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Escaladura foliar de la caña de azúcar en Cuba: Caracterización, diversidad y diagnóstico molecular de su agente causal (página 2)



Partes: 1, 2

respecto a sus
características fisiológicas y bioquímicas (Van Den Moyter y Swings, 1990), existe heterogeneidad
entre las diferentes cepas del patógeno con respecto a los perfiles proteicos y serológicos (Ricaud y
Ryan, 1989; Yang et al., 1993; Rott et al., 1986, 1994). Además han sido establecidos diez grupos
genómicos (A-J), mediante electroforesis de campo pulsante (PFGE) (Clerc, 1997; Davis et al., 1997).
Así, el surgimiento de nuevos brotes de la enfermedad, impone la necesidad de profundizar en el
conocimiento de la variabilidad de este patógeno y perfeccionar los métodos de diagnóstico con la
finalidad de facilitar la detección de las variantes presentes en cada área geográfica.
Teniendo en cuenta que el resurgimiento de la enfermedad ha elevado la complejidad de la situación
fitosanitaria del cultivo en el país y la ocurrencia de brotes recientes en áreas del Caribe y la Florida,
causados por una nueva variante genómica del patógeno, nos propusimos la siguiente hipótesis de
trabajo:
El brote actual de escaldadura foliar en Cuba, tiene un origen similar al de los ocurridos
recientemente en otros países de la región, lo que puede demostrarse mediante análisis
serológicos y moleculares, que permitirán además establecer un sistema novedoso de diagnóstico
adecuadamente validado para la detección de las variantes que se identifiquen en el país.

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Para demostrar esta hipótesis, se trazaron los siguientes objetivos de trabajo:

1. Caracterizar los aislamientos de X. albilineans circulantes en los focos de escaldadura existentes en
el país y compararlos desde el punto de vista morfológico, bioquímico, serológico y molecular con los
obtenidos previamente a partir de infecciones latentes de la enfermedad.
2. Determinar la diversidad serológica y genómica de las poblaciones cubanas de X. albilineans y las
variantes de la bacteria presentes en el país.
3. Desarrollar y validar métodos moleculares para el diagnóstico de la enfermedad.
4. Aplicar los métodos de diagnóstico desarrollados para la detección de la enfermedad en variedades
comerciales y clones del Banco de Germoplasma cubano.

II. MATERIALES Y METODOS
II.1
Descripción de síntomas y obtención de aislamientos
A partir de la aparición de los síntomas de la enfermedad en Febrero de 1998 en el Banco de
Germomplasma de la EPICA de Jovellanos ( Matanzas ) se realizaron muestreos, en los cuales se
seleccionaron al azar muestras representativas de diferentes variedades, con síntomas típicos o
dudosos y asintomáticas. De cada variedad se tomaron muestras de dos plantones. Posteriormente con
la colaboración del Departamento Fitosanitario del MINAZ, los fitosanitarios de cada provincia y
Cuarentena Vegetal, se recibieron muestras de diferentes EPICAs y CAIs de las provincias de Pinar
del Río, La Habana, Camagüey, Ciego de Ávila, Las Tunas y Holguín. Fueron analizadas muestras de 56
variedades procedentes de 16 localidades de estas 7 provincias del país.

Se realizaron aislamientos de macerados en solución salina ésteril de hojas y brotes laterales, así como
de jugos de tallos extraídos por centrifugación y maceración, que se sembraron en medio Agar
Wilbrink suplementado con ciclohexamida y extracto de levadura (Rott et al., 1988; Davis et al., 1994).
Las placas fueron incubadas a 28oC hasta los diez días y las colonias con características típicas de
X.albilineas fueron seleccionadas; se les realizó la tinción de Gram y se comprobó su crecimiento
negativo en medio Agar Nutriente. Después de dos pases sucesivos de una colonia y comprobada su
pureza, los aislamientos fueron conservados de acuerdo a lo descrito por Moore et al, 1988 y Rott et
al., 1996.

II.2 Identificación de los aislamientos de X. albilineans mediante PCR anidada (n-PCR)

La identificación de los aislamientos obtenidos de diferentes clones y variedades durante el brote
actual de la enfermedad (Tabla 1), se realizó mediante la amplificación específica de fragmentos de
ADN del complejo de genes albicidina por PCR anidada (n-PCR) (Davis et al., 1997). Se incluyeron
además, aislamientos realizados a partir de vitroplantas asintomáticas obtenidas en las biofábricas del
país en el período 1994-1997 (L1-L3) (Martín et al., 2000); 16 cepas de referencias procedentes de
diferentes colecciones internacionales (R1-R16) y 7 aislamientos de otras especies bacterianas
patógenas a caña de azúcar (S1-S7) (Tabla 2). La extracción de ADN se realizó de acuerdo con el
método descrito por Ausubel et al., (1992).
Los productos de amplificación fueron separados por electroforesis a 80 V en solución 0.5X TBE (45
mM Tris, 45mM de ácido bórico y 1mM EDTA) en gel de agarosa 1.5% conteniendo bromuro de etidio
(0.5 µg/ml de gel). La talla de los fragmentos obtenidos, 440 y 308 pb para ambas amplificaciones, fue
comparada con el marcador de 100 pb (Promega).

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II.3 Patogenicidad en maíz
A partir de estas pruebas iniciales de identidad, se evaluaron 20 aislamientos representativos de
diferentes variedades y localidades del país, así como uno de la fase de latencia de la enfermedad
(Martín et al., 2000). En las Tablas 1 y 2 aparecen señalados los aislamientos utilizados. Se realizaron
inoculaciones en plantas de maíz híbrido T-66 de 10 días de germinadas, utilizando suspensiones
bacterianas a una concentración de 105 ufc /ml (Rivera et al., 1985). El control fue inoculado con agua
destilada estéril. La constatación de los síntomas fue realizada diariamente hasta los 30 días post-
inoculación. Se realizó el reaislamiento del patógeno y se comprobó su identidad mediante n-PCR (Davis
et al., 1997).
II.4 Caracterización y diversidad de los aislamientos de X.albilineans
A partir de las pruebas iniciales de identidad y patogenicidad, se realizó la caracterización
morfológica, bioquímica y fisiológica, empleando los mismos aislamientos cubanos descritos en el
epígrafe anterior y las cepas de referencia R1, R2, R3, R4, R16. Para la caracterización serológica y
molecular, se realizó el análisis y comparación de los aislamientos y cepas de referencias descritos en
las Tablas 1y 2. En la caracterización molecular se incluyeron además, ocho aislamientos brasileños (B1-
B8), cedidos gentilmente por el Dr. Eder Giglioti de la UFSCar, Brasil.

II.4.1 Caracterización y diversidad morfológica
Se realizaron preparaciones para microscopía electrónica de trasnmisión por tinción negativa (Sigee,
1990) con el objetivo de detectar el flagelo polar y determinar las dimensiones de las células
bacterianas. Se midieron entre 65 y 189 células de los diferentes aislamientos a partir de las
microfotografías electrónicas, se realizó un análisis de varianza con los datos obtenidos y se
establecieron las diferencias significativas entre los distintos aislamientos (SAS, 1996). La
descripción morfológica de las colonias se hizo sobre medio Agar Wilbrink.

II.4.2 Caracterización y diversidad bioquímica y fisiológica
Se determinó la presencia del pigmento xanthomonadina de acuerdo a la metodología descrita por
Maringoni et al., (1988) y se establecieron las propiedades bioquímicas más importantes para la
determinación del género y especie de acuerdo a las metodologías descritas por Király et al., (1974);
Romeiro, (1976); Klement et al., (1990) y Stead, (1990) y el Manual de Bacteriología Determinativa de
Bergey (Holt et al., 1994) ).
II.4.3 Caracterización y diversidad serológica
Para determinar la reacción serológica de los aislamientos, se produjeron anticuerpos frente a las
cepas de referencia, R1, R2, R3, R5, R7, R10 y R12, así como para los aislamientos cubanos L2 y C9
(Tablas 1 y 2). El procedimiento para la preparación del inmunógeno y el esquema de inmunización
empleado fue el descrito por Calzadilla et al., (1991).

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La caracterización serológica se realizó mediante inmunodifusión doble en agar (IDD) según Ball,
(1990) y UMELISA Indirecto (Peralta et al., 1997), enfrentando cada aislamiento a los diferentes
antisueros producidos. Los ensayos, se realizaron con suspensiones bacterianas ajustadas a 108 ufc/ml
en solución fosfato salina (PBS). Para la IDD el antígeno fue tratado a 100 oC durante una hora y se
utilizó 1% de agarosa en solución salina. Los resultados obtenidos por UMELISA fueron procesados
estadísticamente, estableciéndose las diferencias significativas entre los distintos antígenos y
antisueros. Se realizó un análisis jerárquico de conglomerados (clusters). Los dendogramas se
construyeron por el método de Ward (Carpeta estadística del CENSA). Se realizó adicionalmente un
análisis de componentes principales.
II.4.4 Caracterización y diversidad genotípica mediante rep-PCR
Se determinaron los patrones de amplificación de las secuencias repetitivas dispersas en el genoma con
el iniciador BOXA1R ( 5'- CTACGGCAAGGCGACGCTGACG- 3') (Martin et al., 1992; Koeuth et al.,
1995), y con los iniciadores ERIC1R (5'- ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3') y ERIC2 (5'-
AAGTAAGTGACTGGGGTGACGG-3') (Kamoun y Kado, 1990; Hulton et al., 1991) y REP1R-I (5'-
IIIICGICGICATCIGGC-3') y REP2-I (5'-ICGICTTATCIGGCCTAC-3') (Higgins et al., 1982; Gilson
etal., 1984). Los iniciadores fueron sintetizados por la Operon Technologies Inc, California, E.U.

Las condiciones de amplificación utilizadas fueron establecidas a partir de las descritas por
Versalovic et al., (1991 y 1994), de Bruijn, (1992), Louws et al., (1994); Lópes et al., (1998) y Rademaker
et al., (1998).
Alícuotas de 6 µl de los productos de amplificación fueron separados en gel de agarosa 1.5% en solución
0.5X TBE conteniendo bromuro de etidio (0.5 µg/ml de gel), por 8 a 10 horas a 2.5 V/cm. La talla de los
fragmentos obtenidos fue comparado con el marcador de 100 pb (Promega). El gel fue fotografiado en
el fotodocumentador Image Master VDS ( Pharmacia- Biotech) sobre luz ultravioleta.
Para confirmar la reproducibilidad de los perfiles obtenidos, se realizó la amplificación de cada
aislamiento a partir de dos extracciones de ADN diferentes. Los perfiles únicos, considerados como
representantes de un haplotipo, fueron analizados conjuntamente a través del análisis visual de las
bandas. A partir de la presencia o ausencia de una banda en cada posición se confeccionó la matriz de
datos binarios (1 para presencia y 0 para ausencia). La matriz de coeficientes de similitud entre los
aislamientos estudiados fue calculada utilizando la métrica de Jaccard's y el dendograma por el
método de agrupamiento UPGMA (Paquete estadístico SPSS para Windows, versión 1.3, 1993). Se
realizó el análisis de los haplotipos obtenidos con cada iniciador individualmente, así como el análisis
combinado de los mismos.
II.5 Desarrollo y validación del diagnóstico molecular de X. albilineans mediante PCR anidada (n-
PCR)
II.5.1 Establecimiento del límite de detección con diferentes tipos de muestras
Para el montaje de la n-PCR se seleccionaron los iniciadores descritos por Davis et al., (1997),
diseñados a partir de la secuencia de un fragmento de ADN del complejo de genes albicidina (Rott et
al., 1996). Se estableció el límite de detección del ensayo a partir de suspensiones de ADN genómico
(100 ng-10 fg); suspensiones bacterianas (10-1 a 10-10) en agua estéril y jugo extraído de plantas sanas;

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difusato foliar y jugo extraído por centrifugación (10-1 a 10-5) de plantas con síntomas de la
enfermedad (Pan et al., 1997; Davis, et al., 1994). En todos los casos se trabajó con los aislamientos
C9 y B8 obtenidos de las variedades C120-78 y RB 955357. Se utilizó 1 µl de cada una de las diluciones
para la reacción de n-PCR . Se determinaron las unidades formadoras de colonias (ufc) detectadas en
la reacción de amplificación (Wang et al., 1999). Como controles negativos en cada ensayo fueron
utilizados agua estéril, difusato foliar y jugo filtrado de las plantas sanas, así como suspensiones
bacterianas y de ADN de X.axonopodis pv. vasculorum (S3).
Adicionalmente, alícuotas de 100 µl de cada dilución preparada del jugo y el difusato foliar fueron
tratadas por calor a 100oC durante 10 minutos en un baño de agua y mantenida a -20oC hasta su
utilización (Wang et al., 1999). Las condiciones de amplificación y de análisis de los productos del n-PCR
fueron las descritas en el epígrafe II.2.
II.5.2. Evaluación de la utilización de aplicadores de algodón
Teniendo en cuenta que uno de los mayores problemas para la utilización de técnicas avanzadas de
diagnóstico es la toma y conservación de las muestras, se evaluó la factibilidad de utilizar aplicadores
de algodón con este objetivo.
II.5.2.1 Establecimiento de las condiciones óptimas de conservación y el límite de detección de
la n-PCR utilizando los aplicadores de algodón
Se utilizaron aplicadores de algodón comerciales que fueron embebidos en 50 µl de las diferentes
muestras y diluciones anteriores, dejándolos secar durante una hora y conservándolos con
posterioridad a temperatura ambiente, 4, 28 y -20oC. Se prepararon tres réplicas de cada muestra a
las diferentes temperaturas y tiempos de conservación, evaluándose a los 15, 30 y 60 días de
conservados. En todos los casos se utilizaron como controles muestras frescas de la suspensión
bacteriana y jugos de plantas sanas y enfermas.
Se determinó el porcentaje de eficacia de la detección a los diferentes temperaturas y tiempos de
conservación, de acuerdo a lo establecido por Peralta y Villoch (1999).

II.5.2.2 Evaluación de diferentes variantes para la toma de la muestra
Fueron colectadas plantas infectadas y sanas de diferentes variedades, cuyos tallos fueron lavados y
separados los entrenudos. A partir de estos se obtuvieron 60 secciones internas del tallo, que fueron
divididas en dos partes, una de las cuales fue utilizada para extraer el jugo con auxilio de un alicate y
la otra para obtener el jugo por centrifugación. De cada una de las muestras fueron plaqueados 100 µl
en Agar Wilbrink para el aislamiento de la bacteria y alícuotas de 50 µl se embebieron en los
aplicadores de algodón, que fueron conservados a temperatura ambiente y evaluados a los 30 y 60 días.
Se utilizaron como controles positivos ADN y muestras frescas de la suspensión bacteriana del
aislamiento C9, así como jugo de tallo infectado extraído con alicate y por centrifugación. Como control
negativo se utilizó el jugo de tallo de las planta sanas, así como ADN y/o suspensión bacteriana de X.
axonopodis pv. vasculorum. En todos los casos las muestras fueron preparadas de acuerdo a los
procedimientos descritos anteriormente (epígrafe II.5.1).

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La comparación de las dos variantes de obtención de muestras se realizó sobre la base de los
parámetros de desempeño del ensayo en cada caso. Los indicadores de validación estimados fueron los
siguientes (Peralta y Villoch, 1999).
II.5.2.3 Evaluación de los aplicadores de algodón para el diagnóstico múltiple de escaldadura
foliar y el raquitismo de los retoños
Teniendo en cuenta que la escaldadura foliar y el raquitismo de los retoños constituyen las dos
enfermedades bacterianas más importantes de la caña de azúcar y la utilidad de abaratar los costos
del diagnóstico mediante un ensayo capaz de detectarlas simultáneamente, se evaluó la efectividad de
la detección de la n-PCR múltiple, utilizando los aplicadores de algodón para la toma y conservación de
las muestras.
A partir de variedades con síntomas de ambas variedades, se prepararon diluciones seriadas ( 10-1 a
10-4 ) en agua y por la mezcla en distintas proporciones de ambos jugos. Alícuotas de 50 µl de cada
dilución y de jugo sin diluir fueron absorbidos en los aplicadores de algodón y se conservaron a
temperatura ambiente y a -20oC. Se realizaron tres réplicas de cada dilución para ambas
temperaturas, evaluándose 90 aplicadores (muestras) a los 30 y 60 días.
La amplificación se realizó de acuerdo a lo descrito en el epígrafe II.2, con la adición de los iniciadores
específicos para Leifsonia xyli subsp. xyli (Astua-Monge et al., 1996). Se determinaron los parámetros
de desempeño del ensayo para la detección de ambas enfermedades, de acuerdo a lo descrito en el
epígrafe anterior.
III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
III.1 Descripción de síntomas y obtención de aislamientos
En los muestreos e inspecciones realizadas a partir de 1994, no se observaron síntomas típicos de esta
enfermedad, detectándose solamente infecciones latentes en variedades como la Ja60-5, RB 72454
y C 323-68 y esporádicamente la presencia de rayas blancas finas ("pencil lines"), fundamentalmente
en clones del Banco de Germoplasma. Los síntomas típicos de la fase crónica de la enfermedad (Ricaud
y Ryan, 1989; Rott et al., 1995) fueron observados a partir de febrero de 1998, caracterizandose por
la presencia de rayas blancas o amarillentas paralelas a las nervaduras, de ancho variable, que se
extendian hacia el borde de las hojas, provocando marchitamiento y necrosis foliar parcial o total.
Adicionalmente se observó un notable desarrollo de brotes laterales desde la base de los tallos y un
enrojecimiento en los vasos a nivel de los nudos e inclusive de los entrenudos. En algunas de las
variedades afectadas, como la L55-5, los síntomas fueron severos, llegando a ocasionar la muerte de
los tallos (Fig.1).
Los síntomas más severos y generalizados del brote actual de escaldadura se presentaron en el Banco
de Germoplasma de la EPICA de Jovellanos, donde fue encontrado el foco inicial de la enfermedad y
en la provincia de Camagüey. Con posterioridad se han observado incrementos discretos de focos en
áreas de otras provincias como Ciego de Ávila, La Habana y Pinar del Río.
La sintomatología que se ha presentado a partir de 1998 ha sido más severa que la informada por
Rivera et al., (1985) durante los años 1979-1982. A partir de los tallos, hojas y brotes de las

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diferentes variedades analizadas se obtuvieron 62 aislamientos bacterianos, cuya descripción aparece
en la Tabla 1.
III.2 Identificación de los aislamientos de X.albilineans mediante PCR anidada (n-PCR)
Los aislamientos cubanos obtenidos, fueron identificados como pertenecientes a la especie
X.albilineans, de acuerdo a la amplificación específica obtenida de fragmentos de ADN del complejo de
genes que codifican la síntesis de la albicidina (Fig. 2).
El valor de este ensayo para la identificación del agente causal de la escaldadura foliar ha sido
señalado por Rott et al., (1996), quienes demostraron que el complejo de genes involucrados en su
síntesis es altamente específico para la especie, única conocida hasta el momento como productora de
la mencionada toxina.
Nuestros resultados confirman la especificidad de esta prueba y demuestran su utilidad como criterio
de identificación molecular, de acuerdo a la tendencia actual debido a las limitaciones crecientes de las
pruebas fenotípicas para la identificación de las especies bacterianas fitopatógenas (Henson y French,
1993; Vauterin et al., 1995; Takatsu, 2000).

III.3 Patogenicidad en maíz
Las pruebas de patogenicidad realizadas en maíz permitieron la reproducción de los síntomas
característicos de la enfermedad. En las evaluaciones visuales no se observaron diferencias en la
respuesta provocada por cada aislamiento con respecto a las características de los síntomas y la
agresividad con que se desarrollaron los mismos. Los primeros síntomas de líneas blancas finas se
presentaron a los 5-7 días después de la inoculación, hasta llegar a tener los síntomas típicos de la
enfermedad. En todos los casos fue posible realizar el reaislamiento del patógeno, cuya identidad fue
confirmada mediante n-PCR (Davis et al., 1997).
Los síntomas obtenidos, constituyen una comprobación de la patogenicidad de los aislamientos cubanos
del brote actual. A pesar de no haberse detectado diferencias marcadas entre ellos, es necesario
continuar profundizando en este aspecto, particularmente en el análisis de su interacción con
diferentes variedades de caña de azúcar.
Hasta el momento no ha podido establecerse sin equívoco la existencia de razas patogénicas en esta
especie, pero sí de variantes serológicas y genómicas bien definidas. Es por ello que la tendencia actual
en los grupos que estudian esta enfermedad es delimitar, como primer paso, las variantes fenotípicas y
genotípicas existentes en la población del patógeno y con posterioridad evaluar la variación
intraespecífica desde el punto de vista patogénico de los aislamientos representativos de los grupos o
variantes establecidas (Clerc, 1997; Davis et al., 1997; Rott y Davis, 2000). Atendiendo a lo anterior,
los resultados de este trabajo constituyen la base sobre la que podrían estructurarse las
investigaciones futuras en cuanto a la escaldadura foliar en el país.
III.4 Caracterización y diversidad de los aislamientos de X.albilineans
III.4.1 Caracterización y diversidad morfológica

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Las características morfológicas de los aislamientos realizados se corresponden a las descritas para
esta especie (Ricaud y Ryan, 1989; Stanley y Williams, 1994). Las células son móviles con un único
flagelo polar, bacilares y Gram negativas. Las dimensiones de las células de los diferentes aislamientos
y cepas de referencia, fue de 0.39-0.83 x 1.28-1.84 µ, parámetros que coinciden con los descritos para
este especie (Holt, 1994).
Se encontró variabilidad tanto entre las cepas de referencia como entre los aislamientos cubanos, sin
relación directa con su procedencia, propiedades bioquímicas, serológicas o su manifestación
patogénica en el país. Los aislamientos procedentes de las variedades L55-5 (C1- C4) y C120-78 (C7-
C10), se encontraron variaciones en la longitud media de las células y la morfología de las colonias en
cultivo entre los aislamientos hechos a partir de hojas, brotes y tallos de una misma planta, e inclusive
entre los aislamientos obtenidos de un mismo tallo.
En medio Agar Wilbrink, las colonias se observaron a los 4-7 días después de la siembra, pequeñas,
circulares, lisas, convexas, de bordes enteros, brillantes, translúcidas y de color amarillo pálido. No
crecieron en medio Agar Nutriente, ni produjeron mucosidad al crecer sobre cuñas inclinadas de medio
YDC. La información sobre variabilidad morfológica de esta especie y su correlación con las variaciones
serológicas, moleculares y patogénicas de los aislamientos es muy limitada en el ámbito internacional.

III.4.1.2 Caracterización y diversidad bioquímica y fisiológica
Las pruebas bioquímicas realizadas confirmaron la presencia de la especie X. albilineans, presentando
coincidencia en general para los aislamientos obtenidos. Se observaron espectros de absorción típicos
del pigmento xanthomonadina,, los cuales presentaron un pico máximo de absorbancia a 443, 7 nm, lo
que se corresponde con lo descrito para el género Xanthomonas (Holt et al., 1994). Los resultados de la
caracterización bioquímica se presentan en la Tabla 3.
Se encontró una total coincidencia entre las propiedades bioquímicas en la población bacteriana
estudiada, con la excepción producción de ácido a partir de fructosa y la utilización de la gelatina,
destacándose en este sentido las cepas C4 y C10, que también mostraron diferencias morfológicas en
sus colonias y células de mayor longitud. Estos resultados confirman lo señalado por otros autores
(Yang et al., 1993; Vauterin et al., 1995), sobre la homogeneidad de las propiedades bioquímicas y
fisiológicas de esta especie.
III.4.3 Caracterización y diversidad serológica
Los aislamientos realizados durante la fase latente de la enfermedad se diferencian de la mayoría de
los circulantes actualmente. El análisis estadístico de los resultados obtenidos con diferentes
antisueros y cepas cubanas y de referencia mediante la técnica UMELISA Indirecto, estableció la
formación de tres grupos serológicamente bien diferenciados (Fig. 3).
Las notables diferencias antigénicas de los aislamientos de la fase latente con respecto a los obtenidos
a partir de los focos recientes de la enfermedad fueron claramente establecidas en los ensayos de
inmunodifusión, mostrando patrones de precipitación de total identidad con las cepas de referencia R3
y R4. Los antisueros del aislado C9 y las cepas del serovar I, reaccionaron positivamente al enfrentarse

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a sus antígenos homólogos y las cepas R1 y R2, pero no con los aislados latentes ni las cepas de
referencia francesas.
Resultados similares fueron obtenidos por UMELISA Indirecto (Fig. 4). Las evaluaciones realizadas
han demostrado que la mayoría de los aislados bacterianos circulantes en los focos recientes de la
enfermedad pertenecen al serovar I, no identificado con anterioridad en nuestro país. No obstante, se
detectaron variaciones antigénicas entre los aislamientos del propio serovar.
Adicionalmente, los aislados de la fase latente fueron identificados como serovar III. Los restantes
aislamientos que mostraron diferencias antigénicas con los dos grupos anteriores, han presentado una
reacción semejante con los antisueros de las cepas R7, R10 y R12, por lo que no es posible identificarlos
hasta el momento dentro de alguno de los serovares conocidos. Es por ello que se hace necesario
ampliar el estudio con nuevos antisueros producidos frente a un mayor número de cepas pertenecientes
a estos serovares para lograr su identificación definitiva.
Los resultados de este trabajo establecen por primera vez la presencia en Cuba de los serovares I y
III y demuestran la diversidad antigénica de la población cubana de X. albilineans. Coincidentemente,
la presencia de diferentes serovares ha sido registrada también en Guadalupe, Martinica y las Islas
Saint Kitts (Daugrois, 1993; Rott et al., 1994).
De los tres serovares identificados, el I (Mascarena), es el más representado en la mayoría de los
aislamientos circulantes en el mundo actualmente, habiéndose demostrado la variabilidad dentro del
propio serovar (Autrey et al., 1993; Rott et al., 1994; Alvarez et al., 1996). En nuestro trabajo se
demuestra que éste constituye el serovar predominante entre los aislamientos del brote actual de
escaldadura, lo que lo vincula directamente al resurgimiento de la enfermedad en el país.
Los resultados obtenidos en este trabajo determinan la necesidad de introducir cambios en el sistema
nacional de diagnóstico de la escaldadura foliar, con vistas a garantizar la adecuada detección de las
variantes serológicas identificadas. Tales modificaciones incluyen la utilización de antisueros
específicos para los serovares I y III. De acuerdo a las evaluaciones realizadas, los antisueros C9 y
L2 son capaces de detectar la gama de aislamientos circulantes en la actualidad en el país y funcionan
adecuadamente en el sistema UMELISA, establecido para la evaluación de los donantes y líneas del
programa nacional de micropropagación de la caña de azúcar,y de los materiales sometidos a
cuarentena. Estas modificaciones han sido convenientemente analizadas con los órganos científicos y
productivos del MINAZ, habiéndose comenzado ya su implementación.

III.3.2 Caracterización y diversidad genotípica mediante rep-PCR
En este trabajo, el patrón electroforético generado por la amplificación de las secuencias conservadas
y repetitivas en el ADN genómico de X. albilineans resultó en múltiples bandas, con variación en el
tamaño de aproximadamente 260 a 1700 pb con el iniciador BOX, 270 a 1800 pb con ERIC y 200 a
1200 pb para REP. Con los iniciadores REP fue posible la amplificación de un mayor número de
fragmentos por aislamiento. La comparación de los patrones de amplificación, reveló la presencia de 12
haplotipos con los iniciadores ERIC (E1-E12), 19 con BOX (B1-B19) y 22 con REP (R1-R2), de los cuales
B1-B7, E1-E5 y R1-R6 representan los aislamientos cubanos (Tabla 4).

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Es de señalar que los iniciadores BOX y ERIC, agruparon en los haplotipos B2 y E2 al 75.8% y 62.9%
de los aislamientos obtenidos en el brote actual y las cepas de referencia R7 y R8, representativas del
haplotipo B-01 (PFGE) procedentes de Texas y la Florida. Por otra parte, en los haplotipos B1 y E1
están representados los aislamientos de la fase latente de la enfermedad y las cepas de referencia R3,
R4 y R16 de Francia. Sin embargo el polimorfismo revelado por los iniciadores REP los agrupó en
haplotipos diferentes, aunque con una homología superior al 90%. Las Figuras 5 muestran patrones de
amplificación representativos de los diferentes haplotipos obtenidos con los iniciadores BOX y ERIC
respectivamente. Las otras especies patógenas a caña de azúcar, mostraron patrones únicos y
distintivos.
El análisis de los haplotipos combinados resultó en la formación de 28 grupos genómicos (GG-1 a GG-
28) entre los aislamientos de X. albilineans estudiados, estando la población cubana representada por
once de los mismos (GG-1 a GG- 11), diez de ellos correspondientes a los del brote actual (Tabla 4).

El 85.48% de estos aislamientos, representados en 7 de los grupos genómicos establecidos,
presentaron una homología superior al 91% con las cepas de referencia de la Florida (R8) y la de Texas
(R7), ambas representantes del haplotipo B-01 (PFGE) y responsables del explosivo resurgimiento de la
escaldadura en esa región. El grupo GG-1 (cepas "latentes"), mostró una homología de 97% con el GG-17
que representa las de referencia procedente de Francia, los cuales a su vez presentaron la mayor
homología (88%) con el haplotipo G-01. Por otra parte los grupos GG-3 y GG-6 se agruparon con el
haplotipo B-06, con un 88 y 84% de homología respectivamente, mientras que el GG-10 presentó un
85% de similitud con el haplotipo E-01, ambos procedentes de Guadalupe (Fig.6).
Los grupos más numerosos, heterogéneos y representados en las diferentes localidades fueron GG-2 y
GG-4, presentes en cinco provincias, que agrupan el 62,9% de los aislamientos estudiados. Por el
contrario los grupos GG-3, GG-5, GG-8, GG-9, GG-10 y GG-11 están representados en una sola provincia.
Aunque se obtuvieron variantes genómicas entre los aislamientos del brote actual, se evidencia la
predominancia de un mismo patrón, fundamentalmente entre los de la provincia de Matanzas, lugar
donde surgió el primer brote de la enfermedad y en el que el 74.35% de los aislamientos está
representado por los haplotipos B2 y E2, y el 84.6% por la suma de los haplotipos mayoritarios R2 y R4,
con independencia de la variedad o clon del que se obtuvo el aislamiento. El patrón observado en estos
aislamientos también está presente en los de otras provincias.
Estos resultados indican que los grupos GG-2 y GG-4 han sido los responsables del resurgimiento de la
enfermedad en el país. El hecho de encontrarlos representados en otras provincias, sugiere que se han
diseminado rápidamente en nuestras condiciones a partir del foco inicial.
La prevalencia de estos grupos dentro de la población cubana de X.albilineans, su alto nivel de
homología con el haplotipo B-01 y la identificación de gran parte de los aislamientos que lo forman como
serovar I, sugiere que el brote actual de escaldadura foliar en Cuba tiene un origen similar a los
ocurridos recientemente en la Florida, Guadalupe, Louisiana y Texas.
La mayor variabilidad genética en las diferentes provincias pudo apreciarse en Matanzas y la Habana,
ambas con 6 grupos. Estos grupos pudieran estar vinculados a variantes presentes en el país y no
detectadas con anterioridad o a múltiples introducciones del patógeno.

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De igual forma se estableció la presencia de diferentes grupos genómicos en aislamientos de la misma
variedad. Se destaca en este sentido que sólo en el caso de la C 88-382, aislamientos de diferentes
localidades coincidieron genéticamente. Las mayores variaciones se encontraron en C120-78 y C323-
68, esta última incluyendo la cepa L3 de la fase latente. Aunque es necesario profundizar en este
aspecto, llama la atención la presencia de los grupos genómicos 2 y 3 en las variedades L55-5 y C120-
78, que presentaron los síntomas más severos de la enfermedad en el foco inicial y también
aislamientos con diferencias morfológicas y bioquímicas, aspectos que deben tenerse en cuenta para los
futuros estudios de patogenicidad.
III.5 Desarrollo y validación del diagnóstico molecular de X. albilineans mediante PCR anidada
(n-PCR)
III.5.1 Establecimiento del límite de detección con diferentes tipos de muestras
La utilización de los iniciadores seleccionados, permitió la amplificación de los dos fragmentos
específicos a X.albilineans (400 y 308 pb) a partir de las diferentes muestras analizadas. El límite de
detección determinado a partir del ADN fue de 0.1pg, mientras en las suspensiones bacterianas puras
fue de 1-2 ufc/reacción (2×103 ufc/ml). A partir de los difusatos foliares y jugos de tallos se obtuvo
amplificación hasta la dilución 10-4, lo que representó concentraciones de 2-4 ufc/reacción
(4x103ufc/ml). No se encontró amplificación con los controles negativos utilizados.
A partir del difusato foliar y el jugo de caña, los mejores resultados fueron obtenidos con las muestras
diluídas y tratadas con calor, tratamiento que probablemente destruye los inhibidores de la PCR
(Prosen et al., 1993
Los resultados obtenidos, superan el límite de detección descrito por otros autores que utilizan la PCR
clásica para el diagnóstico de esta especie, el cual ha sido de 5-10 ufc/reacción y 0.3pg de ADN
(Honeycutt et al.,1995; Pan et al.,1997, 1998). La n-PCR evaluada en este trabajo, además de
altamente específica para X.albilineans, resultó más sensible para el diagnóstico del patógeno que la
BIO-PCR descrito anteriormente (,Wang et al., 1999), ventaja importante para el análisis de donantes
de los procesos de micropropagación y la evaluación de variedades de interés sometidas a cuarentena
post-entrada.
III.5.2 Evaluación de la utilización de aplicadores de algodón.
III.5.2.1 Establecimiento de las condiciones óptimas de conservación y el límite de detección de
la n-PCR utilizando los aplicadores de algodón
En la Fig. 7 se observan los productos de PCR (440 y 308 pb) obtenidos al analizar cada una de las
muestras conservadas durante 60 días en los aplicadores de algodón a las diferentes temperaturas.
Todas las muestras conservadas hasta los dos meses a las temperaturas evaluadas, resultaron
positivas, para un 100% de eficacia. Se considera en este caso como definitivo el producto interno de
la segunda amplificación, aspecto en el cual radican las ventajas de la n-PCR con relación al PCR clásico
(Schadd et al.,(1995).
Estos resultados establecen la factibilidad del uso de los aplicadores de algodón como forma de toma
y conservación de los jugos de tallos para su análisis mediante n-PCR, sin afectar el diagnóstico de la
enfermedad. El límite de detección obtenido en estos ensayos fue similar al señalado anteriormente

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para la n-PCR a partir de la suspensión bacteriana y de las diluciones del jugo de plantas con síntomas
típicos de la enfermedad.
Los parámetros de desempeño determinados sobre la base de los resultados experimentales, muestran
la potencialidad del uso de los aplicadores de algodón como una solución a las limitaciones de la toma,
transporte y conservación de las muestras para el diagnóstico masivo de la enfermedad con grandes
perspectivas de aplicación en los programas de mejoramiento genético y de producción de semilla
certificada.
Este método ha sido extensamente utilizado en medicina humana y veterinaria (Ushijima et al, 1994;
Krepel et al, 1995; Marquard et al, 1995; Stone et al, 1995; Sykes et al,1998; Vitale et al,1998; Moss y
Haas, 1999), pero no se refiere su uso para el diagnóstico fitosanitario, por lo que los resultados
expuestos en este trabajo constituyen el primer informe sobre su utilización para el diagnóstico de
fitopatógenos.
III.5.2.2 Evaluación de diferentes variantes para la toma de la muestra
La extracción de la muestra por centrifugación permitió obtener mejores resultados, con 95% de
sensibilidad, 100% de especificidad y 97,5% de eficacia. La extracción por alicate disminuye la
sensibilidad del ensayo hasta un 86,66%.
Wang et al (1999) señalaron que los resultados de la n-PCR eran comparables a los del aislamiento in
vitro. Nuestros resultados demuestran que ambas técnicas son igualmente eficaces para el diagnóstico
de X. albilineans, con indicadores de validación superiores al 98% (100% de especificidad, 98,3% de
sensibilidad y 99,16% de eficacia). Aunque estos disminuyen ligeramente al introducir la utilización de
los aplicadores para la toma de la muestra, los parámetros de desempeño estimados demuestran que
puede ser empleada para el diagnóstico con una elevada eficacia (100% de especificidad, 95% de
sensibilidad y 9,5% de eficacia, Tabla 5).
III.5.2.3 Evaluación de los aplicadores de algodón para el diagnóstico múltiple de escaldadura
foliar y raquitismo de los retoños
Se obtuvo la amplificación de los dos fragmentos que identifican a X.albilinenas y el de 229 pb
específico para y L.xyli subsp.xyli, tanto en muestras infectadas por uno de los patógenos como en
aquellas en que se mezclaron los jugos infectados de ambas (Fig.8).
Al emplear aplicadores conservados a -20oC, los parámetros de desempeño del ensayo son superiores al
95%, con un 97.78% de eficacia para la detección de estas especies bacterianas. La conservación a
temperatura ambiente de los aplicadores afecta particularmente la sensibilidad de la detección de
L.xyli subsp.xyli.
Aunque la validación de este procedimiento de detección simultánea es susceptible de ser mejorado
con la evaluación de un mayor número de muestras, los resultados preliminares obtenidos en este
trabajo, demuestran que es posible utilizarlo para detectar la presencia de ambos patógenos en
muestras de tallos infectados conservadas en los aplicadores de algodón durante dos meses a -20º C
con una elevada eficacia.

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Es de señalar el interés práctico de este resultado que contribuye a reducir el tiempo y el costo del
diagnóstico de las dos enfermedades bacterianas más importantes del cultivo en la actualidad.

IV. CONCLUSIONES
• Se demostró que el brote actual de escaldadura en Cuba ha sido producido por nuevas variantes de
la bacteria no detectadas con anterioridad en el país, determinándose que el 85.48% de los



aislamientos obtenidos presentaron una homología superior al 91% con las cepas de referencia del
grupo genómico B-01 (PFGE) de la Florida y Texas, identificados como los causantes del explosivo
resurgimiento de la enfermedad en áreas de la región.
Se demostró que los aislamientos cubanos procedentes de infecciones latentes difieren serológica
y molecularmente de los involucrados en el resurgimiento de la enfermedad en 1998.
Se determinaron variaciones entre los aislamientos cubanos con respecto a la producción de ácido a
partir de fructosa, la utilización de la gelatina, la morfología de las colonias y la longitud de las
células bacterianas, no encontrándose una correspondencia directa entre éstas y las
características serológicas y moleculares de los aislamientos.
Se estableció la presencia en el país de los serovares I y III de Xanthomonas albilineans.
Los iniciadores BOX y ERIC, agruparon en los haplotipos B2 y E2 al 75.8% y 62.9% de los
aislamientos obtenidos en el brote actual y las cepas de referencia R7 y R8, representativas del
haplotipo B-01 (PFGE) procedentes de Texas y la Florida. Por otra parte.
En los haplotipos B1 y E1 están representados los aislamientos de la fase latente de la enfermedad
y las cepas de referencia R3, R4 y R16 de Francia
Se identificaron once grupos genómicos entre los aislamientos cubanos de X. albilineans (GG1-
GG11) que están formados por los haplotipos combinados BOX, ERIC y REP
Los grupos genómicos GG2 y GG4 agruparon el 62.9% de los aislamientos estudiados y presentan la
mayor distribución nacional, encontrándose en cinco provincias.
En las variedades L55-5, C120-78, C323-68, C1051-73, Ja60-5, Ja64-19 y RB72454 se encontró la
presencia de más de un grupo genómico de X. albilineans.
Se demostró que el procedimiento de PCR anidada validado es igualmente eficaz que el aislamiento
in vitro del patógeno y permite la detección de las diferentes variantes de X. albilineans
presentes en el país con parámetros de desempeño superiores al 98%.
Se registra por primera vez el uso de aplicadores de algodón para la toma y conservación de de
muestras, demostrándose su utilidad para el diagnóstico de la escaldadura foliar con una elevada
eficacia.

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Wang, ZK.; Comstock, E.; Hatziloukas and Schaad, NW.(1999). Comparison of PCR, Bio-PCR, DIA,
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Wilbrink, G. (1920). De Gomziekte van het Suikerriet, hare Oorzaak en hare
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ANEXOS

Tabla 1.
Aislamientos de X. albilineans obtenidos durante la fase latente y el brote
actual de la enfermedad a partir de variedades de caña de azúcar procedentes de diferentes
localidades.

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Leyenda:
SS:
SF:
BL:

SIT:
MuT:
(1):

*:
**:
H:
T:
Br:
Th:
Cm:
Sin síntomas.
Síntomas foliares (presencia de rayas blancas de ancho variable; necrosis foliar).
desarrollo de brotes laterales desde la base del tallo, con la presencia, por lo general, de rayas blancas
finas en las hojas de los brotes.
Síntomas internos de los tallos (haces vasculares de coloración roja).
Muerte de tallos.
Estas variedades presentaron síntomas típicos y fueron cortadas. Se muestrearon dos meses después del
corte, sin síntomas visibles.
Aislamientos utilizados para la caracterización morfológica, bioquímica y patogénica.
Aislamientos recibidos del Laboratorio Central de cuarentena sin otras referencias.
Hojas
Tallos
Brotes
Tratamiento hidrotérmico
Cultivo de meristemos

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Tabla 2. Cepas de referencia de X. albilineans y otras especies utilizadas en los estudios de
caracterización y diversidad.

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Leyenda:
IBC = Instituto Biológico de Campinas, Sao Paulo, Brasil; ESSC = Estación Experimental de Caña de
Azúcar, Africa del Sur; CCBP= Colección CIRAD-CA de Bacterias Fitopatógenas, Montpellier, Francia; LAFIMEG=
Laboratorio de Fitopatología Molecular e Ingeniería Genética, Araras, Brasil; BSES= Buró de Estaciones
Experimentales de Caña de azúcar, Australia; LBV = Laboratorio de Bacteriología Vegetal, CENSA.

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Figura 1. Principales
síntomas observados en cañas enfermas con escaldadura
foliar en la EPICA “Antonio Mesa” (variedades L 55-5, C 120-
78).

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M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
440 pb
308 pb
a

b

c

d
Figura 2.
Identificación de los aislamientos cubanos de X. albilineans mediante n-PCR
a) 1-15 (R1-R15); 16-18 (L1-L3); 19-23 (C1-C5); b) 1-23 (C6-C28); c) 1-23 (C29-C51); d)1-
11 (C52-C62); 12-18 (S1-S7)

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440 pb
308 pb
a

b

c

d

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Tabla 3. Resultados de la caracterización bioquímica de los aislamientos seleccionados

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Leyenda:
O: oxidativo
+: reacción positiva
-: reacción negativa
(d): del 11 al 89% de los aislamientos son negativos para la especie

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Figura 3.
Dendograma que muestra el comportamiento de diferentes aislamientos
cubanos frente al antisuero de la cepa R7 (AsR7). Se distingue la
diferenciación de los aislamientos de la fase latente, poniéndose en
evidencia además diferencias entre los aislamientos del brote actual en su
reacción con este antisuero.

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C3
C4
C5
C6
C7
C9
R3
R5
R7
C34
C38
C43
R9
L3
60

50

40

30

20

10

0
Valores
de
fluores-
cencia
Aislamientos
AsR5
AsR7
AsR9
Figura 4.
Variaciones intraespecíficas detectadas en aislamientos cubanos y cepas de
referencia pertenecientes al serovar I mediante UMELISA Iindirecto.
En
la figura aparecen algunas de las cepas de referencia y aislamientos evaluados,
en las que puede apreciarse un comportamiento diferente de los aislamientos y
cepas de referencia con respecto a los distintos antisueros utilizados. C38, L3
y R3 no pertencen al serovar I.

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Figura 5: Patrones característicos de los aislamientos cubanos de X. albilineans
seleccionados (A: BOX; B: ERIC).
De izquierda a derecha:




A
B
Marcador 1Kb
Aislamientos de referencia R1, R2, R3, R4 y R16 (Brasil, A. Sur y Francia)
Aislamientos cubanos: L2, C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C34, C33, C47, C50, C41,
C44, C45, C48, C55, C59
Marcador 1Kb
X.c.pv. vasculorum (S3)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 111213 14151617181920 21222324
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 111213 14151617181920 21222324
2526272829
HB
HB
HB
2526272829
HB
HB
HB

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Tabla 4.
Grupos genómicos establecidos entre los aislamientos de X. albilineans mediante
la utilización de los iniciadores BOX, ERIC y REP (rep-PCR).

PR (Pinar del Río), H (Habana), M(Matanzas), C(Camagüey), CA(Ciego de Ávila), T
(Tunas)

Partes: 1, 2
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