los nutrientes que se emplean, las condiciones físicas favorecedoras para el crecimiento bacteriano, factores como el aporte de nutrientes determinado por la prelación de un producto en concreto y las exigencias nutricionales del microorganismo, toda consideración que revista su pH por su posibilidad de inhibición del crecimiento microbiano y las necesidades de gases, al verse afectado por el oxigeno y el dióxido de carbono en el desarrollo microbiano. Así por su tolerancia al oxigeno tenemos que pueden ser aerobias o bacterias cuyo crecimiento y desarrollo se realiza en presencia de oxígeno libre, anaerobias o bacterias que crecen y se desarrollan en ausencia de oxígeno libre, anaerobias facultativas o bacterias que crecen y se desarrollan tanto en presencia como en ausencia de oxígeno libre, microaerófilas o bacterias que crecen y se desarrollan en presencia de pequeñas cantidades de oxígeno libre. Atendiendo a su influencia lumínica, es importante el suministro de luz para los organismos fotosintéticos. Esta iluminación no debe causar diferenciación en la temperatura del medio, recomendándose para ello el uso de lámparas fluorescentes. En cuanto al control de la temperatura y observación del proceso metabólico y de la morfología celular, cada especie microbiana

inviste una temperatura ideal de crecimiento, de este modo se observa la siguiente clasificación de grupos: psicrófilas : capaces de desarrollarse a 0ºC o menos, aunque crecen mejor a temperaturas superiores, cercanas a 15º o 20ºC.; mesófilas : crecen mejor en límites de temperatura que están entre 25 y 40ºC.; y termófilas : crecen mejor entre 45º y 60ºC.

Los tipos que existen de medios de cultivo

Atendiendo a su estado, los medios de cultivo pueden presentarse como "medios líquidos"; "medios sólidos" que contienen "Agar que gelifica por debajo de 45° C. y cuya concentración en su uso es del 1,5%; y "medios semisólidos" que contienen un agar a una concentración del 0,7%.

Si atendemos a su composición, pueden ser medios sintéticos que contienen fuente de carbono, fuente de nitrógeno, sales que suplan iones y demás elementos tales como estimuladores del crecimiento; medios complejos que contienen ingredientes tales como extracto de levadura, peptona, infusión de cerebro, etc, ricos en nutrientes; medios de enriquecimiento, siendo estos complejos con aditivos adicionales para favorecer así al crecimiento y desarrollo de determinados microorganismos y en particularmente a los heterótrofos exigentes; medios selectivos, los cuales son diseñados para favorecer el crecimiento específico de un microorganismo específico o un grupo microbiano; medios diferenciales que proporcionan la distinción microbiana de una mezcla por sus propiedades diferenciales de crecimiento en dichos medios; medios de mantenimiento; siendo desemejantes de los de crecimiento óptimo por el crecimiento rápido y prolífico que deriva en la muerte rápida de las células.

El aislamiento microbiano en un cultivo puro

Ya sabemos que un cultivo puro es aquel que se desarrolla a partir de una célula única y que pertenece a la misma especie y cepa. Ha que decirse que en un cultivo puro se da un artificio obligado para así observar cada especie y cepa microbiana en particular.

Los métodos para aislar cultivos puros

En los medios líquidos se sigue una técnica de dilución límite, asi el microorganismo que se busca en un cultivo mixto se va a encontrar en mayor cantidad que cualquiera de los otros microorganismos. Ello es posible conseguirlo gracias al cultivo puro mediante una serie de diluciones en tubo. Solo cuando la muestra esta bien diluida contendrá la bacteria que se busca. Así se recomienda la confirmación por la siembra en placa en cuanto a la pureza del cultivo .

En los medios sólidos se sigue una técnica de siembra por estrías en placa, en el que se utiliza un asa de platino, pasándose sobre una parte de la superficie de un medio de cultivo a base de agar y se siembra por estrías. , por técnica de siembra por difusión en placa o por técnica de vertido en placa

El aislamiento directo en medio selectivo y diferencial

Este se fundamenta en generar un ambiente de cultivo diseñado que favorezcan el desarrollo de cierto tipo concreto de bacterias que precisemos conseguir y que no sea adecuado para el resto microbiano

 

2. Introductorio al agar-agar y sus excelencias como medio de cultivo

Sobre el Agar-Agar

El Agar-Agar es un polisacárido y ficocoloide elaborado a partir de las algas Rodofíceas, cuya mixtura esta confeccionada a base de sales de polisacáridos galactósidos. Se puede decir que su utilidad como medio para el cultivo bacteriano es a día de hoy irreemplazable. Al Agar-Agar se le perfecciona con cationes atados,

tales como el sodio, potasio, calcio, magnesio, y demás, aunque, todo sea dicho, no esta del todo sabido que grado de influencia pueda llegar a tener sobre el mismo agar como producto.

En cuanto a sus detalles físico-químicas, en estado Sólido el agaragar se nos muestra con un aspecto blanco tendiendo a lo amarillento. Posee una textura del medio poroso, clareado y hasta membranoso. Posee la particularidad que al secarse se quiebra. En cuanto a su solubilidad no lo es en agua a 25ºC, lo es en agua a 100ºC y en formamida y lo será ligeramente en etanolamina. Asimismo, su equilibrio electrico se ve roto en solución, ultimando sales como sulfato de magnesio, de sodio o de amonio, causa de la precipitación parcial de la agaropectina. .

Son muy pocas las bacterias que soporta algún tipo de metabolismo o cambio en este medio o que llegue a desarrollar productos enzimáticos dispuestas a estropearlo. Además tiene el gran distintivo de ser idóneo para la mezcla con demás geles, polisacáridos y proteínas. Una característica significativa de la calidad de este producto como gel, es precisamente su resistencia a ser vencido por la presión. Esta fuerza de gel obliga en cierto modo a ser medida bajo incuestionables condiciones y es definida como la presión en gr/cm2 de superficie que resiste un gel, de concentración 1,5% en peso y durante 20 segundos a 20ºC. Asimismo, como gel muestra una característica física de gran importancia, puesto que establece su calidad, siendo esta precisamente lo que decimos que es la fuerza de gel.

Si nos referimos a los detalles quimicos del agar, esta formado por dos segmentos vitales, un polímero neutro, Agarosa, y un polísacárido sulfatado, Agaropectina. Asimismo, podemos decir que esencialmente la composición del agar es D - galactosa, 3-6 anhiro - L - galactosa, sulfatos y ácido pirúvico. En ocasiones participan de su disposición como compuesto 6 - 0 metil - D - galactosa y el ácido urónico. En cuanto a su peso molecular, esta estimado en torno a los 3.000 a 160.000, eso si, siempre dependiendo del tipo de coloide que haya.

Las excelencias del agar como medio de cultivo

Es bien conocido las ventajas y el gran provecho que se obtiene de este medio para el cultivo microbiano. Así podemos resaltar su extraordinaria resistencia a no ser desecho o estropeado por las bacterias en cultivo, aunque eso no quiere decir que no existan agentes microbianos que no puedan llevar a cabo este estropicio del medio agar, pero también hay que decir a su vez que el numero de bacterias que lo hacen es muy pequeño, e incluso se puede decir que el medio agar no es deshecho ni por aquellas que bien lo hacen en gelatina animal. Otras de las ventajas de este medio es su mantenimiento en estado sólido a la temperatura de incubación, no observando posibles roturas en la realización de la siembra. Y por último, se le puede resaltar como medio excelente por la capacidad de pasar de gel a sólido y viceversa, de modo que los microorganismos o bacterias son mezclados totalmente en el medio y a una temperatura no dañina.

Diferenciación en los medios de cultivo

El agar McConkey

Es un medio diferencial utilizado para la detección, aislamiento y enumeración de bacterias coniformes y patógenas intestinales en aguas, productos lácteos y muestras biológicas. Su acción diferencial radica en que las bacterias hábiles de fermentar lactosa provocan un descenso de pH, junto con una absorción del colorante, surgiendo en la colonia el color rojo. Las colonias de bacterias que no fermentan la lactosa quedan incoloras.

En cuanto a su composición por litro observamos 17 g de pancreático digestivo de gelatina; 1.5 g de pancreático digestivo de caseína, 1.5 de peptona de tejido animal; 10 g de lactosa; 1.5 g de sales biliares; 5 g de cloruro Sódico; 0.03 g de rojo Neutro; 0.001g de cristal Violeta; 13.5 g de agar; y un pH de 7.1 (+ - 0.2º a 25º)

Los materiales que se usan son el polvo para la preparación de

Agar McConkey, la pesa monoplano, el reloj de vidrio, la espátula, el matraz erlenmayer, agua destilada, la varilla de agitación, guantes de asbesto, el mechero, fósforos, una parrilla, algodón hidrófobo, y el uso de la autoclave.

La técnica que se sigue observa la lectura del envase del polvo de la preparación de Agar McConkey, de modo que haya por 1litro de preparación 500 gramos de polvo de preparación para después tratarlo en la autoclave durante 15 minutos a 121ºC; la colocación del reloj de vidrio sobre la pesa monoplano y se tara; el peso de 5gr de polvo de preparación; la introducción del polvo pesado en el matraz erlenmayer y la limpieza del reloj de vidrio con agua destilada que igualmente ha de verterse en el interior del matraz a fin de mayor exactitud preparativa; la conducción de la preparación a aforo de 100ml con agua destilada; el uso de guantes de asbesto; la colocación del matraz sobre la parrilla sobre el mechero prendido; y el batimiento de la mezcla con la varilla de agitación y sin dejar que burbujee la mezcla. Tras la preparación y retirada de la parrilla, se procede con algodón hidrófobo al entaponamiento del matraz, a la colocación de papel sobre la boca del matraz y a su ajuste por medio de un elástico. En el papel ha de reflejarse por escrito el tipo de medio de cultivo para luego conducirlo y depositarlo en la autoclave durante 45 minutos. Finalmente, y como es obvio se procederá a su retirada de la autoclave.

El agar nutriente

Es un medio con fines generales para la siembra y el crecimiento de la mayoría de los microorganismos poco exigentes. Su composición esta a base de 3 g de extracto de Carne de buey, 5 g de peptona trípsica de gelatina, 15 g de agar, y un pequeño montante de cloruro sódico y glucosa, y agua destilada hasta 1000 ml

El agar Levine

Es un medio que se utiliza para el aislamiento y la diferenciación

de los Escherichia coli y enterobacterias, fermentadores de lactosa y no fermentadores de lactosa, así como para la identificación expedita de los albicans. En su composición por litro tenemos 10 g de peptona pancreática, 10 g de lactosa, 2 g de fosfato Dipotásico, 15 g de agar, 15 g de eosina, 0.065 g de azul de metileno y un pH de 7.1 (+ - 0.2º a 25º).

El agar Chapman

Es un medio elegido para la decteccion de Staphylococcus patógenos en muestras de alimentos y otros materiales a través de la técnica de filtración por membrana. En su composición observamos extracto de carne de 1g, peptona trípsica de caseína de 5g, peptona de carne de 5g, cloruro sódico de 75g, D-manitol de 15g, rojo fenol de 25g y agar de 15g.

El agar Papa Dextrosa

Es un buen medio para cultivar y enumerar levaduras y mohos partiendo de alimentos y demás materiales. Así tenemos como muy ricos para el crecimiento de levaduras y mohos por su bajo rango de pH, los hidratos de carbono por ej. En cuanto a su composición observamos 15g de agar, 20 g de dextrosa y 4 g de infusión de patata.

El Agar Salmonella-Shigella

Es utilizado para el aislamiento de salmonelas y de Shigella de heces, de comestibles y de otros materiales. En su composición por litro se observa 5 g de peptona de casina y carne, 5 g de extrato de buey, 10 g de lactosa, 8.5 g de citrato de sodio, 8.5 g tiosulfato sodico, 1 g de citrato de hierro, 8.5 g de sales Biliares, 0.025 g de rojo neutro- 0.025g 15 g de agar y 0.3 mg de verde brillante.

El agar Sabouraud

Esgrimido en la localización y aislamiento de hongos en muestras por la técnica de filtración por membrana. Para que se de el crecimiento selectivo de hongos sobre bacterias en la muestra

tiene que darse una reacción ácida. En su composición por litro observamos 5 g de digestivo pancreático de caseína, 5 g de peptona tejido digestivo, 40 g de dextrosa y 15 g de agar.

El agar Sangre

Medio de cultivo con fines generales para una gran amenidad de microorganismos circunscribiendo los exigentes. Con el añadido de sangre, viene bien en el empleo de las reacciones hemolíticas. Este medio esta libre de azucares reductores. En su composición por litro se le observa 15 g de digestivo pancreático, 5 g de peptona de soja, 5 de cloruro sódico y 15 g de agar

El caldo Nutriente:

Es un medio muy generalista, asi es muy empleado para el crecimiento de microorganismos exigentes y no exigentes. Asmismo, anotamos como los Clostridios y anaerobios adquieren crecimiento igualmente en el momento que se incuban bajo condiciones de anaerobiosis. En su composición por litro se observa 17 g de digestivo pancreático de caseína, 3 g de digestivo papaico de harina de soja, 2.5 g de dextrosa, 5 g de cloruro sódico, y 2.5 g de fosfato Dipotásico.

El crecimiento de microorganismos en los distintos medios diferenciales

Observemos los casos del Staphylococcus aureus que crece en el agar Chapman, en el agar sabouraud y en el caldo nutriente, mientras que no lo hace en el agar sangre, agar nutriente, agar mcconkey, agar levine, agar papa dextrosa y agar salmonellashigella. La escherichia coli que crece en el agar sabouraud, agar sangre, caldo nutriente, agar nutriente, agar McConkey y agar levine, mientras que no crece en el agar Chapman, agar papa dextrosa y agar Salmonella-Shigella.

 

 

 

 

Autor:

Carlos Rojas Maragoto


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