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Aseguramiento de la Calidad en las Colecciones de Cultivos Microbianos (página 2)




Enviado por Nivian Montes de Oca



Partes: 1, 2

2.1. Las
colecciones de cultivos microbianos

Los microorganismos son los seres vivos más
antiguos del planeta, se encuentran prácticamente en cada
nicho sobre la tierra mostrando una gran diversidad
morfológica, ecológica, fisiológica y
molecular. Sin la actividad microbiológica, sería
imposible la vida en la tierra, pues la diversidad de los
microorganismos juega un papel clave en el mantenimiento de la
biosfera y proporciona un vasto e inexplorado recurso para la
humanidad. Su número total se desconoce y los estudios in
situ son muy difíciles (Stackebrandt, 1994).

El uso de los microorganismos ha sido clave en el
enfrentamiento y solución de los graves problemas de la
humanidad en la agricultura y la alimentación de los
pueblos, en la salud animal y humana, en la búsqueda de
nuevas fuentes de energía y en la conservación del
medio ambiente (Llop, et al.; 1998). Ellos son la fuente del
material básico para el desarrollo de medicamentos
farmacéuticos, agentes agroquímicos y biocontroles,
cosméticos y productos industriales (ten Kate,
1995).

Los microorganismos que son aislados desde su ambiente
natural son típicamente conservados en colecciones de
cultivos. El número así mantenidos son la base del
conocimiento actual de la diversidad microbiana y
constituirán el material de trabajo para estudios futuros.
Ellos son un inestimable recurso genético, que forman una
pequeña parte dentro del inmenso número de
microorganismos que no están descritos en la
actualidad.

Los objetivos del trabajo científico con
microorganismos pueden ser variados, y pueden incluir
investigaciones medioambientales, taxonómicas, de la
agricultura y biomédicas, así como la
búsqueda de nuevos productos que puedan tener valor
comercial.

La conservación ex situ de todos los
microorganismos aislados, estudiados y reportados en la
literatura científica, es fundamental para el progreso de
la ciencia. La ambigüedad asociada al reaislamiento subraya
la necesidad de hacer depósitos de microorganismos en una
colección de cultivos, que proporcione servicio de
conservación experimentada, rápido acceso y la
provisión de una cepa de referencia única y
conservada. Sin esto, los científicos necesitarían
llevar a cabo constantemente el costoso proceso de
caracterización e identificación al inicio de cada
nuevo estudio.

La inclusión de los microorganismos en la
Convención de Diversidad Biológica (CDB) reconoce
el papel fundamental que juega la diversidad microbiana. A pesar
de esto hay muchos artículos de la convención que
han creado polémica entre los microbiológos, y esto
ha motivado el desarrollo de algunos artículos
científicos con la intención de favorecer la
interpretación y así el cumplimiento de los
objetivos de la CDB. En este sentido, en septiembre de 1996, la
WFCC publicó un documento informativo dirigido a los
gobiernos, los cuerpos legales de los diferentes países y
los microbiólogos, sobre temas relacionados al acceso a
los recursos genéticos microbiológicos ex situ
tratado en la CDB. Smith, en el 2000, propuso una pequeña
guía que contiene los requisitos mínimos que deben
tenerse en cuenta por las colecciones con el objetivo de
determinar las acciones necesarias para cumplir con la
Convención. En este mismo artículo el autor plantea
que existe un grupo de problemas que aún no
están resueltos y que afectan el cumplimiento de la CDB,
relacionados con los derechos de la propiedad intelectual; la
necesitad de establecer un enfoque claro, sencillo, y flexible;
los procedimientos de seguimiento y ejecución; y
otros.

Las colecciones de cultivos tienen la tarea de custodiar
los recursos genéticos ex situ, constituyendo el mecanismo
por el cual se asegura la diversidad microbiana, pues juegan un
papel clave en la conservación de recursos
genéticamente estables (Kirsop and Hawksworth,
1994). De esta manera se puede disponer de recursos
microbianos mantenidos y preservados según los intereses
de la comunidad científica.

Las colecciones de cultivos microbianos tienen funciones
básicas como son: la conservación ex situ de
organismos, custodiar recursos nacionales, suministro de recursos
viables como base para el desarrollo de la ciencia, recibir
depósitos sujetos a publicación y ofrecer servicios
de depósito seguros y confidenciales (Smith, 2000).
Además, pueden prestar servicios de identificación,
de referencia taxonómica, de información y
consultas profesionales, de entrenamientos e instrucción y
apoyo especializado en innumerables áreas, realizar
programas de investigación y establecer bases de datos y
redes de información (Kirsop, 1991).

A pesar de la importancia de las colecciones de cultivos
microbianos, muchas de ellas están en peligro por la
ausencia de fuentes de financiamiento y un inadecuado apoyo
científico-técnico (Yamasato, 1992). Estos aspectos
fueron analizados durante el 7mo Congreso de colecciones de
cultivos microbianos y de ellos se derivaron algunos acuerdos
referidos al apoyo financiero necesario para el logro de los
objetivos allí planteados. Además, en el 8vo
Congreso se reflejó la necesidad de un compromiso a largo
plazo con los gobiernos para apoyar la conservación de
toda la biodiversidad microbiana y lograr el progreso
científico y la inclusión de este tema en el
desarrollo de las políticas ambientales, con el objetivo
de poder implementar los principales objetivos de la
CDB.

2.2 Historia y
Actualidad

El surgimiento de los medios de cultivos sólidos
para el crecimiento de los microorganismos, y el éxito de
los primeros aislamientos de cultivos puros, marcaron la
necesidad de preservarlos para el futuro. La primera
colección de cultivos microbianos se estableció en
1880 en Praga, Viena, por Frántisek Král,
quién tuvo una visión de la importancia que las
colecciones de cultivos tendrían para el desarrollo de la
ciencia. Se conoce que en este período también se
establecieron otras colecciones de cultivos en los principales
institutos de París, Berlín, Londres y
Japón, pero la información al respecto es escasa.
En 1890 Král publicó el primer catálogo de
cultivos microbianos, y esta colección se mantuvo durante
21 años. Actualmente algunos de los materiales que
formaron parte de ella se conservan en el museo de Historia
Natural de Viena.

Según Porter, 1976, la otra colección
más antigua fue creada en 1906 por la Asociación
Internacional de Botánicos, en Baarn, Holanda. En 1919, se
estableció la colección del Commonwealth
Mycological Institute del Reino Unido, y en 1925 la de Estados
Unidos (Amarican Type Culture Collection (ATCC)).
Estas colecciones son internacionalmente reconocidas y mantienen
millones de cepas microbianas, algunas de ellas patentadas para
procesos biotecnológicos.

El número de colecciones de cultivos se ha
incrementado y actualmente existen 469 colecciones en 61
países registrados en el Centro de Datos Mundial de
Microorganismos (WDCM). Estas pueden ser estatales,
semi-gubernamentales, sustentadas por universidades o industrias,
o privadas; y pueden especializarse en las ramas:
agrícola, forestal, marina, médica, veterinaria,
industrial y otros (WDCM, 2002). Sin embargo existen muchas otras
colecciones establecidas y que no están registradas en la
WDCM.

El establecimiento de organizaciones mundiales,
regionales y nacionales ha favorecido la interacción y
colaboración entre las colecciones (Malik, 1992,
Hawksworth y Aguirre-Hudson, 1994). La máxima
organización que representa las colecciones de cultivos es
la Federación Mundial de Colecciones de Cultivos (WFCC),
fundada en 1963. Esta es una federación de la Unión
Internacional de Sociedades Microbiológicas (IUMS) y una
comisión de la Unión Internacional de Ciencias
Biológicas (IUBS), y tiene la responsabilidad de promover
y propiciar el desarrollo de las colecciones de cultivos de
microorganismos y cultivos de células (Kirsop, 1990). En
Cuba, a fines de la década del 70 y principio de la
década del 80, la entonces Academia de Ciencia de Cuba
(ACC), decidió comenzar la organización del Cepario
Nacional para localizar e inventariar las colecciones de
interés sanitario, agrícola e industrial existentes
en el país. En 1987 se hizo otro intento, y en esta
ocasión se determinó que la ACC debería ser
el centro coordinador nacional sobre colecciones de
microorganismos, células, plásmidos, genes e
hibridomas, y se trazaron varios objetivos de trabajo. En esta
ocasión no todos los centros involucrados colaboraron con
esta actividad y por tanto se dieron pasos lentos. Es en 1992 que
se presenta y aprueba en el Frente Biológico un
Anteproyecto de Reglamento para las colecciones de cultivos
cubanas, donde se regulan las funciones fundamentales de las
colecciones cubanas: a) Preservar y mantener controladamente los
patrones fenotípicos y genotípicos que
caracterizaron el material inicial con un valor de referencia y
b) Garantizar que la función biológica generada o
rescatada en el transcurso de la manipulación original o
posterior pueda mantenerse indefinidamente. Además, se
define, entre otros aspectos, que la colección cubana
será descentralizada, de acuerdo con las pautas trazadas
por la WFCC.

En 1995 surgió el Grupo Nacional de Colecciones
de Cultivos para estimular el desarrollo y organización
nacional de las colecciones de microorganismos y otros materiales
biológicos en el país. El grupo cuenta con un
Comité Gestor y representantes de más de 37
instituciones del país, se trazan objetivos a corto y
largo plazo, se realizan reuniones trimestrales y cada año
se desarrolla al menos una actividad de superación para
los miembros.

En 1998, como propuesta del Grupo Nacional, se
inició el proyecto "Centro de Información para
Colecciones Cubanas de Cultivos Microbianos", a través del
cual se creó la base de datos de las Colecciones de
Cultivos de Cuba. Otro de los objetivos del Grupo fue lograr su
oficialización, meta alcanzada en el
año 2002 después de muchos intentos infructuosos.
Actualmente el Grupo Nacional de Colecciones de Cultivos de Cuba
constituye una Sección de trabajo dentro de la
Asociación de Técnicos y Azucareros de Cuba (ATAC),
sociedad no gubernamental con gran reconocimiento nacional e
internacional y la más antigua del país.

2.3-
Establecimiento y Operación de las colecciones de cultivos
microbianos

En la última década se ha visto un
incremento en la apreciación del valor de las colecciones
de cultivos de microorganismos tanto para la conservación
de recursos genéticos y la biodiversidad, como para
proveer la fuente esencial para el desarrollo
biotecnológico mundial. Por estas razones muchos
países han apoyado el establecimiento de colecciones de
cultivos que brinden servicios en su país o en la
región y que desarrollen sus propios programas de
investigación.

A pesar de existir diversas publicaciones que
proponían técnicas y procedimientos; de que algunos
países habían publicado guías nacionales y
regionales; internacionalmente no existía ningún
documento que brindara los aspectos mínimos que
debían regir el trabajo de las colecciones de cultivos.
Para dar solución a esta situación la WFCC
desarrolló, en 1990, los Lineamientos para el
Establecimiento y Operación de las Colecciones de Cultivos
Microbianos, cuyos principios pueden ser aplicados a cualquier
colección de cultivos independientemente de su
tamaño y su poder adquisitivo.

Este documento describe los propósitos de las
colecciones de cultivos; los servicios que éstas pueden
brindar a la comunidad científica en cuanto a recursos,
información y personal especializado; la necesidad de
contar con instalaciones apropiadas, la cantidad de personal
adecuado y de alto nivel profesional, que garanticen el apoyo
necesario a largo plazo para brindar estos servicios; las
contribuciones hechas por las colecciones a la investigaciones
básicas sobre estudios taxonómicos, procedimientos
de preservación, cultivo y manipulación de
microorganismos; la capacidad de las colecciones de conocer todas
las regulaciones de control, transportación y seguridad
durante la distribución y manipulación de los
recursos genéticos; la necesidad de brindar apoyo y
entrenamiento a otras colecciones; y la necesidad de la
colaboración internacional para incrementar el valor y
calidad de los recursos biológicos (WFCC,
1999). Por la importancia que representa este documento
para el establecimiento y operación de las colecciones de
cultivos microbianos, a continuación hacemos un resumen de
los principales aspectos que se deben tener en cuenta para el
cumplimiento de esta guía internacional.

2.3.1 Organización

La organización de la cual forma parte la
colección de cultivos debe aceptar y estar completamente
consciente de las responsabilidades inherentes al mantenimiento
de una colección de cultivos. El compromiso de mantener la
colección y sus servicios (según proceda) a largo
plazo debe estar incluido en los planes estratégicos o en
los objetivos de la organización (WFCC, 1999).

2.3.2 Financiamiento

La administración y el financiamiento de las
colecciones de cultivos requieren de un compromiso a largo plazo
por parte de la organización de la cual forma parte la
colección de cultivos. El apoyo solo a corto plazo es
inapropiado para las colecciones de servicios que proveen
servicios de suministro y almacenamiento por largos
períodos de tiempo como parte de la infraestructura que
sustenta las ciencias biológicas. Es importante considerar
el nivel de financiamiento actual y futuro, lo cual puede ser
adecuado para brindar todos los servicios planificados incluyendo
algunos clientes que soliciten el servicio fuera de lo
planificado. Si los recursos son limitados, es preferible
limitarse al cumplimiento de los objetivos primarios de la
colección (WFCC, 1999).

2.3.3 Objetivos

Las colecciones requieren de una declaración
general y concreta de sus objetivos a largo plazo de acuerdo con
su capacidad de respuesta y considerando los servicios externos
que potencialmente pueden brindar. Además, puede ser
favorable para una colección de cultivos tener objetivos
específicos a corto plazo considerando períodos de
un año, tres o cinco años. Estos pueden incluir el
número y grupo de cepas que se ha planificado adquirir en
ese período, y el cronograma para la instalación de
nuevas habitaciones o equipos. Donde sea factible se debe
declarar una misión en concordancia con los objetivos de
la colección (WFCC, 1999).

2.3.4 Recursos biológicos (valores habidos de la
colección)

La extensión del material y número de
cepas que se tendrán requiere una cuidadosa
estimación y conciliación con la
organización de la cual forma parte la colección,
teniendo en cuenta los recursos financieros disponibles.
Además, es necesario tener claramente definida una
política de entrada para la aceptación de nuevas
cepas en la colección. Si esto no está definido y
se aceptan muchas cepas que no han sido solicitadas sin tener en
consideración los objetivos fundamentales de la
colección, se pueden ver afectados la capacidad de
almacenamiento, el personal y los recursos financieros de la
colección. Se debe adoptar una política que
balancee la capacidad de la colección con respecto a las
necesidades de la ciencia (WFCC, 1999).

Las cepas mantenidas que son potencialmente
patógenas al hombre, animales o plantas, o producen
compuestos tóxicos o alucinógenos, deben estar
claramente identificadas y mantenidas en condiciones de
seguridad. Es obligatorio el cumplimiento de las regulaciones de
control y seguridad; institucionales, nacionales o
internacionales (Smith, 2000; WFCC, 1999).

Las colecciones pueden variar sustancialmente la
extensión de los grupos de microorganismos mantenidos por
varias razones, entre ellas, por orientación de sus
clientes; por tanto esto debe considerarse en las etapas
iniciales de planificación de los recursos (WFCC,
1999).

Es económicamente prudente contar con cepas que
no están disponibles en otras colecciones de cultivos.
Para muchas colecciones es importante contar con cepas de
referencia internacionalmente reconocidas, sin embargo, la WFCC
aspira a disminuir la tendencia que existe de
mantener material duplicado en muchas colecciones, pues esto
representa un gasto innecesario de los escasos recursos
disponibles. Siempre que sea factible, las nuevas colecciones de
microorganismos deben reflejar la diversidad de recursos
genéticos microbianos más que duplicar los que ya
existen. Sin embargo en muchos países el costo del
transporte marítimo de las cepas desde otras colecciones
está prohibido y entonces se hace necesario la
duplicación de algún material. La comunidad de
colecciones de cultivos tiene una historia en la
distribución de cepas de importancia científica y
la WFCC espera que esta cultura se mantenga por el bien la
ciencia (WFCC, 1999).

2.3.5 Personal

Las colecciones de cultivos tienen una labor intensiva y
esto incluye la preservación, mantenimiento,
documentación y los chequeos de viabilidad de rutina. Es
necesario contar con la cantidad de personal suficiente no solo
para la incorporación de nuevos cultivos y su
mantenimiento, sino también para cumplir el nivel
suministros de cultivos y otros servicios que brinda la
colección. La conservación y mantenimiento
efectivos en una colección de cultivos es fundamental y
esto requiere de conocimientos de los organismos, su crecimiento
y requisitos de preservación, propiedades y aplicaciones
potenciales. El personal clave debe estar altamente calificado y
tener experiencia directa o entrenamiento especializado en el
manejo de una colección de cultivos. La designación
de especialistas en identificación y autenticación
de todos los grupos de microorganismos mantenidos y con algunas
habilidades sobre taxonomía, es esencial para el control
de la calidad de la colección de cultivos. Cuando se
requiera apoyo adicional con especialistas en taxonomía se
deben establecer vínculos de colaboración (WFCC,
1999).

2.3.6 Preservación

Los microorganismos a menudo requieren de métodos
de preservación especiales para asegurar su óptima
viabilidad, almacenamiento, pureza y estabilidad. Para mayor
seguridad y para minimizar la probabilidad de pérdida de
cepas, cada cepa debe ser mantenida al menos por dos
procedimientos diferentes, siempre que sea factible. Como
mínimo uno de ellos debe ser la liofilización o la
criopreservación (almacenamiento en nitrógeno
líquido), pues estos son los mejores métodos para
la minimización de los riesgos de cambios genéticos
para la mayoría de las cepas. En algunos casos
(líneas celulares) donde solo es aplicable la
congelación, debe conservarse el material duplicado en
refrigeradores separados con diferente alimentación
eléctrica o en contenedores de nitrógeno
líquido separados (WFCC, 1999).

Para muchos grupos de microorganismos existe adecuada
experiencia sobre los métodos óptimos de
preservación, sin embargo esto no es así para todos
los microorganismos, y generalmente en estos casos es necesario
desarrollar investigaciones para determinar el protocolo de
preservación óptima. Para minimizar los riesgos de
importantes cambios genéticos producto de condiciones
adversas, como pueden ser: fuego, inundaciones, terremotos,
guerras u otras catástrofes, las colecciones
deben tener réplicas de las cepas más importantes y
su adecuada documentación en lugares separados (WFCC,
1999).

2.3.7 Procedimiento para el depósito y
autenticación del cultivo

Los científicos obtienen el material de
investigación de colecciones de cultivos reconocidas pues
en ellas este material está sometido a control de la
calidad y pruebas de autenticación como parte de los
procedimientos rutinarios de la colecciones. El uso incorrecto de
organismos en investigaciones implica una pérdida de
tiempo, de recursos y conlleva a la invalidación de los
resultados publicados. Además, sin la adecuada
autenticación los organismos nocivos podrían
suministrarse inadvertidamente. Esto genera una gran
responsabilidad sobre las colecciones y demanda la
atención desde el momento en que se recibe el cultivo para
su preservación. (WFCC, 1999).

Como parte de los procedimientos para el
depósito, las colecciones deben brindar registros de
entrada para ser llenados por los clientes o depositores (persona
que deposita una cepa en la colección). El registro debe
incluir toda la información relativa a la cepa y su origen
(país de origen, nombre del que hizo el aislamiento,
fecha/hora/localización geográfica del aislamiento,
identificación taxonómica (si se conoce),
propiedades fenotípicas y genotípicas, referencias
bibliográficas, y restricciones de distribución
conocidas). Esta información es importante para brindar la
mayor cantidad de datos científicos a los futuros
usuarios, y además, para cumplir con los acuerdos de la
Convención sobre Diversidad Biológica (WFCC,
1999).

Cuando los cultivos son recibidos, se debe registrar el
nombre de la persona que realizó la identificación
original. La colección debe confirmar, con un especialista
competente, esta identificación y chequear que concuerda
con las descripciones publicadas de la especie. Todo el material
que entra debe ser tratado como potencialmente peligroso hasta
tanto no se haya confirmado su identificación. Deben
existir procedimientos para asegurar que el material no
identificado no será tratado casualmente y que se cumplen
todos los requisitos de seguridad. En caso de recibir cultivos
desconocidos, la colección debe tener cuidado con la
identificación del material en los grupos
taxonómicos para los cuales no existen especialistas
expertos y debe esforzarse por tener el material chequeado por
especialistas antes de su incorporación (WFCC,
1999).

En el caso de los cultivos que son reconocibles desde
preparaciones microscópicas o cultivos secos (ej: hongos
filamentosos, algas, protozoos), una buena práctica es
realizar estas preparaciones cuando éstos son recibidos
para el depósito. Esto facilita chequear si una cepa
recobrada a partir del material preservado durante el
mantenimiento o en los trabajos de re- preservación de
rutina, está en correspondencia con la depositada
originalmente. Este chequeo puede incluir realización de
pruebas, estudios comparativos, o chequeo por un especialista.
También se recomienda conservar dibujos o imágenes
fotográficas, donde sea factible (WFCC,
1999).

2.3.8 Suministro de cultivos

Si una colección de cultivos ha sido establecida
para brindar un servicio público, entonces debe tener la
capacidad de brindar oportunamente las cepas que se soliciten. Si
no se pueden entregar los cultivos en un tiempo razonable por
razones científicas o técnicas (ej: si el
crecimiento de la cepa es muy lento), esto debe estar indicado en
catálogos, listas o bases de datos (si los poseen). Los
costos de los cultivos varían en dependencia de las bases
de financiamiento y políticas de los administradores de la
colección (en los casos que proceda). Muchas colecciones
intercambian cultivos con otras colecciones de servicio sin costo
alguno. Los cultivos para propósitos de adiestramiento e
investigación generalmente tienen un costo reducido (WFCC,
1999).

Los cultivos listados como disponibles en los
catálogos deben ser brindados por las colecciones de
servicio sin restricciones. En el caso de los que no están
disponibles para su distribución, no deben aparecer en los
catálogos ni estar incluidos en las bases de datos; y
aquellos con distribución restringida deben estar
claramente identificados (WFCC, 1999).

Las cepas patógenas o tóxicas al hombre,
animales o plantas generalmente están sujetas a
regulaciones nacionales o internacionales. Los científicos
que necesitan estas cepas deben obtener un permiso para importar
el material o para la manipulación de los cultivos. Cuando
los cultivos sujetos a estas regulaciones son suministrados a una
persona o institución desconocidas para la
colección, deben mantenerse certificados de
garantía firmados por la persona que hace la solicitud y
el experto de la institución antes de despachar el
cultivo. Las colecciones deben mantener registros detallados de
los cultivos distribuidos (con la cepa y número de lotes
cuando sea apropiado), especificando el procedimiento y fecha de
envío, y nombre y dirección de la persona a la que
se le envió. Cuando el envío se realiza a
través del correo, deben tenerse en cuenta las
regulaciones postales respecto al etiquetado y embalaje (WFCC,
1999).

2.3.9 Promoción y publicidad

Las colecciones deben lograr una amplia publicidad de
sus recursos y servicios que prestan a la comunidad
científica. Esto puede lograrse con la distribución
de folletos, participación en talleres y conferencias,
publicación de artículos, desarrollo de
páginas Web sobre la Internet donde se publiquen
catálogos, datos de las cepas, servicios que prestan.
Además, la colaboración con organizaciones
nacionales o regionales puede ser beneficiosa para este fin
(WFCC, 1999).

2.3.10 Otros servicios

Las colecciones de cultivos de servicios pueden brindar
una variedad de servicios de apoyo a la comunidad
científica e industrial regional o mundial. Si ofrecen
servicios de identificación debe garantizarse el adecuado
entrenamiento al personal. Si brindan servicios de
depósito de patentes, deben operar de acuerdo con los
procedimientos acordados en el Tratado de Budapest sobre el
Reconocimiento Internacional del Depósito de
Microorganismos para Propósitos de Patentes. Si
ofrecen servicios de investigación o
consultoría deben contar con las instalaciones apropiadas
y el personal adecuadamente entrenado (WFCC, 1999).

2.3.11 Documentación

Se necesitan mantener registros para cada cepa mantenida
y estos deben incluir la siguiente información:
localización geográfica, sustrato u hospedero,
fecha de aislamiento, nombre de la persona que realizó el
aislamiento de la cepa, depositor (u otra fuente de la cepa, ej:
otra colección), nombre de la persona que realizó
la identificación de la cepa, procedimiento de
preservación utilizado, temperatura y medio óptimo
para el crecimiento, características bioquímicas u
otras, y alguna condición regulatoria aplicable
(relacionada por ejemplo a la cuarentena, nivel de
contención o seguridad, patente). Si los recursos lo
permiten los registros deben ser computarizados. Es posible
distribuir esta información a través de la
Internet. Para mayor seguridad se deben mantener copia dura y/o
blanda de los archivos computarizados. En estos casos el personal
de la colección debe estar familiarizado con la
operación del sistema computarizado, para garantizar la
continuidad el servicio (WFCC, 1999).

2.3.12 Catálogos

Se deben reproducir a intervalos regulares (cada cinco o
más años) los catálogos de las cepas
disponibles. Estos pueden ser computarizados y distribuidos a
través de internet, o en disquetes o en CD-ROM, lo cual
contribuye a la publicidad de la información mantenida por
la colección (WFCC, 1999).

2.3.13 Investigaciones

Como centro de expertos, los programas de
investigación deben formar parte de cada actividad de la
colección, a través de lo cual se pueden hacer
importantes contribuciones al conocimiento de la
morfología, taxonomía, fisiología,
bioquímica, y genética de los grupos de organismos
mantenidos. Las actividades de investigación
también aseguran que el personal se mantenga actualizado
sobre el desarrollo de la ciencia y esté consciente de las
necesidades de la comunidad científica. Las colecciones
desarrollan estrategias y procedimientos para el aislamiento e
identificación de organismos particulares o productos,
pruebas de control de la calidad, protocolos de
preservación para cepas difíciles de preservar por
procedimientos de rutina, así como desarrollan medios de
cultivos y condiciones de crecimiento óptimos (WFCC,
1999).

2.3.14 Entrenamiento

El personal que trabaja en una colección de
cultivos debe estar adecuadamente entrenado, y cuando adquiere
suficiente experiencia éste debe entrenar a otras personas
en técnicas de preservación, crecimiento e
identificación de cultivos. Si brindan entrenamiento es
importante asegurar los locales adecuados,
así como la supervisión del personal en
entrenamiento velando pro el cumplimiento de las medidas de
seguridad (WFCC, 1999).

2.3.15 Normas de seguridad y calidad

Los aspectos de seguridad de todas las operaciones
llevadas a cabo en la colección necesitan ser
cuidadosamente controlados, teniendo en cuenta las regulaciones
nacionales de seguridad y salud (sobretodo con las cepas
potencialmente patógenas al hombre, animales o plantas); y
las buenas prácticas de laboratorio. Se requieren locales
para la apertura segura de paquetes que contienen nuevos
depósitos o material para identificación que puede
contener organismos nocivos. Las colecciones pueden valorar la
utilización de normas de calidad internacionalmente
reconocidas (ej: ISO 9001) lo cual indica un nivel garantizado de
calidad (WFCC, 1999).

2.3.16 Colaboración nacional e
internacional

Las colecciones de cultivos deben motivarse a contactar
con la WFCC. Esta organización tiene comisiones que se
encargan de enseñanza; patentes; regulaciones de
seguridad, postales y de cuarentena; colecciones en peligro;
biodiversidad y publicidad; los cuales brindan información
útil para las colecciones nuevas y para las ya
establecidas. Esta organización desarrolla congresos
internacionales cada cuatro años, y este es el
único forum para la consideración de todos los
aspectos de la actividad de las colecciones de cultivos. Se
publica un boletín informativo con la planificación
de entrenamientos y cursos que se brindan. Muchos países
tienen asociaciones o federaciones de colecciones formales o
informales, lo cual es el marco adecuado para el intercambio de
información y de discusión de los problemas
comunes. En este sentido también debe ser propiciado el
intercambio formal o informal con grupos activos regionales. Con
el objetivo de dar a conocer los recursos contenidos en la
colección, ésta debe motivarse a registrarse en la
WDCM (WFCC, 1999).

Todos los aspectos relacionados en este acápite
2.3 se deben tener cuenta para el establecimiento y
operación de las colecciones de cultivos. Es posible que
en nuestro país algunos términos no se ajusten,
pero la esencia del documento puede ser adoptada por cualquier
tipo de colección. Sin embargo las colecciones no deben
limitarse solo a esto, por ejemplo, en el documento se habla de
la necesidad del cumplimiento de las buenas prácticas de
laboratorio, de las regulaciones de seguridad existentes; de la
documentación mínima necesaria para la
operación de una colección; de valorar el
establecimiento de un sistema de gestión de la calidad
según las normas ISO 9000; pero no se refleja la necesidad
imperiosa de implementar un programa o sistema de aseguramiento
de calidad en una colección de cultivos como
garantía de todas las operaciones realizadas en ellas.
Estos aspectos son tratados en el acápite 2.5 del presente
documento, y a continuación se profundiza en los aspectos
de preservación de cultivos microbianos dentro de una
colección de cultivos.

2.4-
Preservación de cultivos microbianos

Los cultivos de microorganismos con determinadas
características son esenciales para la mayoría de
los ensayos microbiológicos. Los cultivos de referencia o
controles son utilizados en un amplio número de
determinaciones, debido a que no pueden obtenerse resultados
válidos si no se trabaja con cultivos de alta calidad. Por
todo esto una colección de cultivos bien mantenida es un
requisito indispensable para las buenas prácticas del
laboratorio (Sly, 1992).

Los microorganismos tienen una tendencia inherente a
mutar en cultivos de laboratorio, por lo que es muy importante el
uso de procedimientos para mantenerlos viables y
genéticamente estables. Para lograr estas condiciones se
han establecido varios métodos de preservación con
los cuales se trata de mantener el cultivo viable y con un
mínimo de cambios genéticos lo más cercano
posible al aislamiento original. La mayoría de los
métodos de preservación logran reducir el ritmo
metabólico de los organismos por retención de
nutrientes, agua y oxígeno; por reducción de la
temperatura de conservación; o por combinación de
ambos (Sly, L.; 1992).

Todos los métodos de preservación tienen
ventajas y desventajas por tanto es necesario hacer una
selección del método a utilizar haciendo una
análisis de las características de cada
técnica, factibilidad de su uso y las necesidades del
usuario (Snell, 1991 y Smith, 1996). Generalmente la
elección depende de la disponibilidad del equipamiento y
de la competencia del personal, y es recomendable utilizar
más de un método de preservación y trabajar
con réplicas del microorganismo que se desea preservar
como medida de seguridad (Sly, L.; 1992).

Los métodos desarrollados para la
preservación de los microorganismos se pueden clasificar
en: subcultivos, desecación, liofilización y
congelación (Snell, 1991); y estos últimos son los
de mayor éxito pues garantizan la preservación por
períodos muy prolongados.

2.4.1- Subcultivos

El método tradicional para la preservación
de los microorganismos es el subcultivo y consiste en la
transferencia del cultivo a un medio de cultivo fresco a
intervalos que aseguren la viabilidad del mismo (Snell, 1991).
Estos intervalos varían dependiendo de las
características del microorganismo en cuestión,
algunas especies requieren ser transferidas a nuevos medios
después de días o semanas, y otras después
de meses o años. Esta frecuencia puede reducirse con el
almacenamiento del subcultivo a temperaturas relativamente bajas,
en un refrigerador a 40C o en un freezer entre
–100C y –200C, bajo aceite mineral o agua (Smith y
Onions, 1994).

Este método es muy simple, con él se puede
mantener la viabilidad de algunos microorganismos por muchos
años, y la recuperación de los cultivos activos es
relativamente fácil. En el caso de colecciones
pequeñas, éste puede ser un método
económicamente factible en cuanto al equipamiento y al
tiempo que se invierte. Actualmente algunas colecciones de
cultivos lo utilizan para la preservación de sus
microorganismos, como es el caso del Centro Venezolano de
Colecciones de Microorganismos (Rodríguez et al.,
1996).

Sin embargo tiene algunas desventajas como son, la
posibilidad de la pérdida de la identificación del
microorganismo después de muchas transferencias de nombres
o designaciones de los cultivos; el riesgo de
contaminación y de cambios genéticos que se
incrementa a mayor número de transferencias; la posible
inoculación con el microorganismo equivocado cuando se
realiza la transferencia de una serie de cepas; el peligro de
pérdida del cultivo sobre todo cuando se trabaja con
microorganismos delicados y no se realizan transferencias
periódicas oportunas a medios frescos; la posibilidad de
que ocurra deshidratación del medio de cultivo;
además, cuando hay muchos microorganismos el trabajo es
muy intenso y se requiere un espacio grande para el
almacenamiento(Smith y Onions, 1994).

2.4.2- Desecación

El método de almacenamiento de microorganismos en
estado de secado ha sido aplicado como un método de
preservación particularmente para bacterias y hongos que
consiste en la separación del agua y la prevención
de la rehidratación. Para el desarrollo de los
métodos de desecación se han empleado arena, tierra
y zeolita (Heidrich et al., 1996); sílica gel (Sidyakina,
1991); discos y tiras de papel (Kirsop, 1991); tapones de
algodón (Malik, 1991); discos de gelatina (Snell y
Kocur, 1991) y cuentas de vidrio y de porcelana
(Malik, 1991).

La desecación es un método simple para la
preservación de microorganismos, el trabajo no es muy
intenso, el costo es pequeño y la contaminación de
los subcultivos es menos probable que con los subcultivos
periódicos. Además, puede utilizarse para el
almacenamiento de un gran número de cultivos. A pesar de
esto, resulta difícil evaluar detalladamente su
confiabilidad, pués, en la mayoría de los casos, la
información apropiada no está disponible y en otros
está restringida a un número limitado de
microorganismos. De cualquier modo, los cultivos no deben ser
preservados solamente por este método sin una
investigación previa (Malik, 1991).

2.4.3- Liofilización

La liofilización consiste en la
eliminación del agua de una sustancia congelada por
sublimación del hielo bajo vacío. Este proceso
consta de tres etapas, la precongelación del producto para
asegurar una estructura completamente congelada; el secado
primario con el que se elimina la mayor parte del agua por
sublimación; y el secado secundario con el que se remueve
el agua que queda ligada (ATCC, 1991).

El éxito de la liofilización para la
preservación de los microorganismos no sólo depende
de los pasos de esta técnica (congelación y
deshidratación) sino también de las
características físico- químicas del medio
de suspensión, el tipo de microorganismo, el estado
fisiológico del cultivo, las condiciones del cultivo, la
concentración de los microorganismos, entre
otros.

El medio de preservación es esencial para
proteger las células de los daños producto de los
procesos de congelación y sobresecado. La elección
del medio depende del microorganismo de manera que se logre
mantener la viabilidad y permitir un buen recobrado posterior al
proceso de liofilización. Usualmente el medio
de preservación contiene altos niveles de suero,
proteínas, aminoácidos (ej: glutamato
monosódico), carbohidratos (ej: glucosa, sacarosa) o leche
descremada (Sly, L. 1992).

Este método es uno de los más eficaces
para la conservación de muchos tipos de microorganismos,
como: bacterias, hongos, bacteriófagos y virus; algunos de
ellos pueden sobrevivir por períodos de más de 40
años (ATCC, 1991; Sly, 1992). Es conveniente para la
producción y distribución masiva de cultivos, la
viabilidad, pureza y estabilidad de los cultivos se mantienen por
largos períodos de tiempo, no se requiere de una
atención constante después de almacenarse los
cultivos liofilizados y cientos de éstos pueden guardarse
en un pequeño espacio (Snell, 1991). Malik en 1995
reportó un método miniaturizado de
liofilización utilizando capilares de vidrio mediante el
cual se reduce el espacio de almacenamiento y el costo de la
distribución de los cultivos. Sin embargo, el proceso es
complejo y caro, pues aunque no necesariamente requiere de un
equipo sofisticado, se necesita al menos de un sistema de
vacío (Smith y Onions, 1994), por lo que no se puede
aplicar en laboratorios con recursos limitados.

2.4.4- Congelación

La preservación por congelación o
criopreservación consiste en la congelación y
almacenamiento de células a muy bajas temperaturas. En
estas condiciones el agua, mayor componente de las células
vivientes, pasa de fase líquida a sólida. Las
temperaturas utilizadas pueden ser de –200C,
–700C, y temperaturas de nitrógeno (fase de
vapor:-1400C; fase líquida:-1960C). La temperatura
de almacenamiento seleccionada depende de las facilidades
disponibles, pero las temperaturas más bajas favorecen la
viabilidad y la estabilidad genética (Sly, L.
1992).

La mayoría de los microorganismos (bacterias,
hongos, virus, bacteriófagos) sobreviven largos
períodos el almacenamiento en estado de congelación
por la reducción marcada de su ritmo metabólico.
Algunos protozoos, algas y células humanas también
pueden ser preservados por este método (Sly, L. 1992).
Existen muchos factores que pueden afectar la viabilidad y
estabilidad de los cultivos durante el proceso de
congelación, por lo que deben realizarse pruebas de
ajustes del grado de enfriamiento y calentamiento, además
de la adición de crioprotectores a la suspensión
celular (Snell, 1991). Los aditivos crioprotectores son
compuestos químicos de gran afinidad por el agua y son
utilizados para disminuir los daños durante el proceso de
congelación, ejemplo de ellos son el glicerol y el
dimetilsulfóxido (DMSO) (ATCC, 1991).

El almacenamiento de microorganismos por el
método de congelación a temperaturas extremadamente
bajas es muy simple y se ha logrado estandarizar para la
preservación de un amplio rango de microorganismos. Con
él se obtiene la más reducida pérdida de
viabilidad, un alto grado de estabilidad y períodos de
sobrevivencia de más de 30 años. El costo inicial
del equipamiento puede ser alto pero la seguridad de este
método justifica su costo, sobretodo en cultivos
difíciles de preservar por otros métodos (Sly, L.
1992). Sin embargo, el nivel de nitrógeno líquido
de los contenedores debe chequearse diariamente y mantenerse
constante; la distribución de los cultivos
congelados se hace difícil y costosa; y la
penetración de nitrógeno líquido en
ámpulas mal selladas puede provocar explosiones cuando se
trasladen del contenedor a otro lugar, por lo que se recomienda
utilizar recipientes de plástico o almacenamiento en la
fase de vapor del nitrógeno. Cuando se utiliza este
método debe utilizarse protector para la cara, bata y
guantes de laboratorio como medidas de seguridad contra las
salpicaduras y derrames de nitrógeno líquido y la
explosión de las ámpulas de vidrio (Kirsop, 1991;
Sly, L. 1992).

2.5-
Aseguramiento de la calidad para las colecciones de
cultivos

Es muy importante que los organismos de uso
biotecnológico sean mantenidos en una forma que permita
conservar sus propiedades. Los procedimientos seguidos por las
colecciones de recursos microbianos deben asegurar la calidad del
producto brindando materiales de referencia que permitan obtener
resultados reproducibles. Las colecciones deben aplicar el
control de la calidad y medidas de aseguramiento para mantener
esas condiciones teniendo en cuenta las necesidades de los
usuarios y la disponibilidad de los recursos.

Existen un gran número de modelos nacionales e
internacionales para los Sistemas de Aseguramiento de Calidad que
pueden ser utilizadas por las colecciones de cultivos, entre
ellas están las ISO 9000 y las normas para la
acreditación. No existe un Sistema de Acreditación
diseñado particularmente para colecciones de cultivos pero
los anteriormente mencionados pueden ser aplicados (Day,
1998).

Stevenson y Jong (1992) reportaron la necesidad de
controlar la calidad y normalizar el trabajo de las colecciones
de cultivo, para incrementar la calidad de las colecciones y de
esta manera asegurar que se ofrece el servicio que se requiere
para la ciencia e industria, garantizando materiales de
referencia estables para el futuro.

En el mundo existen algunas normas generales para las
colecciones, como por ejemplo, los lineamientos de la WFCC para
el establecimiento y operación de las colecciones de
microorganismos (Hawksworth et al., 1990); el proyecto de normas
para las colecciones miembros de la red de información
microbiana para Europa (MINE) (Hawksworth y Schipper, 1989); y
las normas para bancos de germoplasmas. Organización de
alimentos y agricultura de Naciones Unidas, Roma, Instituto de
Recursos Genéticos de Plantas Internacional, Roma (Anon,
1994). En el caso de los laboratorios de microbiología
existen un grupo de normas más específicas como las
de Buenas Prácticas de Laboratorio, las normas
británicas 5750, los servicios nacionales de
medición (NAMAS). A pesar de que existen publicaciones
sobre el mantenimiento de las colecciones de cultivo que brindan
información a través de protocolos y
procedimientos, es necesario elaborar y establecer normas
(Hawksworth y Kirsop, 1988; Kirsop y Kurtzman, 1988; Kirsop y
Doyle, 1991; Smith y Onions, 1994), pues no existe ningún
esquema de acreditación diseñado
específicamente para las colecciones de
cultivos.

En 1993 la Comisión de Recursos Genéticos
de Plantas emitió las normas para los bancos de genes, que
pueden ser usadas como referencia regional, nacional e
internacional (Anon, 1994).

Estas normas abarcan solamente el almacenamiento de
semillas auténticas que pueden sobrevivir a la
desecación, y cuya longevidad de la semilla es mejorada
con la reducción de la humedad y la temperatura de
almacenamiento. Las colecciones de recursos microbianos pueden
beneficiarse con la aplicación de normas similares (Smith,
1996 y Day, 1998).

Algunas colecciones de cultivos de cultivos microbianos
trabajan en el establecimiento de un sistema de aseguramiento de
calidad para garantizar confianza a sus clientes en el servicio
brindado, y así mismo desarrollan manuales de
procedimientos de laboratorio como reflejo de esos sistemas de
calidad, como es el caso de la Colección de Cultivos
Nacional del Reino Unido (UKNCC) (Day, 1998).

Los siguientes requisitos aparecen
contenidos en todas las normas revisadas, y deben constituir los
requisitos mínimos para el aseguramiento de calidad de las
colecciones de cultivos:

• Documentación

• Identificación y autenticidad de las
cepas

• Pureza

• Monitoreo de viabilidad

• Estabilidad de las propiedades de las
cepas

• Estandarización de las condiciones de
crecimiento

• Metodologías y protocolos de
preservación estandarizados

• Mantenimiento de los equipos

• Normas para el suministro e intercambio de
cepas

• Seguridad a largo plazo

• Control de las condiciones ambientales

• Auditorías

• Cumplimiento de las legislaciones

• Personal y entrenamiento

2.5.1- Documentación

Un aspecto fundamental para llevar cabo un riguroso
control de calidad en una colección de cultivos es contar
con sistema de documentación eficiente. Las colecciones de
cultivos reconocidas internacionalmente cuentan con listas de
chequeo que son llevadas para cada lote de material que es
conservado. Es esencial mantener documentos que contengan los
datos de los cultivos, sobre todo si varias personas están
involucradas en el proceso (Simione, MS and Brown, BS; 1991).
Esta información puede estar almacenada en libretas,
archivos o registros, tarjetas indexadas, o en sistemas semi o
completamente computarizados (Iglesias, 1999; Smith, 2000). Los
datos originales suministrados por el depositor deben ser
registrados (datos del mantenimiento, caracterización de
las cepas, etc.). La mayor cantidad de información debe
ser registrada y actualizada regularmente, esto incrementa el
valor de una colección de cultivos (Hill, LR y Kirsop,;
1991; Sly, 1992).

Las siguientes listas proveen el tipo de
información que debe ser registrada: A- Registros de
cepas:

1-Aspectos esenciales:

a) # de referencia en el laboratorio

b) # alternativo (colección de servicios, otros
laboratorios)

c) nombre (si se conoce)

d) datos del depósito

e) requerimientos del cultivo (medio, temp., pH,
requerimientos nutricionales)

f) métodos de mantenimiento

2-Otros aspectos:

a) usos del cultivo (cepa de producción, cepa de
ensayo, prueba de esterilidad)

b) Propiedades del cultivo (fisiológicas,
morfológicas, genéticas)

c) Referencias

B- Registros del Mantenimiento:

1-Información del subcultivo (medio,
temperatura)

Registros del período de almacenamiento (fecha,
características culturales, etc.)

2-Información de la liofilización
(métodos de crecimiento, concentración celular del
inóculo, medio de suspensión, # de ámpulas
que se prepararon, almacenamiento, procedimiento de
recuperación)

Registros (fecha de realización del
proceso, # de lote, conteo de viables antes y después del
proceso, fecha de vencimiento del lote, # de ámpulas
almacenadas).

3-Información sobre el almacenamiento en
Nitrógeno (líq.) (Métodos de crecimiento,
concentración celular del inóculo, criopreservante,
temperatura de congelación, # de viales que se prepararon
para el almacenamiento, procedimiento de
recuperación).

Registros (fecha de congelación, #
de lote, conteo de viables, fecha de vencimiento del lote, # de
viales criopreservados)

C- Registros para el suministro de cultivos:

Fecha de entrega, persona que solicita el
cultivo, propósito de la solicitud, información
suministrada por el usuario (retroalimentación)

Las colecciones deben contar con procedimientos
normalizados de manera que todo el personal pueda utilizarlos
para la ejecución de las operaciones de rutina. El sistema
de documentación de la colección de cultivos debe
incluir además, el registro de estas operaciones, lo cual
constituye una evidencia del trabajo realizado y permite la
trazabilidad de los resultados. Si es posible se deben elaborar
manuales de procedimientos que aseguren la continuidad del
trabajo, y estos deben ser dominados por todo el personal
incluyendo el personal en entrenamiento (Smith, 1996).

2.5.2- Identificación y autenticidad de las
cepas

Para una colección de cultivos es esencial contar
con cepas identificadas, pues coleccionar materiales sin datos
descriptivos puede conllevar a la duplicación innecesaria
y a la pérdida de recursos. Un organismo no es útil
si no se conoce nada acerca de él. Si un organismo no
puede ser completamente identificado es necesario recopilar datos
descriptivos, microfotografías, perfiles
metabólicos, datos de secuenciación, entre otros
(Smith, 1996).

El chequeo de autenticidad se realiza para comprobar que
nuestro cultivo mantiene las características de la cepa
original. Es importante demostrar que las características
y funciones propias de nuestros microorganismos no están
alteradas. Esto implica realizar una caracterización de
las cepas, y la profundidad de este estudio depende de varios
factores entre los que se destacan: recursos disponibles y
naturaleza de los cultivos (Kirsop y Doyle, 1991)

2.5.3- Pureza

El chequeo de pureza tiene como objetivo comprobar que
los cultivos que conservamos se encuentran puros. Es obvio que
las cepas deben estar puras, sin embargo en ocasiones es
necesario conservar cultivos mixtos, pues existen cepas que no
pueden crecer sin su simbionte u hospedero, pero esto debe estar
bien definido y registrado. Este chequeo debe realizarse y
registrarse antes de la preservación, inmediatamente
después y durante el almacenamiento (Smith, 1996), y puede
realizarse en la misma placa petri con la cual se hace el chequeo
de viabilidad. Estas placas son examinadas para detectar ausencia
de contaminantes.

Es necesario tener en cuenta que existen microorganismos
de crecimiento lento que pueden estar contaminando nuestros
cultivos, por lo que estas placas se deben mantener por un
período de tiempo mayor, y posteriormente se reexaminan
(Hill, LR y Kirsop, BE; 1991). En ocasiones es necesario hacer
chequeos de pureza utilizando varios medios de cultivo para
descartar la presencia de microorganismos que requieren otras
condiciones nutricionales para su crecimiento. En el caso de los
hongos, por ejemplo, se puede realizar este chequeo en medios de
cultivo que favorezcan el crecimiento de bacterias (Simione y
Brown, 1991).

2.5.4- Monitoreo de viabilidad

El chequeo de viabilidad se realiza con el objetivo de
detectar el nivel de viabilidad del cultivo. Lo cual permite que
en la medida que ésta disminuya se puedan tomar medidas
para impedir la pérdida del material. Este chequeo al
igual que el de identidad y pureza, debe realizarse y registrarse
antes de la preservación, inmediatamente después y
durante el almacenamiento (Smith, 1996).

Este monitoreo puede realizarse por diferentes
métodos; en el caso de la preservación por el
método de subcultivo, es suficiente realizar un pase de
cultivo a un medio fresco, este se incuba y posterior al tiempo
de incubación se puede determinar si el cultivo
está viable por la observación de colonias
típicas del microorganismo; pero este método es
cualitativo. En el caso de métodos de
conservación a largo plazo como la
liofilización y congelación, este control se
realiza cuantitativamente por el método de conteo en
placas utilizando diluciones seriadas (Simione y Brown,
1991).

En el caso de la liofilización es importante
llevar a cabo una determinación cuantitativa de las
unidades formadoras de colonias por mL (UFC/mL) de la
suspensión antes y después de la
liofilización, esto constituye un control del proceso
(Hill y Kirsop, 1991). Un método simple es rehidratar el
vial liofilizado en 0.3-0.5mL de Caldo Nutriente o descongelar un
vial criopreservado y adicionarlo a un tubo conteniendo 5-6mL de
Caldo Nutriente. Esta suspensión se inocula (0.1mL) en
tres puntos diferentes cercanos al borde de una placa petri
conteniendo medio de cultivo agarizado. La placa se inclina para
permitir que las gotas corran paralelamente a través de la
superficie del agar, formando tres líneas. Los tubos de
caldo y las placas se incuban y cuando el crecimiento es visible,
se realiza un conteo y las placas que contengan menos de 100
colonias por cada línea se desechan y por consiguiente hay
que obtener un nuevo lote del cultivo (Simione y Brown, 1991).
Otros autores refieren como un nivel de viabilidad adecuado la
recuperación del 50-75 % de las
células preservadas, aunque tales niveles no pueden
obtenerse con algunas células, pero esto debe quedar
definido en los procedimientos documentados de la
colección (Smith, 1996).

2.5.5- Estabilidad de las propiedades de la
cepa

Las colecciones de cultivos deben desarrollar programas
de investigación para determinar y asegurar la estabilidad
de las cepas. Las propiedades conocidas deben chequearse
periódicamente, pero para estimar la estabilidad con
precisión debe seleccionarse una propiedad que no sea
estable en la cepa y chequear su comportamiento en el tiempo
(siempre que sea posible) (Smith, 1996). Los estudios de
estabilidad pueden incluir el chequeo en el tiempo de la
viabilidad, la pureza y la identidad de las cepas.

2.5.6- Estandarización de las condiciones de
crecimiento

Es necesario cuando sea factible, realizar estudios para
establecer las condiciones de crecimiento óptimas de los
microorganismos de las colecciones de cultivos, pues esto
favorece el proceso de conservación de los mismos (Sly,
L., 1992).

2.5.7- Metodologías y protocolos de
preservación

Las colecciones de cultivos deben desarrollar
metodologías y protocolos para garantizar la
preservación a largo plazo de sus recursos
biológicos, deben estar documentados con todos los
detalles de las operaciones y ser de dominio de todo el personal.
Para cada microorganismo se debe seleccionar el método de
preservación que garantice su conservación por un
período de tiempo prolongado, así como el medio de
preservación que proporcione adecuada protección
durante el proceso de preservación. Estos protocolos de
preservación deben incluir los controles
necesarios a realizarle a las cepas antes, durante y
después de concluido el proceso, y pueden contemplar
chequeos de viabilidad, pureza e identidad. Durante el proceso se
pueden hacer controles de temperatura y otros dependiendo del
método de preservación utilizado (Sly, L.,
1992).

2.5.8- Mantenimiento de los equipos

Todos los equipos de la colección de cultivos
deben ser mantenidos y calibrados periódicamente,
según los programas establecidos, lo cual asegura que
estos operen dentro de los límites establecidos. Debe
controlarse el uso y operación de los mismos, lo cual
puede permitir la traceabilidad y reproducibilidad de los
resultados. En el caso de los equipos especiales como las
liofilizadoras, deben ser manipulados por personal competente
(BPL, 1992; Smith, 1996).

2.5.9- Normas para el suministro e intercambio de
cepas

Otro aspecto importante es la distribución de los
cultivos, pues las colecciones de cultivos suministran cultivos
teniendo en cuenta la demanda de los mismos. Esta
operación está regulada por normas locales,
nacionales e internacionales que deben ser asimiladas por las
colecciones de cultivo. La Unión Postal Universal y la
Asociación de Transporte Aérea determinan los
requerimientos para el traslado de sustancias biológicas
frágiles, lo cual debe ser incorporado dentro de las
legislaciones sobre intercambio de mercancía. Esto debe
comprender la especificación de la categoría de
sustancia infecciosa o no infecciosa, adecuado empaquetamiento y
sellado y el intercambio solo puede efectuarse entre laboratorios
reconocidos a través de correos registrados (Sly,
1992).

Según Sly, (1992) existen algunas consideraciones
que deben tenerse en cuenta para el traslado de
cultivos:

• Enviar los cultivos liofilizados en
ámpulas

• Si es necesarios enviar cultivos
activos, se deben utilizar cuñas de agar en frascos de
cristal o plásticos con tapón de rosca

• Los cultivos en caldos deben ser
enviados como última opción y solo en tubos o
frascos con tapón de rosca

• Nunca se deben enviar por correo
tubos de cultivos en caldos con tapas holgadas ni cultivos en
placas petri

En estas operaciones está involucrado personal no
científico, por lo que es necesario tomar todas las
precauciones necesarias. Los científicos y los encargados
del trasporte deben discutir las medidas de seguridad antes del
traslado de los cultivos (Hill y Kirsop, 1991).

La NCTC tiene un folleto que plantea varias condiciones
para el suministro de los cultivos, entre las que se
destacan:

• El usuario tiene que leer las
especificaciones

• Los cultivos deben ser utilizados
por el usuario o bajo su supervisión personal o por
personal autorizado por él

• Los cultivos de patógenos
riesgosos son sujetos a condiciones especiales y solo son
suministrados a determinados Departamentos

• El usuario tiene la responsibilidad de asegurar
una manipulación segura del cultivo (Hill y
Kirsop, 1991)

Algunos países como Estados Unidos exigen
evidencias de que el usuario está entrenado en
Microbiología y tiene acceso a equipamiento de laboratorio
y debe asumir todos los riesgos y responsabilidades del uso de
los cultivos. Similares procedimientos operan en otros
países y siempre están regulados por la mayor
Colección Nacional (Hill y Kirsop, 1991).

2.5.10- Seguridad a largo plazo

Desde la introducción de los conceptos de salud y
seguridad en algunos países como Inglaterra y otros de la
Unión Europea, se han emitido una amplia gama de
guías, regulaciones y recomendaciones para la
manipulación de microorganismos en instalaciones de
investigación y producción, y existen grupos de
trabajo encargados de asegurar que los procedimientos de
seguridad se establezcan y mantengan en todas las instituciones.
Es peligroso no tomar precauciones contra los riesgos reales
relacionados con la manipulación de microorganismos debido
a la patogenicidad real o potencial sobre animales, plantas e
incluso al hombre (Hill y Kirsop, 1991).

Las normas de práctica para seguridad en
laboratorios de Microbiología se pueden aplicar a las
colecciones de cultivos (Hill y Kirsop, 1991; Sly, 1992). Estas
deben ser dominadas por el personal que trabaja directa (curador
y personal que trabaja directamente con los cultivos) e
indirectamente (transportistas) en la colección de
cultivo. Se debe tener conocimiento de las Leyes de Seguridad
Biológica, en las cuales aparecen agrupados los
microorganismos en categorías teniendo en cuenta el nivel
de riesgo que ellos representan a los trabajadores y a la
comunidad (Ley de la Seguridad Biológica Decreto Ley
No.190, Gaceta Oficial, Cuba, 1999; Hill y Kirsop,
1991).

En el caso de los microorganismos manipulados
genéticamente existen guías que contienen los
requerimientos establecidos para el control de los experimentos
de manipulación genética. Estas pueden ser locales
o regionales. En Inglaterra existe un Comité Asesor para
la Manipulación Genética (Hill y Kirsop,
1991).

Según Simione y Brown, 1991 (ATCC)
existen una serie de medidas que garantizan la seguridad de las
colecciones:

• Mantener los cultivos en condiciones
de almacenamiento adecuadas.

• Tener un sistema de bancos de
semillas para evitar la pérdida del cultivo
original.

• Mantener copias de cada cepa
almacenadas en dos lugares diferentes; o incluso en otra
Institución.

• Mantener los microorganismos por dos
métodos de preservación diferentes
(Smith,1996)

• Mantener registros fieles que
contengan localización y número de viales por
cepa.

Cuando se utiliza la
criopreservación y liofilización como
métodos de preservación se deben tener en cuenta
los siguientes aspectos:

Tabla 1. Recomendaciones para el uso de los
métodos criogénico y liofilización para la
preservación de microorganismos.

Almacenamiento
criogénico

Almacenamiento por
liofilización

La exposición a temperaturas
criogénicas debe ser minimizada ya que
se puede perder la sensibilidad en las manos.

Monitorear el nivel de
contaminación durante el proceso de
liofilización

El Nitrógeno líquido
debe usarse en áreas adecuadamente
ventiladas.

Implementar sistemas de
descontaminación

Las ámpulas deben estar bien
selladas pues pueden explotar cuando se sacan
del Nitrógeno líquido

Utilizar instalaciones solo para
realizar el proceso de liofilización de
microorganismos.

Usar viales
plásticos

Usar viales de cristal
preferiblemente

Uso de aditamentos protectores para
la manipulación del Nitrógeno
líquido

Cuando se manipulan microorganismos se debe evitar la
generación de aerosoles durante la dispensación de
los frascos que serán preservados y en la apertura de los
frascos de cultivos preservados. Para microorganismos de riesgo
es necesario trabajar en un gabinete de Seguridad
Biológica Clase II (Sly, 1992; Simione y Brown,
1991).

Durante el proceso de preservación puede ocurrir
pérdida de los cultivos y es importante detectar el paso
dentro del procedimiento que afectó la viabilidad. Esto
puede realizarse chequeando viabilidad en varias etapas del
proceso. Entre los aspectos que pueden afectar la viabilidad se
encuentran: aditivo; tiempo durante el cual el microorganismo
está en contacto con el aditivo a temperatura ambiente;
fase de crecimiento a partir de la que se preservan los
microorganismos; condiciones de crecimiento de los
microorganismos; uso de formas resistentes (esporas); en
el caso de la liofilización: temperatura de
congelación, tiempo de secado, temperatura y tipo de
fluido de rehidratación, extensión del secado;
temperatura de almacenamiento.

2.5.11- Control de las condiciones
ambientales

Se deben mantener controles de las condiciones
ambientales de los locales de trabajo, así como de los
equipos utilizados para la conservación de los
microorganismos. Esto implica conservar registros diarios de
temperatura, humedad relativa, y otros según se requiera;
lo que garantiza conocer el comportamiento de estos
parámetros y tomar decisiones en el momento necesario. Una
variación en las condiciones ambientales de
conservación de los organismos puede afectar su viabilidad
y estabilidad (BPL, 1992).

2.5.12- Auditorías

Es muy importante que los procedimientos y normas
establecidas en una colección de cultivos sean
monitoreados a cada nivel, a través de auditorías.
Estas deben llevarse a cabo por personal competente y pueden ser
internas o externas. Estas últimas pueden ser producto de
procesos de acreditación por organismos nacionales
competentes. El registro de estas auditorías es vital para
demostrar la competencia del laboratorio (BPL, 1992; Smith,
1996).

2.5.13- Cumplimiento de las legislaciones

Existen muchas regulaciones que se aplican al trabajo de
las colecciones de cultivos desde el aislamiento y la
manipulación, hasta la distribución y su
transporte. El personal de las colecciones debe conocer de tales
regulaciones, estas abarcan el embalaje, envío y
transporte; seguridad y salud; así como la
acreditación (Smith, 1996; Smith, 2000).

2.5.14- Personal y entrenamiento

El personal que labora en la colección de
cultivos debe tener alta calificación y debe estar
entrenado en las operaciones desarrolladas en la colección
de cultivos a la que pertenece. Se debe garantizar el adecuado
entrenamiento para este personal, así como para el de
nuevo ingreso. Este último estará bajo
supervisión hasta que adquiera las habilidades necesarias.
El entrenamiento y la capacitación pueden incluir
programas de maestrías y doctorados (BPL, 1992; Hall y
Hawksworth, 1996).

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Autor:

Lic. Rosa Amelia Gonzáles
MsC.

Lic. Nivian Montes de Oca
Martínez1

Dr. C., Lic. Yamilka
Riverón

Dra. Amalia
Núñez

1 Grupo de Aseguramiento de
la Calidad. Dirección Calidad. Centro Nacional de Sanidad
Agropecuaria

CENSA, Carretera de Jamaica y Autopista
Nacional, Apdo 10, San José de las Lajas, La Habana,
Cuba.

Partes: 1, 2
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