Ensayos en laboratorio para el control de floraciones algales mediante ultrasonido

El mayor desarrollo de Cianobacterias generado por la eutroficación de ambientes acuáticos produce, además de afloramientos y compuestos con olores y sabores desagradables, liberación de metabolitos tóxicos. El desarrollo excesivo de algas también es problema para aguas que se pueden utilizar para consumo humano o procesos industriales, pero el tratamiento para su eliminación lleva a aumentos de los costos operativos. En este trabajo se analiza la utilización en laboratorio del ultrasonido como alternativa viable para controlar el desarrollo de algas, en particular de Cianobacterias. Los resultados obtenidos (utilizando una frecuencia de 20 kHz y una potencia de 9 W) muestran que los organismos pertenecientes a las Clases Chrysophyceae, Euglenophyceae y Chlorophyceae fueron eliminados a los 5 minutos de exposición, y Raphidiopsis mediterranea dentro de los primeros 10 minutos, en tanto que, luego de 60 minutos, la reducción fue del 98% para M. aeruginosa y del 99% para Dolichospermum spiroides.

Palabras clave: calidad de aguas; ultrasonido; microalgas

Introducción

La eutroficación se caracteriza por la disponibilidad excesiva de factores limitantes de la fotosíntesis (como la luz solar, el dióxido de carbono y nutrientes), que presenta consecuencias inmediatas como ser el excesivo desarrollo de plantas y algas (Schindler, 2006). La eutroficación es un proceso natural, que se produce muy lentamente (durante siglos) y que lleva al segado de los cuerpos lénticos (Carpenter, 1981). Sin embargo, las actividades humanas pueden acelerar la velocidad y grado de eutroficación, debido a que se han alterado los ciclos biogeoquímicos (Galloway et al., 1995; Vitousek et al., 1997a y b), por ejemplo duplicando la velocidad de ingreso de nitrógeno al ciclo terrestre del mismo (Vitousek et al., 1997a). Las descargas (directas o indirectas) de nutrientes limitantes en los ecosistemas acuáticos (eutroficación cultural), dan lugar a graves consecuencias para su utilización como fuentes de agua potable, la pesca y usos recreativos (Carpenter et al., 1998).

Las consecuencias conocidas de la eutroficación cultural incluyen las den- sas floraciones de algas que limitan la penetración de la luz, lo que reduce el crecimiento y causa la mortandad de plantas en zonas litorales a la vez que influye sobre la posibilidad de los depredadores para capturar a sus presas (Lehtiniemi et al., 2005). Debido a la eutroficación, se producen cambios en la composición y estructura del fitoplancton, que generalmente derivan en un mayor desarrollo de Cianobacterias. La presencia de estos organismos re- presenta un grave problema, ya que además de formar afloramientos y pro- ducir compuestos con olores y sabores desagradables, liberan metabolitos tóxicos (Izaguirre et al., 1982; Carmichael, 1992; Pitois et al., 2000). Por otra parte, las altas tasas de fotosíntesis pueden agotar el carbono inorgánico disuelto y elevar el pH durante el día, afectando las capacidades quimiosen- soriales de los organismos (Turner y Chislock, 2010). Al producirse la senescencia de las floraciones de cianobacterias, las mismas son descompuestas por microorganismos, lo que da lugar a la formación de una zona de hipoxia o anoxia. Estas «zonas de alta productividad» se encuentran en muchos cuerpos de agua dulce durante el verano (Arend et al., 2011; Díaz y Rosen- berg, 2008). Existe también evidencia de la existencia de un vínculo directo entre la eutroficación y las enfermedades asociadas con el agua (Smith y Schindler, 2009): por ejemplo, el aumento de nitrógeno y la disponibilidad de fósforo aumenta la tasa de replicación de los virus acuáticos (Wilson et al., 2006). Un estudio realizado en los eeuu estimó las pérdidas potenciales anuales debidas a la eutroficación (donde se incluyó el uso recreativo del agua, bienes raíces, recuperación de especies amenazadas y en peligro de extinción y gasto de tratamiento de aguas para consumo) en 2,2 109 dólares/ año (Dodds et al., 2009).

En las aguas para abastecimiento de la población, los problemas causa- dos por la proliferación de algas en el tratamiento varían en función de las especies presentes, por ejemplo las diatomeas, debido a la constitución silícea de su pared celular y que forman colonias de hasta 4000 &µm, provocan la obstrucción de los filtros, lo que requiere del lavado a contracorriente para su eliminación (Bauer et al., 1998; van den Hoek et al., 1995). La presencia de algas verdes aumenta los niveles de turbidez y clorofila a, lo que requiere una mayor demanda de coagulante. Las cianobacterias dan lugar a la liberación de materia orgánica algocénica en su entorno durante el ciclo de crecimiento, provocan aumento de la turbidez y clorofila a lo que da lugar a la demanda adicional de compuestos químicos (Henderson et al., 2008).

Otro problema asociado al desarrollo masivo de algas se presenta en las aguas de procesos industriales (en particular cuando se utilizan aguas "naturales"), sobre todo en las utilizadas en sistemas de enfriamiento. Las dificultades asociadas con el uso de dichas aguas generalmente derivan de los depósitos (que incluyen partículas, sales, productos de corrosión y biopelículas) que se acumulan en las superficies de los sistemas de circulación y de los equipos, en particular en intercambiadores de calor. La presencia de un depósito también provoca un aumento en la pérdida de presión a través del sistema de conducción de agua. En ambos casos el requerimiento de energía adicional se sumará a los costos de operación (Bott, 1998).

Tanto para aguas destinadas a consumo (Chemat et al., 2001; Guo et al., 2006; Gogate, 2007; Broekman et al., 2010; Matilainen y Sillanpaa, 2010; Doosti et al., 2012), aguas de desecho (Blume y Neis, 2004; Antoniadis et al., 2007; Maezawa et al., 2007; Naddeo et al., 2009; Drakopoulou et al., 2009), aguas de proceso (Peterson y Pitt, 2000; Bott, 2001; Bott y Tianqing, 2004; Benzinger et al., 2005), o en particular aguas con elevados contenidos de algas (Lee et al., 2002; Zhang et al., 2009; Heng et al., 2009; Koropoulis et al., 2009; Wu et al., 2012; Rajasekhar, et al., 2012; Yu et al., 2013; Rodri- guez-Molares et al., 2014) y cianotoxinas (Song et al., 2005; Ma et al., 2005; Song et al., 2006; Srisuksomwong et al., 2011; Claret et al, 2012) el tratamiento mediante ultrasonido se presenta como una metodología atrayente dentro de los métodos de oxidación avanzados (Mahvi, 2009) debido a las ventajas que presenta, a saber: obtención de condiciones extremas de temperaturas y presiones no alcanzables por métodos tradicionales (superiores a los 5000 K y 1000 atm. (Adewuyi, 2001) y el poder trabajar con soluciones coloreadas o conteniendo material en suspensión. La irradiación ultrasónica de soluciones acuosas da lugar a la formación, crecimiento y colapso de burbujas en el líquido. Este fenómeno (cavitación) favorece la actividad química (Suslick, 1990) debido a la formación de radicales hidroxilo, altamente reactivos (Gonzalez-Labrada et al., 2010).

La gran mayoría de los promisorios ensayos acerca de la aplicación del ultrasonido para el control de algas fueron efectuados en laboratorio, con cultivos puros. En la Tabla 1 se presentan resultados de la revisión bibliográfica realizada. La misma no pretende ser exhaustiva sino reflejar el amplio campo de condiciones (frecuencias y potencias) empleado en los estudios, los variados resultados obtenidos en los mismos, así como el hecho de que la mayoría de los ensayos fueron realizados con cultivos puros (especialmente Microcystis aeruginosa) y los escasos empleos sobre comunidades naturales.

La aplicación del ultrasonido podría dar lugar a la liberación de microcistinas al medio, aumentando con ello su toxicidad. Al respecto, Zhang et al. (2006a y b) recomiendan utilizar para el tratamiento de aguas destinadas a consumo, potencias iguales o inferiores a 48 W, dado que mostraron que una potencia de 80 W aumenta la concentración de microcistinas disueltas. También demostraron que las diferentes frecuencias tienen poco impacto sobre la liberación de dichas toxinas. Rajasekhar et al. (2012a y b) encontraron, para diferentes potencias, un aumento de las concentraciones de microcistinas disueltas en los primeros 5 minutos de aplicación del ultrasonido, pero dichas concentraciones disminuyen si se continúa con el tratamiento. Exista o no aumento en la liberación de toxinas, gran cantidad de trabajos señalan la efectividad del ultrasonido para la degradación de dichos compuestos (Ma et al., 2005; Song et al., 2005; Song et al., 2006; Hudder et al, 2007; Srisuksomwong et al., 2011; Wu et al., 2011; Shi et al., 2012; Claret et al., 2012).

Objetivo

La mayoría de los trabajos encontrados en la bibliografía fueron realizados con cultivos puros de algas. Es bien conocido que las características de algu- nas algas (especialmente M. aeruginosa) cultivadas en condiciones de laboratorio difieren de las que se encuentran en condiciones naturales (Yu et al., 2013), lo cual puede jugar un papel crítico al utilizar un proceso para el trata- miento de aguas. El objetivo del presente trabajo fue estudiar en laboratorio el efecto de la irradiación ultrasónica sobre una comunidad fitoplanctónica natural compuesta principalmente por cianobacterias, con el propósito de aportar nueva información al amplio abanico de resultados existentes y evaluar la posibilidad de utilizar esta técnica para su control.

Tabla 1. Aplicación de ultrasonido para el control de algas

Materiales y métodos

Las muestras de fitoplancton se extrajeron del lago Pedro Antonio Francisco Candiotti, un lago urbano eutrófico situado en la zona céntrica de la ciudad de Santa Fe sobre el cual ya se habían efectuado estudios previos (Kieffer, 2000; Kieffer et al., 2000a y b) y donde se había detectado la floración de cianobac- terias como un problema grave. El lago está enclavado en el Parque del Sur, el cual forma parte del circuito turístico obligado dado que se encuentra den- tro del casco fundacional (donde se destacan edificios aislados de distintas épocas de construcción: Templo y Convento de San Francisco, Museo Etno- gráfico, Museo Histórico Provincial, Casa de Gobierno), sitio profusamente utilizado como lugar de esparcimiento por la ciudadanía santafesina. Los pro- blemas ambientales del lago comienzan a registrarse a partir de 1975, lo que da lugar a que en 1985 fuera clausurado como balneario (como consecuencia del desarrollo masivo de algas y de los elevados contenidos en bacterias) por el perjuicio que podría tener para la salud de los bañistas. Este lago es en realidad un cuerpo de agua somero (profundidad máxima, 5,25 m) con una longitud máxima (ne-so) de 800 m y una superficie de aproximadamente 11 Ha. y originalmente era un brazo del riacho Santa Fe.

Las muestras de agua fueron extraídas a fines de agosto de 2011 en el ex- tremo SO del lago (31° 39' 54,27" S – 60° 42' 48,66" O; cercano al vertedero que el mismo posee), utilizando para ello una botella tipo Van Dorn vertical de 3 litros de capacidad. Una vez extraídas, las aguas fueron colocadas en bo- tellas de vidrio actínico y mantenidas en hielo hasta su ingreso al laboratorio, donde se procesaron el mismo día. En campo se realizaron mediciones in situ utilizando un equipo multiparamétrico Horiba U10 (Tabla 2).

Tabla 2. Características fisicoquímicas del agua, medidas en el sitio de muestreo

Nota: mS = mili Siemens; UNT = unidades nefelométricas de turbiedad.

Para el tratamiento mediante ultrasonido se utilizó un equipo mse provis- to de un cabezal de 13 mm de diámetro, operando a una frecuencia de 20 kHz, sumergido en el líquido 2,0 cm. La potencia entregada por el equipo fue determinada mediante calorimetría (Thompson y Doraiswamy, 1999) en ex- periencias efectuadas por triplicado, dando una potencia efectiva de 9 Watt. Se utilizó un reactor de vidrio de 250 ml de capacidad, provisto de camisa de refrigeración por la que se circuló agua para regular la temperatura de opera- ción en 25°C ± 1°C.

Los ensayos (tanto para analizar el decaimiento de las algas, como la de- gradación de clorofila a) se hicieron por triplicado, sobre un volumen de 230 ml. Para las algas se extrajeron muestras de 5 ml a los 0, 5, 10, 20, 30, 45 y 60 minutos de tratamiento, fijándolas con lugol acético y efectuando los recuen- tos con microscopio invertido (Utermöhl, 1958). Para clorofila a también se tomaron muestras de 5 ml a los mismos tiempos (excepto a los 45 minutos), realizando las determinaciones mediante extracto acetónico con espectrofo- tómetro (método 10200 h, apha, awwa, wpcf, 1992).

Dado que se efectuaron tres ensayos (tanto para las algas como para clo- rofila a), se analizó si entre las mismas existían diferencias significativas me- diante análisis de la varianza (andeva) (Winer, 1971). Con el fin de ajustar la cinética de degradación a los datos obtenidos, se utilizó el programa Table- Curve 2D versión 5.01 (systat, 2002).

Resultados y discusión

La composición taxonómica de la comunidad fitoplanctónica estudiada fue la siguiente:

Cyanobacteriaphyceae

En la Tabla 3 se presentan los resultados de la aplicación del ultrasonido a las muestras de aguas conteniendo las especies antes mencionadas. Bajo condiciones naturales las células de M. aeruginosa se agregan secretando material intracelular, formando colonias amorfas (Yu et al., 2013) y esta agre- gación favorece su supervivencia ante predadores (Yang et al., 2008). Los cultivos en laboratorio tienen mayor número de células aisladas que agrupadas y menor cantidad de material extracelular segregado, lo que favorece su destrucción (Zhang y Yu, 2007; Yang et al., 2008). Al aplicar ultrasonido de bajas frecuencias predominan los efectos mecánicos/físicos (altas fuerzas de corte) sobre los efectos químicos (producción de radicales) y estos últimos crecen al aumentar las frecuencias (Mason et al., 2011). Wu et al. (2012) uti- lizan este hecho para explicar el mayor poder de inactivación de las células de cianobacterias por las bajas frecuencias (20 kHz) frente a las frecuencias medias (580 kHz) y altas (1146 kHz). Los mismos autores indican que se ob- serva un efecto de desagregación de las colonias utilizando la frecuencia de 1146 kHz (aunque no indican tiempos de desaparición de los agregados). Los datos de la Tabla 3 muestran que la frecuencia utilizada en este trabajo (20 kHz) también da lugar a la desagregación de las células en las tres especies, variando el tiempo desde menos de 5 minutos para D. spiroides y R. medite- rranea a 45 minutos para M. aeruginosa.

Tabla 3. Disminución de las concentraciones de algas en
función del tiempo por aplicación de ultrasonido

En la Tabla 4 se presentan los resultados del andeva. Puede observarse que no existen diferencias estadísticamente significativas entre los tres ensa- yos (tanto para las algas como para clorofila a), por lo que pueden utilizarse sus valores promediados con el fin de analizar la cinética de la disminución de las concentraciones por aplicación de ultrasonido.

Tabla 4. ANDEVA de los datos crudos

Nota: S.C.: suma de cuadrados; g.l.: grados de libertad; C.M.: cuadrado medio; F: estadístico de Sne- decor; p: probabilidad.

En la Figura 1 se presenta la disminución en el número de individuos/ml de toda la comunidad fitoplanctónica, mientras que en la Figura 2 se grafica el decaimiento en la concentración de clorofila a. No se presentan gráficas de abatimiento de las Clases Chrysophyceae, Euglenophyceae y Chlorophy- ceae dado que dichos organismos fueron eliminados dentro de los 5 minutos de exposición. Por otra parte, las Bacillariophyceae persistieron durante toda la experiencia, posiblemente debido a la protección que le brindaron sus frústulos silíceos.

Figura 1. Decaimiento del fitoplancton total (valores de la ordenada en logaritmos naturales del número de individuos por mililitro)

Figura 2. Decaimiento de la concentración de clorofila a en función del tiempo

De acuerdo a Rajasekhar (2012b), si se deseara utilizar el ultrasonido para el control de cianobacterias en aguas (cualquiera fuera su uso), deberían analizarse los parámetros ideales (frecuencia, potencia, pH, temperatura, sa- linidad, etc) es decir, aquellos que causen la sedimentación de las células (por colapso de las vacuolas de gas), daño a las membranas celulares (pero no lisis, para evitar liberación de compuestos intracelulares) o inhibición de pigmentos (con afectación del crecimiento). Las vacuolas de gas proveen de flotación a las cianobacterias ayudándolas a regular su posición en la colum- na de agua y con ello su exposición a la luz, un parámetro importante para su crecimiento (Rajasekhar et al., 2012a y b). Algunos autores (Zhang et al., 2009; Heng et al., 2009) señalan que con tiempos de sonicación sumamente cortos (inferiores a 30 segundos) se logra un alto porcentaje de remoción por coagulación de las algas, por lo que sería preferible la aplicación de exposi- ciones cortas repetidas, antes que prolongadas (Tang et al., 2004). Estos cor- tos tiempos de aplicación se explican a partir de los tiempos necesarios para la creación e implosión de burbujas debido a la aplicación del ultrasonido, los que pueden calcularse mediante (Zhang et al., 2009):

El gas en las vacuolas actuaría como núcleo de cavitación lo que daría lugar al crecimiento y colapso de las vacuolas en tiempos inferio- res al segundo, por lo que aplicaciones continuas o por tiempos prolongados del ultrasonido sólo aumentaría la posibilidad de lisis celular y con ello la liberación de sustancias (entre ellas las cianotoxinas). Sin embargo, la rotura de las vacuolas no produce la muerte de las células, dado que las mismas pueden regenerarse (Wu et al., 2012) bajo condiciones adecuadas de ilumina- ción (Rajasekhar, 2012 b), por lo que la aplicación de esta metodología sería efectiva en sitios donde la profundidad de la columna de agua fuera superior a la de la zona fótica.

Otra ruta posible de inactivación de las algas es el daño que produce la aplicación del ultrasonido sobre la clorofila a, reduciendo la capacidad foto- sintética y con ello la posibilidad de sobrevivencia. Al respecto todos los tra- bajos muestran altas reducciones en las concentraciones de clorofila a al apli- car ultrasonido a diferentes frecuencias y potencias (Ahn et al., 2003; Zhang et al., 2006a y b; Zhang et al., 2009; Wu et al., 2012); sin embargo existen diferencias al comparar las velocidades de degradación de dicho pigmento con la de inactivación de las algas (Rajasekhar et al., 2012b), aun cuando las cinéticas obtenidas para ambos procesos son de primer orden (Zhang et al., 2006a; Wu et al., 2011).

Utilizando los valores medios de las densidades (individuos/ml) y de con- centraciones de clorofila a (mg/m3), se ajustaron cinéticas de primer orden, mediante el software TableCurve 2D (Tabla 5). En los cinco casos se observa que los ajustes son muy buenos, dado que el porcentaje de la varianza no explicada es inferior al 2,5% para el caso de las algas y menor al 9% para clorofila a. Por otra parte, también en dicha tabla puede observarse la efecti- vidad del tratamiento mediante ultrasonido para el control de las floraciones de cianobacterias, dado que los tiempos de vida medio son inferiores a los 3 minutos.

Tabla 5. Decaimiento exponencial

Nota: a = ordenada en el origen; k = constante de decaimiento exponencial; R2 = coeficiente de corre- lación al cuadrado; F = estadístico de Snedecor y T = tiempo de vida medio.

La velocidad de degradación de clorofila a mostró ser inferior a la velocidad de inactivación de las algas, hecho también señalado por Zhang et al. (2006b) y por Nakano et al. (2001) aunque contrario a lo encontrado por Purcell (2009

– citado en Rajasekhar et al., 2012 b).

La seguridad de la aplicación de ultrasonido de alta frecuencia (> 0,5 MHz) para diagnóstico médico está garantizada por diversas normas de seguridad, por ejemplo las emitidas por la International Electrotechnical Commission (Ahmadi et al., 2012). Sin embargo, no existen normas equivalentes para las aplicaciones de bajas frecuencias (< 500 kHz) como son las utilizadas en in- tervenciones dentales o quirúrgicas (O"Daily et al., 2008; Alves Pereira et al., 2010). Los límites de seguridad, se basan en dos índices: el térmico y el me- cánico (National Institute of Health, 2000). En el caso de que no exista con- tacto directo con el transductor de ultrasonido, el segundo índice es el más importante dado que tiene en cuenta los posibles efectos biológicos debido a la cavitación y en su definición original es igual al cociente entre la máxima presión negativa sufrida por la burbuja y la raíz cuadrada de la frecuencia. En aplicaciones de diagnóstico (altas frecuencias) dicho índice tiene un umbral de 0,7, valor por debajo del cual no existiría riesgo. Para el rango de bajas frecuencias existen discrepancias respecto a la definición del índice mecáni- co (Ahmadi et al., 2012), por lo que aún no existe un único valor umbral para su utilización segura. La nato (2006) en sus normas y procedimientos para riesgos para buceo humano y mamíferos marinos, fija valores máximos de presión acústica para buceadores militares: para frecuencias entre 4 y 25 kHz y a una distancia de 10 m el mismo es de 167 dB (valor del orden al utilizado en nuestro trabajo). Este último dato, unido a la incertidumbre respecto al ín- dice mecánico, muestra la necesidad de mayores estudios sobre los posibles efectos del ultrasonido de baja frecuencia sobre las comunidades naturales.

Conclusiones

La irradiación ultrasónica produjo notorios cambios en la comunidad fitoplanc- tónica natural:

• Los organismos pertenecientes a las Clases Chrysophyceae, Eugle- nophyceae y Chlorophyceae fueron eliminados a los 5 minutos de exposición. Las Bacillariophyceae persistieron durante toda la experiencia, posiblemente debido a la protección brindada por sus frústulos silíceos.

• Las colonias y tricomas de las especies de Cianobacterias estudiadas fueron reducidas a células aisladas dentro de los primeros 5 minutos. Solo persistieron algunas colonias de Microcystis aeruginosa que fueron reducién- dose en tamaño y cantidad de células a medida que aumentaba el tiempo de exposición. Al cabo de 10 minutos de tratamiento con ultrasonido, Raphidiop- sis mediterranea estuvo ausente. Al cabo de 60 minutos, la reducción fue del 98% para Microcystis aeruginosa y del 99% para Dolichospermum spiroides.

• Los tiempos de vida medio para las cianobacterias fueron inferiores a los 3 minutos.

• El aumento en el número de células aisladas de cianobacterias en los primeros tiempos de sonicación podría ser contraproducente para la disminución del desarrollo de estas algas si no se continúa con el tratamiento ultrasó- nico durante el tiempo adecuado, ya que las células aisladas de Microcystis aeruginosa pueden actuar como propágulos, incluso luego de permanecer largo tiempo depositadas en el sedimento de un sistema acuático.

• Los cambios en la densidad del fitoplancton y la disminución en la con- centración de clorofila a permiten concluir que bajo las condiciones de trata- miento utilizadas en este estudio (20 kHz y 0,036 W/ml), la irradiación ultrasó- nica disminuyó de manera significativa los niveles de cianobacterias luego de 60 minutos de aplicación de ultrasonido.

• Las condiciones aplicadas en este estudio pueden compararse con las utilizadas por Wu (2011) (20 kHZ – 0,0403 W/cm3) y Rajasekhar et al. (2012) (20 kHz – 0,043 W/ml), si bien en ambos casos las potencias empleadas fueron algo mayores. El porcentaje de degradación logrado en nuestro estu- dio fue superior a ambos, teniendo en cuenta que en los trabajos citados se utilizaron cultivos puros de Microcystis aeruginosa, mientras que para este trabajo se usó dicha especie formando parte de una comunidad natural.

• Si bien en las condiciones de este trabajo se muestra la efectividad del ultrasonido para controlar floraciones de cianobacterias, son necesarios ma- yores estudios sobre los efectos en el resto de los integrantes de las comuni- dades acuáticas.

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