Cinética del crecimiento (página 2)

"El aumento de volumen con la humedad tiene un
límite. Este va creciendo hasta que la célula
alcanza un porcentaje de humedad que corresponde al punto de
saturación de la pared celular, aproximadamente del 30 %
para todas las especies en cálculos técnicos. A
partir de éste valor el
volumen permanece constante, ya que el agua que
penetra en el volumen de las células no produce
hinchamiento de la pared celular. Por lo tanto, el valor del 30 %
es un valor para utilizarlo prácticamente, si bien cada
especie tiene su punto de saturación de la pared celular"
(2). No sucede así con el peso, cuyo valor sigue
aumentando hasta alcanzar el contenido máximo de agua para la
especie correspondiente. Como consecuencia de lo anteriormente
expuesto, se definen, para una célula los siguientes pesos
específicos:

PESO ESPECÍFICO ANHIDRO:

ρ0 = Peso
anhidro (Ec. 10.2.1.1)

Volumen Anhidro

PESO ESPECÍFICO A H% DE
HUMEDAD:

ρk = Peso al
H% de humedad (Ec. 10.2.1.2)

Volumen al H% de humedad

Cuando la humedad es del 12 %,se llama peso
específico normal.

PESO SECO VOLUMÉTRICO
SATURADO:

Rs = Peso anhidro (Ec.
10.2.1.3)

Volumen a H%

Cuando la humedad H es superior al punto de
saturación de la pared celular.

PESO SECO VOLUMÉTRICO
HÚMEDO:

Rk = Peso anhidro (Ec.
10.2.1.4) Volumen a H%

Siendo, en este caso, la H inferior al punto de
saturación de la pared celular.

El volumen ocupado por los huecos se determina por
desplazamiento de fluidos, por lo que estos no deben reaccionar
con la pared celular para obtener un valor exacto del mismo. Se
suelen emplear el agua o el helio, siendo este naturalmente
más exacto al ser el helio un gas
inerte.

El agua, como veremos, es sorbida molecularmente por la
pared celular, produciendo una compresión de la misma que
enmascara el valor obtenido, cuyo efecto estudiaremos con la
hinchazón. Con respecto al peso específico real de
la célula, o más exactamente peso específico
de la pared celular, después de numerosos estudios, se ha
encontrado que, con pequeñas variaciones, se puede
considerar para todas las células prácticamente
igual a 1,56.

10.2.2. ABSORCIÓN:

Cuando un haz de luz paralelo
(colimado) golpea una partícula en suspensión,
parte de la luz es reflejada, parte es diseminada, parte es
absorbida y parte es transmitida. La nefelometría mide la
luz dispersada por una solución de partículas. La
turbidimetría mide la luz dispersada como un decrecimiento
de la luz transmitida a través de la solución. Con
relación a la longitud de onda y al tamaño de la
partícula pueden existir tres tipos de
dispersión.

Los métodos de dispersión de la luz son
las técnicas
más utilizadas para monitorear el crecimiento de los
cultivos bacterianos. Son muy útiles y poderosos pero
pueden llevar a resultados erróneos. Principalmente, dan
información sobre el peso seco (contenido
macromolecular).

Turbidimetría: La turbidimetría
mide la reducción de la transmisión de luz debido a
partículas de una suspensión y cuantifica la luz
residual transmitida.

Estudios teóricos y experimentales han mostrado
que soluciones
diluidas de diferentes tipos de bacterias, independientemente del
tamaño celular, tienen casi la misma absorbancia por
unidad de concentración de peso seco. Esto quiere decir
que, en soluciones diluidas, la absorbancia es directamente
proporcional al peso seco, independientemente del tamaño
celular del microorganismo.

Sin embargo, se encuentran absorbancias muy diferentes
por partícula o por UFC (Unidad Formadora de Colonia)
cuando los tamaños de las células bacterianas son
diferentes. Por esta razón, para estimar el número
de microorganismos totales o el número de microorganismos
viables de una suspensión bacteriana debe realizarse una
"curva de calibración" con cada tipo de microorganismo,
sólo de esta forma es posible relacionar Absorbancia
(Densidad
Óptica)
con el número de microorganismos totales o con
UFC.

Fig. 10.2.2-1 Absorbancia en función
del Peso Seco

Absorbancia = K x Peso Seco (Ec.
10.2.2.1)

K: constante que varía con la longitud de
onda utilizada y representa la inversa del peso seco del
microorganismo que produce un aumento de 10 veces en el valor de
la absorbancia(1/W0).

Peso seco: Concentración celular
bacteriana expresada en unidades de peso seco
(µg/ml-mg/ml).

La relación directa entre la absorbancia y el
peso seco sólo se aplica para suspensiones diluidas de
bacterias. Estas suspensiones no deben tener una absorbancia
mayor a 0.3, ya que valores
mayores producen desviaciones de la ley de Beer. Sin
embargo, el inconveniente de utilizar suspensiones diluidas puede
involucrar un mayor error de pipeteo y menor sensibilidad por el
bajo nivel de absorción.

Fig. 10.2.2-2 Absorbancia en función del Peso
Seco

Fig. 10.2.2-3 Absorbancia en función del Número
de Microorganismos Totales

En estos gráficos se puede apreciar que suspensiones
diluidas de dos microorganismos diferentes con igual peso seco
tienen la misma absorbancia, mientras que para el mismo
número de microorganismos totales la absorbancia de cada
suspensión es distinta.

10.2.3. PESO HÚMEDO:

Se obtiene a partir de una muestra en suspensión
que es pesada luego de la separación de las células
por filtración o centrifugación. Es una
técnica útil para grandes volúmenes de
muestra. La principal desventaja es que el diluyente queda
atrapado en el espacio intercelular y contribuye al peso total de
la masa. La cantidad de líquido retenida puede ser
importante, por ejemplo, un pellet de células bacterianas
muy empaquetadas puede contener un espacio intercelular que
aporta entre el 5-30% del peso, de acuerdo a la forma y
deformación celular.

Para corregir el peso húmedo se determina la
cantidad de líquido que queda retenida en el espacio
intercelular luego de una centrifugación, para ello se
utilizan soluciones de polímeros no iónicos (como
el Dextran) que pueden ingresar en el espacio intercelular pero
no pueden atravesar las paredes bacterianas.

10.2.4 VOLUMEN DE CÉLULAS EMPACADAS Y
NÚMERO DE CÉLULAS:

El crecimiento de una población bacteriana puede
ser entendido desde diferentes perspectivas y de acuerdo a
éstas se puede llegar a determinar la medida del
crecimiento mediante diversas metodologías. Para algunos,
el crecimiento es la capacidad para multiplicarse que tienen las
células individuales, esto es iniciar y completar una
división celular.

De esta forma, se considera a los microorganismos como
partículas discretas y el crecimiento es entendido como un
aumento en el número total de partículas
bacterianas. Existen dos formas para determinar el número
total de microorganismos en una muestra:

• Recuento microscópico de
  partículas
• Recuento electrónico de
  partículas

Para otros, el crecimiento implica el aumento de los
microorganismos capaces de formar colonias debido a que
sólo se tiene en cuenta el número de
microorganismos viables, esto es capaces de crecer
indefinidamente. Las determinaciones que se utilizan
son:

• Recuento de colonias
• Método del número más
  probable

Para los fisiólogos bacterianos,
bioquímicos y biólogos moleculares una medida del
crecimiento es el incremento de biomasa. Para ellos, la síntesis
macromolecular y un incremento en la capacidad para la
síntesis de los componentes celulares es una medida del
crecimiento. Para este grupo la
división celular es un proceso
esencial pero menor que rara vez limita el crecimiento, ya que lo
que limita el crecimiento es la capacidad del sistema
enzimático para utilizar los recursos del
medio y formar biomasa.

10.2.5.1. RECUENTOS DIRECTOS:

RECUENTO MICROSCÓPICO:

Es una técnica común, rápida y
barata que utiliza un equipamiento fácilmente disponible
en un laboratorio de microbiología. Para estos recuentos se
utilizan generalmente cámaras de recuentos, aunque
también pueden realizarse a partir de muestras filtradas
en membranas y transparentizadas o teñidas con colorantes
fluorescentes (Naranja de acridina).

La mayor dificultad del recuento en cámara es
obtener reproductibilidad en el llenado de la cámara con
líquido. Otra dificultad es la adsorción de las
células en las superficies del vidrio,
incluyendo pipetas.

Esta adsorción es crítica en el proceso de
dilución de la muestra y se minimiza al realizar las
diluciones en medios de alta
fuerza
iónica (solución fisiológica o medios
mínimos sin fuente de carbono).

Las cámaras más utilizadas son las de
Hawksley y la de Petroff-Hausser. La primera tiene
la ventaja que puede ser utilizada con objetivos de
inmersión, aunque la mayoría de los recuentos se
realizan con objetivos secos.

Una de las mayores ventajas del recuento
microscópico es brindar información adicional sobre
el tamaño y la morfología
de los objetos contados.

Fig. 10.2.5.1-1 Cámara de
recuento de Petroff-Hausser

Tabla 10.2.5.1-1 Recuento de
Microorganismos

(Ec. 10.2.5.1)

1/Dilución: Inversa de la dilución
utilizada para llenar la cámara de recuento.

Número de cuadrados contados: Cantidad de
cuadrados de la cámara que se utilizaron para contar un el
número de bacterias.

Volumen del cuadrado: Volumen de cada cuadrado de
la cámara. Depende del tipo de cuadrado en donde se
realizó el recuento. Por ejemplo, cada cuadrado
pequeño tiene un volumen de 5 x 10-8 ml (50 µm x 50
µm x 20 µm = 5 x 104 µm3 = 5 x 10-8
ml)

RECUENTO ELECTRONICO:

Los contadores electrónicos permiten realizar
recuentos de bacterias, levaduras no filamentosas y protozoarios,
pero no de hongos y
microorganismos filamentosos o miceliares. Estos instrumentos
constan básicamente de dos compartimientos comunicados a
través de un pequeño conducto.

En ambos compartimientos hay electrodos que miden la
resistencia
eléctrica del sistema, y como el orificio del conducto es
muy pequeño y su resistencia es muy alta, la resistencia
eléctrica de cada compartimiento es
independiente.

El principio de funcionamiento de estos instrumentos es
el que se explica a continuación. Un volumen fijo de una
suspensión bacteriana es forzada a pasar desde un
compartimiento al otro a través del pequeño
conducto, en un muy breve intervalo de tiempo. Cuando un
microorganismo pasa al nuevo compartimiento, la resistencia de
éste se incrementa debido a que la conductividad de la
célula es menor que la del medio. Estos cambios en la
resistencia son convertidos en pulsos o voltaje y contados. Este
tipo de recuento presenta algunos inconvenientes.

Ciertas bacterias muy pequeñas producen cambios
en la resistencia que son comparables al "ruido"
generado por la turbulencia que se desarrolla al pasar el fluido
por el orificio. No pueden medirse células que formen
filamentos o agregados o soluciones muy concentradas de
microorganismos, debido a que el pasaje de más de una
célula en un breve período de tiempo va a ser
tomado como una célula más grande. Es común
la obstrucción del orificio por microorganismos muy
grandes.

10.2.6. MASA DE UN COMPONENTE
CELULAR:

"Debido a que la célula no es tan "lista" (no
sabe contar hacia atrás en el tiempo) ni tiene el don de
la predicción (los humanos tampoco, para la mayor parte de
las cosas importantes). La bacteria tampoco sabe "contar hacia
adelante", ya que el tiempo de inicio de una ronda de
replicación no guarda una relación sencilla con la
división celular previa." (3)

Entonces, ¿cómo se acoplan división
celular y replicación cromosómica? Una clave hacia
la respuesta a esta pregunta es que la razón
(proporción) entre orígenes de replicación y
masa celular en el inicio (inmediatamente antes de la
replicación) es igual para todas las tasas de crecimiento.
He aquí un modelo
hipotético sobre el mecanismo de coordinación entre ambos eventos del ciclo
celular:

El sistema de coordinación detecta la
concentración de orígenes de replicación;
conforme la bacteria crece, esta concentración va
descendiendo, hasta que se alcanza un valor umbral crítico
que desencadena una nueva onda de replicación. Ello hace
que se doble el número de orígenes. Una ulterior
ronda no se pone en marcha hasta que el crecimiento haga de nuevo
descender la concentración de orígenes.

Se trataría, pues, de una especie de reloj
biológico y "oscilador" que usaría como medida del
tiempo el parámetro de masa celular, volumen, u otro
equivalente, de tal modo que la concentración
crítica de un factor iniciador o la dilución de un
represor servirían para disparar la replicación a
una concentración determinada.

Es fácil comprobar en los cultivos bacterianos
que cuanto más rico es un medio, y por lo tanto menor es
el tiempo de generación (g), mayor es el tamaño
medio de las células:

2. bacterias creciendo en un medio relativamente pobre
   (supongamos que en este medio g = 60min, C+D=g);
3. si transplantamos una célula recién
   dividida procedente del cultivo anterior a un medio más
   rico (por ejemplo, que permite un tiempo de generación g
   = 35min) podemos observar que:

• la primera división ocurre C+D (60 minutos)
  después; es decir, con un tiempo idéntico al que
  tenía en el medio anterior;

• pero como en este medio g = 35min, la
  iniciación de una nueva ronda de replicación
  ocurre antes de dicha replicación celular (es decir, C y
  D se superponen);
• se observa que se alcanza un nuevo equilibrio,
  con un tamaño celular mayor que en el medio pobre, y una
  masa de inicio (tras la división celular) mayor,
  alterándose igualmente el tiempo de inicio.

10.2.7. MEDICIONES
FÍSICAS:

Podemos medir el crecimiento microbiano siguiendo
diferentes parámetros físicos, algunos de los
cuales se presentan a continuación. No debemos olvidar que
en condiciones de crecimiento equilibrado todos los
parámetros del cultivo evolucionan de forma proporcional
y, por consiguiente, midiendo uno de ellos (el de medida
más fácil) podemos medir el resto.

En este apartado revisaremos los principales
métodos de recuento de microorganismos. Los métodos
para el seguimiento de la evolución de un cultivo microbiano pueden
clasificarse en directos e indirectos. Los métodos
directos se basan en la medida de la evolución del
número de células vivas (técnicas de
plaqueo) o del número de partículas
(técnicas microscópicas y de contadores de
partículas). Los métodos indirectos se basan en la
medida de algún parámetro del cultivo que nos
permite deducir información sobre la evolución del
número de microorganismos. La elección de un
método de seguimiento del cultivo en concreto
depende de las características del cultivo y del
proceso.

Entre los métodos principales de recuento de
microorganismos podemos destacar:

1. Las técnicas de recuento microscópico
   de células sin fijar usando microscopía de
   contraste de fase. Para ello se cuenta el número de
   partículas en un volumen determinado usando una
   célula de Petroff-Hauser o de Neubauer (portaobjetos
   modificado en el que una rejilla nos permite conocer el volumen
   que estamos observando). El procedimiento es rápido y
   sencillo; pero no permite distinguir células vivas
   inmóviles de células muertas.
2. Contaje de partículas utilizando sistemas
   automáticos del tipo Coulter-Counter. La
   operación de estos sistemas es sencilla (método
   de empleo) y
   permite rápidamente determinar el número de
   partículas presentes en una suspensión y la
   distribución de sus tamaños. El
   problema es que no distingue entre células vivas y
   muertas ni entre células y agregados de material
   insoluble presente en la suspensión del
   cultivo.

   El sistema es fácil de utilizar en el caso de
   células aisladas (no sirve en el caso de hongos
   filamentosos, por ejemplo). Puede realizarse sembrando en
   superficie (extendiendo un volumen dado de muestra sobre el
   medio de cultivo sólido) o en profundidad (mezclando
   un volumen dado de muestra con el medio de cultivo antes que
   solidifique). Esta última opción permite
   realizar el recuento de microorganismos microaerófilos
   que no crecen bien en la superficie de las placas de cultivo.
   Para que el sistema de recuento en placa tenga validez
   estadística, es necesario contar entre
   30 y 300 colonias con objeto de disminuir el error de la
   medida.

3. Técnicas de recuento en placa, basadas en
   colocar en un medio de cultivo adecuado un volumen determinado
   de muestra. Cada una de las células aisladas dará
   lugar, después de la incubación correspondiente,
   a una colonia de forma que el número de estas nos
   permitirá estimar el número de células
   presentes en la muestra plaqueada (sembrada).
4. Técnicas turbidométricas basadas en la
   medida de la turbidez de los medios de cultivo en los que
   crecen microorganismos unicelulares. La turbidez es
   proporcional a la masa de las partículas en
   suspensión (células) y su medida nos permite
   estimarla. Para ello se utiliza un equipo similar al que se
   emplea en la medida de la absorbancia de luz por disoluciones
   coloreadas (colorímetro, por ejemplo). Las medidas se
   hacen a una longitud de onda adecuada (normalmente en el
   entorno de 550 nm) y los valores
   se suelen denominar valores de densidad óptica. La
   limitación de este sistema, por otra parte muy sencillo,
   es que no distingue células vivas de muertas y que
   normalmente no es capaz de detectar densidades celulares
   menores a 10.000 células por mililitro.
5. Medida de peso seco. El sistema consiste en la
   filtración del cultivo a través de una membrana
   que retenga las células y su posterior desecación
   hasta peso constante. El sistema, obviamente, no diferencia
   células vivas de muertas y su sensibilidad es
   limitada.
6. Medida del ATP. Es una medida relativamente sencilla
   basada en la emisión de luz por la luciferasa de
   luciérnaga (Photimus pyralis) en presencia de
   O2 y de ATP. De esta forma se puede medir la
   concentración de ATP en un volumen dado de cultivo. Esta
   medida es interesante porque la concentración de ATP
   decae rápidamente en las células muertas, de
   forma que esa medida indirecta detecta únicamente las
   células vivas.

Los sistemas de medida del crecimiento celular se han
adaptado técnicamente para poder ser
utilizados como sistemas on-line. En una operación on-line
no es necesario extraer la muestra del cultivo para realizar la
medida. Esto es muy importante en el caso de fermentaciones en
gran volumen porque permite realizar medidas en tiempo real y
disminuye los riesgos de
contaminación.

Antes de cerrar este apartado hay que señalar que
en la naturaleza hay
muchísimos más microorganismos de los que podemos
detectar por la mayoría de los sistemas de recuento. De
hecho, se estima que en el suelo o en el
agua podemos cultivar únicamente proporciones menores al
1% de los microorganismos vivos. Esto es debido a varias causas
entre las que se cuenta la falta de medios de cultivo adecuado,
la dependencia de otros microorganismos para el cultivo debido a
procesos de sintrofía y la oligotrofía
(inhibición por altas concentraciones de nutrientes) que
muestran algunos microorganismos.

10.3. CRECIMIENTO
EN CULTIVO INTERMITENTE:

10.3.1. CINÉTICA DE CRECIMIENTO DE UN
CULTIVO INTERMITENTE:

En este apartado vamos a revisar el estudio de la
cinética del crecimiento de microorganismos que crecen en
un cultivo realizado en un volumen finito. a esto se le denomina
cultivo batch y podríamos traducirlo por
cultivo discontinuo por contraposición con el
cultivo continuo que desarrollaremos más adelante. El
desarrollo de
un cultivo discontinuo se ajusta al representado en la siguiente
figura:

Fig. 10.3.1-1 Desarrollo de un Cultivo
Intermitente

Se pueden distinguir cuatro fases en el
cultivo:

2. La fase logarítmica, en la que el
   microorganismo se adapta a las nuevas condiciones y pone en
   marcha su maquinaria metabólica para poder crecer
   activamente. La duración de esta fase es variable y en
   general es mayor cuanto más grande sea el cambio en
   las condiciones en las que se encuentra el
   microorganismo.
3. La fase exponencial.
4. La fase estacionaria, en la que no hay aumento neto
   de microorganismos, lo que no significa que no se dividan
   algunos, sino que la aparición de nuevos individuos se
   compensa por la muerte
   de otros.
5. La fase de muerte, en
   la que el número de microorganismos vivos disminuye de
   forma exponencial con una constante k que depende de
   diferentes circunstancias.

En la fase de muerte decimos que el número de
microorganismos vivos disminuye exponencialmente. Pero
¿qué es un microorganismo vivo en términos
microbiológicos?. Consideramos vivo al microorganismo que
puede multiplicarse (dividirse), y muerto al que ha perdido
irreversiblemente la capacidad de dividirse. Es importante
entender este concepto porque
los microorganismos microbiológicamente muertos no tienen
por qué estar metabólicamente inactivos.

10.4. FACTORES
QUE AFECTAN LA RAPIDEZ DE CRECIMIENTO:

10.4.1. EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE
SUSTRATO:

Si [Et] representa la concentración
total del microorganismo en una reacción y [ES] es la
concentración del complejo microorganismo-sustrato,
entonces [Et] – [ES] representa la
concentración de microorganismo libre para reaccionar con
el sustrato.

Durante una reacción el microorganismo se
unirá al sustrato, hasta que todas las moléculas se
saturen. Usualmente la concentración de sustrato [S] es
mayor que [ES], por lo que no resulta un factor limitante. La
razón de formación de [ES] está definida
por

[ES] Rate = k1 ([Et] –
[ES]) [S] (Ec. 10.4.1.1)

Mientras que la disociación está definida
por

[ES] disociación rate = k –1
[ES] – k2 [ES] (Ec. 10.4.1.2)

Mientras haya microorganismo disponible, la razón
de k1 irá aumentando hasta que se saturen. Si
las constantes de reacción y disociación son
iguales, la formación del complejo [ES] se mantiene
estable al igual que la velocidad de
reacción. O sea que la generación del producto se
mantiene constante mientras la concentración del sustrato
no sea limitante. Esto se definiría como

[ES] = [Et] [S] (Ec.
10.4.1.3)

[S] + (k2 + k -1) /
k1

La velocidad inicial de la reacción está
determinada por

v = k2 [ES] (Ec.
10.4.1.4)

Si definimos KM como (k2 + k
-1) / k1 y Vmax como
k2 [Et], obtenemos que

v = Vmax [S] / KM + [S] (Ec.
10.4.1.5)

Esta es la ecuación de
Michaelis-Menten.

En un estudio de cinética microbiana se mide la
actividad en términos de producto formado por minuto, a
distintas concentraciones de sustrato. Si la actividad es
graficada en términos de la concentración inicial
del sustrato versus el producto generado en un lapso de tiempo
(velocidad de reacción), la curva generada es una
hipérbole rectangular.

La ecuación que describe todos los puntos en esa
línea viene dada por v. Esta ecuación expresa la
velocidad para la reacción de un solo sustrato y se conoce
como la ecuación de Michaelis-Menten:

V max v = Vmax [S] /
(Km + [S]) (Ec. 10.4.1.6)

v

v = actividad microbiana

V max/2 [S] = concentración de
sustrato

KMVmax = actividad a [S]
infinito

KM = el valor de [S] que da
actividad

[S] igual a ½ Vmax

Fig. 10.4.1-1

Estos últimos dos parámetros son
importantes, porque nos dan información directa sobre
cuán bien el microorganismo se une al sustrato
(KM) y sobre cuán bien el microorganismo
convierte el sustrato en producto una vez se une
(Vmax). De hecho, KM es la constante de
disociación dinámica del microorganismo con el
sustrato, y Vmax es la concentración molar del
microorganismo por la constante catalítica
(Kcat).nas
celulares
s transportadores están

10.4.2. EFECTO DE LA TEMPERATURA:

Todos los microorganismos tienen una temperatura
óptima de crecimiento. Esto significa que a determinada
temperatura la velocidad de duplicación (o la velocidad de
crecimiento poblacional) de los microorganismos es mayor. Hay que
tener en cuenta que no todos los microorganismos crecen en el
mismo rango de temperaturas:

Tabla 10.4.2-1 Temperatura
Óptima de Crecimiento

Fig. 10.4.2-1 Efecto de la Temperatura
en el Crecimiento Microbiano

La temperatura afecta la estabilidad de las
proteínas celulares porque induce cambios conformacionales
que alteran la actividad biológica de estos compuestos,
especialmente la de enzimas.

10.4.3. EFECTO DEL pH:

La mayoría de los microorganismos crecen en pH
cercanos a la neutralidad, entre 5 y 9, cosa que no excluye que
existan microorganismos que puedan soportar pH extremos y se
desarrollen. Según el rango de pH del medio en el cual se
desarrollan pueden dividirse en:

Tabla 10.4.3-1 Clasificación de
los Microorganismos según el pH

Los microorganismos regulan su pH interno mediante un
sistema de transporte de
protones que se encuentra en la membrana citoplasmática,
que incluye una bomba de protones ATP dependiente.

El rango de pH óptimo para el desarrollo de los
microorganismos es estrecho debido a que frente a un pH externo
muy desfavorable se requiere un gran consumo de
energía para mantener el pH interno.

10.5. CONSUMO DE
NUTRIENTES Y FORMACIÓN DE PRODUCTO:

De algunos estudios realizados se pudo comprobar que las
bacterias son únicamente una pequeña parte de la
estructura, el
resto es una materia de
tipo mucilaginoso secretada por las propias bacterias, llamada
matriz
extracelular, que absorbe agua y captura pequeñas
partículas.

En su interior, el agua fluye llevando a las colonias
bacterianas nutrientes disueltos y retirando los productos de
desecho, que frecuentemente son utilizados por otros tipos
bacterianos que forman parte de la estructura y que están
convenientemente distribuidos según sus
intereses.

El flujo de nutrientes no es total en toda la
dimensión del biofilm, en las zonas centrales, la llegada
de nutrientes está de alguna manera regulada por la
actividad de las situadas en la periferia, de la misma manera que
éstas están afectadas por la actividad
metabólica de las bacterias que situadas en la zona
central de biofilm. Tanto es así, que elementos
importantes para el tipo de metabolismo,
como el oxígeno, puede variar su concentración de
forma significativa en centésimas de milímetro.
Esto es un indicativo de que en el mismo biofilm existe
diversidad de agentes bioquímicos.

10.6. RENDIMIENTO
DE BIOMASA Y DE PRODUCTO:

Un aspecto importante en la operación de un
quimostato es la rata de producción de biomasa y de sustancias
celulares. La rata de producción de biomasa por unidad de
volumen es el producto de la concentración de
células por la rata de dilución. 

Biomasa producida =

sustituyendo el valor de

(Ec. 10.6-1)

Usualmente Ks es pequeño comparado con
Sr y a ratas de dilución inferiores al valor
crítico, Dc, la biomasa producida es
aproximadamente igual a D Y Sr. Pero para valores de D
cercanos al valor crítico, donde D = max, la
expresión:

(Ec. 10.6-2)

Tiende a infinito y la biomasa producida, D X, desciende
a cero. Estos cambios en la producción de biomasa con la
rata de dilución se muestran gráficamente en la
Fig. 9 Para la producción de proteína microbiana se
debe operar el quimostato a una rata de dilución que
produzca el máximo de biomasa.

10.7. CULTIVO
CONTÍNUO:

Consiste en mantener la población microbiana en
fase exponencial de crecimiento. Se utiliza en fermentaciones
industriales que requieren actividad metabólica
máxima. Los sistemas de cultivo continuo pueden hacerse
funcionar como quimiostatos o como turbidostatos. En un
quimiostato la velocidad de flujo de entrada y salida de
nutrientes se mantiene a un valor determinado de tal manera que
la velocidad de crecimiento del cultivo queda ajustada a esa
velocidad de flujo. En un turbidostato el sistema incluye un
dispositivo óptico que regula la turbidez controlando la
velocidad de flujo.

Es un cultivo balanceado mantenido por tiempo indefinido
por un sistema de flujo que se compone de:

• Una cámara de cultivo de volumen constante a
  la que llega un suministro de nutrientes, y de la que se
  eliminan o separan los productos tóxicos de desecho
  (por un dispositivo de rebosadero).

Una vez que el sistema alcanza el equilibrio, el
número de células y la concentración de
nutrientes en la cámara permanecen constantes, y entonces
se dice que el sistema está en estado
estacionario, con las células creciendo
exponencialmente.

Los parámetros a tener en cuenta son:

• flujo (f), medido en ml/h
• volumen de la cámara de cultivo (v,
  en ml)
• densidad celular en la cámara
  (x)
• factor de dilución D = f/v (en
  h–1). El inverso de este factor de
  dilución es el tiempo medio de residencia (1/D=
  TMR)

Existe una pérdida de células por el
rebosadero: -dx/dt = x·D. El crecimiento bruto es dx/dt =
x·m. Por lo tanto, el crecimiento neto es dx/dt =
x·m – x·D = x·(m – D). Si logramos que el
coeficiente de crecimiento (m ) se haga igual al factor de
dilución (D), entonces dx/dt = 0, y por lo tanto la
concentración de células se hace constante (x= x).
El cultivo se encuentra entonces en estado dinámico de
equilibrio. Las pérdidas de células por drenaje se
compensan con las ganancias por crecimiento.

Existen dos tipos de procedimientos
para obtener cultivos continuos:

• de control
  interno: turbidostato;
• de control
  externo: quimiostato

10.7.1. TEORÍA DEL
QUIMIOSTATO:

Se entiende por tal, el reactor tanque agitado en el que
se asume básicamente que:

• El volumen de medio es constante
• El caudal de salida es igual al de
  entrada
• La concentración de salida es igual a la
  concentración en el interior del reactor

"El efecto de la concentración del nutriente
sobre el crecimiento total es fácil de comprender, ya que
gran parte del nutriente se convierte en material celular, y por
tanto, si se limita la cantidad de nutriente se convierte en
material celular. La razón del efecto de las
concentraciones muy bajas de nutriente sobre el ritmo de
crecimiento es más incierta. Una opinión es que a
estas bajas concentraciones de nutriente éste no puede ser
transportado a la célula a una velocidad suficiente para
satisfacer todas las demandas metabólicas de nutriente. Es
presumible que no todos los lugares transportadores están
ocupados. Esta propiedad de
alterar el ritmo de crecimiento mediante la concentración
del nutriente se utiliza en el aparato de cultivo continuo
llamado quimiostato." (4)

La cosecha máxima es también una
función de la especie de organismo y de su eficacia en
convertir nutrientes en masa celular, y de las condiciones
ambientales, tales como el pH y la y temperatura. El papel de la
fuente de energía en el control de la cosecha
máxima se estudiará más adelante.

En la industria de
la levadura, la levadura del, pan crece en melazas como fuente de
carbono y energía. Se ha descubierto que si se
añaden todas las melazas de una vez, parte del exceso de
azúcar
es convertido el alcohol por
las células y, por tanto, es desaprovechado.

En las fases tempranas del crecimiento exponencial,
cuando las densidades celulares son bajas, sólo es
necesaria una pequeña cantidad de azúcar para
soportar el ritmo máximo de crecimiento. Pero a medida que
transcurre el tiempo, aumenta la densidad y se precisa mayor
cantidad de azúcar. Lo que se hace en la práctica
es añadir las melazas a un ritmo exponencial paralelo al
ritmo de crecimiento exponencial de la levadura.

Los antibióticos y otros agentes microbianos
afectan al crecimiento de diversas maneras, y un estudio de la
acción de estos agentes en relación con la curva de
crecimiento es una ayuda considerable en la comprensión de
sus modos de acción. La manera más precisa de
observar el efecto de un antibiótico es añadirlo en
un grado de concentración inhibidora a un cultivo en
crecimiento exponencial.

El quimiostato es un dispositivo de cultivo continuo en
el cual tanto la densidad de la población como el ritmo de
crecimiento son controlados por el investigador. Para la
regulación del quimiostato se utilizan dos elementos: el
ritmo de flujo y la concentración de un nutriente
limitante, como una fuente de carbono, de energía o de
nitrógeno, o factor de crecimiento. Tal como a
concentraciones bajas de un nutriente es rápidamente
consumido por el crecimiento. En los cultivos estáticos el
crecimiento es proporcional a la concentración de dicho
nutriente. Sin embargo a estas bajas concentraciones el nutriente
se ha consumido, pero en el quimiostato la adición
continua de medio fresco que contiene el nutriente limitante
permite el crecimiento continuo. Puesto que a bajos niveles de
nutrientes utilizados el nutriente limitante es
rápidamente asimilado, su concentración en el
quimiosato es siempre cero. Los quimiostatos han encontrado
aplicación en una gran variedad de procedimientos de
investigación, especialmente en los casos
en que se desea las poblaciones naturales a menudo crecen
lentamente o a concentraciones bajas de nutriente, los
quimiostatos han sido especialmente útiles como modelos de
laboratorio de ecosistemas
microbianos naturales.

10.7.2. ECUACIONES FUNDAMENTALES DEL CULTIVO
CONTINUO:

El estudio del crecimiento de la población se ha
limitado a los cultivos cerrados o estáticos en los que el
crecimiento se produce en un volumen fijado en un medio de
cultivo que es alterado por las acciones de
los organismos en crecimiento y que, por ello, ya no es apto para
el crecimiento. En los estadios tempranos del crecimiento
exponencial en los cultivos estáticos las condiciones
pueden permanecer relativamente constantes, pero en los estadios
tardíos suelen ocurrir cambios drásticos. Para
muchos estudios es deseable conservar los cultivos en ambientes
constantes durante largos periodos de tiempo, y esto se logra
utilizando cultivos continuos. Un cultivo continuo es
e4sencialmenye un sistema de flujo de volumen constante al que se
añade medio continuamente y del que, gracias a un
dispositivo de rebosamiento, se elimina el exceso continuamente.
Una vez que este sistema está en equilibrio, el
número de células y el nutriente permanecen en un
status constante y todo el sistema se dice que está en
estado de equilibrio. Un parámetro clave de un dispositivo
de cultivo es el ritmo de dilución, D que se define
como:

D= ritmo de flujo = F (Ec.
10.7.2-1)

Volumen V

1. La muerte de una población a una velocidad
   logarítmica hace reversible la cuenta de la
   población a la misma velocidad de aceleración
   con que se efectuó el crecimiento inicial. Uno de
   los problemas en bacteriología es
   prevenir este fenómeno asumiendo la
   conclusión lógica relacionada con la muerte del
   cultivo. Muchos de los métodos y las técnicas
   de cultivo de colección se relacionan con el
   mantenimiento de un número razonable
   de células viables durante el almacenamiento. Las bacterias con una activa
   fase de muerte deben ser transferidas a medios frescos en
   intervalos frecuentes. Es común perder un cultivo
   cuando no se atiende esta observación. La liofilización
   y otras técnicas similares son métodos
   prácticos para prevenir el daño
   metabólico que se presenta en las células
   inactivas. El final de la fase de muerte puede ser
   simplemente la estabilización de esa
   población en una cuenta baja. Las infecciones
   crónicas, en donde el agente etiológico
   (causante) permanece latente en un tejido o en un
   número muy bajo, sin manifestar la patología
   activa, pueden ser consideradas como ejemplo de una fase de
   muerte que se ha estabilizado de esta manera. Un ejemplo
   sería la presencia del bacilo de la tifoidea en la
   vesícula biliar o en otro órgano del
   transmisor. Algunas bacterias, especialmente en los medios
   diluidos, permanecerán en un bajo nivel de
   población en medios artificiales durante
   años, sin morir en su totalidad y conservarán
   la movilidad.

2. ESTADO NO ESTACIONARIO:
3. ESTADO ESTACIONARIO:

En algunas ocasiones es difícil determinar la
razón del cambio de una fase logarítmica a una
estacionaria, aunque han surgido por ahí algunas
explicaciones que no son muy satisfactorias. Sin embargo, el
análisis de muchos cultivos diferentes nos muestra que
existen dos explicaciones muy adecuadas. Uno o más
nutrientes se agotan, o bien existe una acumulación de
productos tóxicos. Cualquiera de estos fenómenos
que ocurra primero será la causa de la fase estacionara,
dependiendo del caso en particular. El tóxico puede ser
tan sólo un cambio a un ácido orgánico o a
una base que altere el pH en un rango no tolerable por esa
bacteria. En ciertos medios, Enterobacter eleva el pH
demasiado y el Bacillus subtilis se queda sin
alimento. Por supuesto, ambos factores pueden operar al mismo
tiempo. Algunas bacterias tienen fases estacionarias muy cortas y
rápidamente empiezan a morir. Otras permanecen en la fase
estacionaria por semanas.

Una baja población, o un yacimiento, no son
causas de la fase estacionaria. Es más, los cultivos
mixtos de ciertas especies logran obtener poblaciones más
grandes que los cultivos puros. Esto es a menudo una sorpresa
para los bacteriólogos que sólo trabajan con
cultivos puros. Uno debe acostumbrarse a la idea de que un
cultivo de Escherichia coli se estabilizará en un
periodo muy corto en una población de 4 millones de
células por mililitro y tendrá que pensar que esto
es válido para la mayoría de bacterias que pueden
encontrarse en un medio de cultivo. Los medios ambientes
naturales, con grandes poblaciones bacterianas, sobrepasan estas
cifras considerablemente. Por ejemplo, el resumen presenta
cuantas de una mezcla de especies bacterianas en niveles que van
desde los 30 a los 60 millones por gramo.

Esto se entiende fácilmente si comprendemos que
las diversas especies tienen diferentes requerimientos para el
crecimiento, diferentes nutrimentos y diversas tolerancias a los
factores ambientales. A pesar de ocupar el mismo espacio, en
general, cada especie vive su propio nicho ecológico. No
es enteramente independiente de otras especies, pero sí
está limitada en número por sus propias demandas
nutricionales y a las reacciones hacia los productos de desecho,
y no por la competencia por
el espacio físico con las otras especies.

RELACIONES MATEMÁTICAS:

"El parámetro más importante del
quimiostato es el ritmo de dilución o de rebosamiento, que
es el ritmo al que el medio fluye a través del sistema. El
ritmo de dilución determina el ritmo de división
celular de la población, y alterando el ritmo de flujo se
puede alterar directa y rápidamente el ritmo de
crecimiento lo que hace del quimiosato un dispositivo tan
útil. Cuando un volumen de medio de cultivo ha pasado a
través del quimiosato, la población se ha doblado
ya que la población celular ha continuado siendo la misma.
El tiempo de generación es pues el tiempo que necesita un
volumen de medio de cultivo para desplazarse a través del
recipiente." (5)

Sin embargo, el tiempo de generación en el
quimiostato no es exactamente el mismo tiempo de
generación en un cultivo estático con crecimiento
exponencial. Ello es debido a que en el cultivo estático
cada célula formada se divide y produce una descendencia,
mientras que en el quimiostato algunas de las células son
arrastradas antes de que puedan dividirse, de manera que el ritmo
real de división celular es mayor que el ritmo de
población de células. Debemos que distinguir entre
el tiempo de generación en cultivo y el tiempo de
generación celular. En un cultivo estático con
crecimiento exponencial el tiempo de generación celular es
equivalente al tiempo de generación del cultivo y viene
dado por 1/k. En un quimiostato, el tiempo de generación
en cultivo es la inversa del ritmo de crecimiento
instantáneo de un cultivo, el cual se expresa por la
siguiente ecuación diferencial:

dx = μx σ μ=
1 dx (Ec. 10.7.2-2)

dt x dt

Donde x es el número de células o la
concentración del organismo (miligramos de
peso seco por mililitro) a un tiempo t, y μ es el
ritmo o velocidad de crecimiento instantαneo.
Con la integración de la ecuación anterior
entre los límites
xo y xt, se obtienen la siguiente
ecuación:

ln xt -ln xo =
μt (Ec. 10.7.2-3)

o, como se expresa generalmente la
solución,

xf = xo e
μt (Ec.
10.7.2-4)

Puesto que xf es también igual a
2kt xo, la relación entre k y μ
puede derivarse combinando las dos ecuaciones:

xo e μt
= 2kt xo (Ec.
10.7.2-5)

Suprimiendo los factores comunes, tomando logaritmo
natural y despejando μ, se obtiene:

μ = k(ln 2) = 0.693 k (Ec.
10.7.2-6)

Así, se puede calcular μ, el ritmo de
crecimiento instantáneo para un quimiostato, multiplicando
k por 0.693.

Volviendo al quimiostato, podemos ver que μ, el ritmo
de crecimiento instantαneo, es igual al ritmo
de dilución, ya que el ritmo al que salen las
células está exactamente equilibrado con el ritmo
de crecimiento. El ritmo de dilución se expresa como el
ritmo de flujo en mililitros por hora dividido por el volumen del
cultivo del quimiostato. Así, si el volumen es 500 ml y el
ritmo de flujo es 5 ml/h, el ritmo de dilución es 5/500
ó 0.01 por hora. Esto significa que cada 100 horas el
volumen del quimiostato sería repuesto y el ritmo de
crecimiento instantáneo sería 100 horas.

Para entender el principio por el cual la densidad de
población y el ritmo de crecimiento están
controlados en el quimiostato, debemos reconsiderar el efecto de
la concentración de nutriente en el crecimiento, expresado
cualitativamente.

La relación entre μ y la concentración
de un nutriente limitante se describe empíricamente por la
ecuación:

μ = μ
max s (Ec.
10.7.2-7)

ks + s

Donde s es la concentración del sustrato, μ
max es el ritmo de crecimiento especifico
máximo ( es decir, el valor máximo de μ a
niveles de saturación de sustrato) y k, es una constante
de saturación, numéricamente igual a la
concentración de sustrato en la que μ =
½ μ max. La
ecuación anterior es formalmente equivalente a la
ecuación de Michaelis-Menten utilizada en los
análisis enzimáticos cinéticos. Se pueden
calcular los parámetros desconocidos μ max y
k, representando gráficamente 1/v sobre el eje y en
función de 1/s sobre el eje x. Se obtendrá una
línea recta que intercepta el eje y, y el valor en el
punto en que lo intercepta es 1/ μ max. La curva de
la línea ks / μ
max, y puesto que μ
max es conocido, se puede calcular
ks. En general, los valores de k, son muy
bajos.

La relación entre el ritmo de crecimiento y el
ritmo de consumo de sustrato pueden expresarse como:

dx = Y ds (Ec.10.7.2-8)
dt dt

donde Y, la constante de rendimiento, es:

Y = peso de las bacterias formadas (Ec.
10.7.2-9)

Peso de sustrato consumido

La clave del modo de acción del quimiostato es la
composición del medio del depósito. Todos los
componentes de este medio se hallan en exceso, excepto uno, el
sustrato limitante del crecimiento. El símbolo para la
concentración de este sustrato en el depósito es
SR, mientras que el del mismo sustrato en el
recipiente de cultivo es s. Tomando en cuenta las ecuaciones
anteriores, pueden hacerse las siguientes
consideraciones.

Cuando un quimiostato es inoculado con un pequeño
número de bacterias y el ritmo de dilución no
excede de un cierto valor crítico (Dc), el
número de organismos empezará a aumentar. El
aumento es dado por:

dx = crecimiento – salida (Ec.
10.7.2-10)

dt

o bien:

dx = μx –
Dx (Ec. 10.7.2-11)

dt

Puesto que inicialmente μ > D, dx/dt es positivo.
Sin embargo, a medida que aumenta la densidad de
poblaciσn decrece la concentración del
sustrato limitante del crecimiento, causando un
descenso de μ. Si D se mantiene constante, se alcanzarα
un estado de equilibrio en el que μ = D y dx/dt =
0.

Los estados de equilibrio sólo son posibles
cuando el ritmo de dilución no excede de un valor
crítico Dc. Este valor depende de la concentración
del sustrato limitante del crecimiento en el depósito
(SR).

Dc = μ max
(SR/ ks + SR) (Ec.
10.7.2-12)

Así, cuando SR >> ks
(que es el caso general), pueden obtenerse estados de equilibrio
a ritmos de crecimiento cerca de μ
max . El cambio en s viene dado
por:

ds = SRD – sD –
μx (Ec.
10.7.2-13) dt Y

Cuando se ha alcanzado un estado de equilibrio, ds/dt =
0

Un estado de equilibrio se alcanza
automáticamente cuando D < Dc.

A partir de las ecuaciones 10.7.4-5 y 10.7.4-6 pueden
calcularse los valores del estado de equilibrio de la
concentración de organismo (x*) y del sustrato limitante
del crecimiento (s*):

x* = Y (SR – s) (Ec.
10.7.2-14)

s* = ks (D/ μ
max – D) (Ec.
10.7.2-15)

Estas ecuaciones, una vez que sus valores son conocidos,
los valores del estado de equilibrio de x* y s* pueden ser
determinados de antemano para cualquier ritmo de dilución.
Como puede verse a partir de la ecuación 10.7.4-8, la
concentración de sustrato del estado de equilibrio (s*)
depende del ritmo de dilución (D) aplicado y es
independiente de la concentración del sustrato en el
depósito (SR) . Así, D determina s* y s*
determina x*.

Como se ha visto, los límites dentro de los
cuales el ritmo de dilución controla el ritmo de
crecimiento son muy amplios, aunque tanto a ritmos de
dilución muy bajos como muy altos se rompe el estado de
equilibrio. A elevados ritmos de dilución, cerca de
Dc el organismo no puede crecer bastante deprisa para
mantener el mismo ritmo que la dilución, y el cultivo sale
del quimiostato. En el otro extremo, a ritmos de dilución
muy bajos, una fracción grande de células puede
morir de inanición ya que el nutriente limitante no es
añadida con suficiente rapidez para permitir el
mantenimiento del metabolismo celular.

Probablemente, hay una cantidad mínima de
nutriente necesaria para mantener estructura y la integridad
celular, llamada energía de mantenimiento, y este
nutriente no está disponible para la biosíntesis ni para el crecimiento celular.
Así, a ritmos muy bajos de dilución es probable que
no se mantengan las condiciones del estado de equilibrio y la
población será eliminada lentamente del
quimiostato.

La densidad celular en el quimiostato es controlada por
el nivel del nutriente limitante. Si la concentración de
este nutriente en el medio que entra es aumentada, permaneciendo
constante el ritmo de dilución, la densidad celular
aumentará aunque el ritmo de crecimiento continuará
siendo el mismo. Así, pues, ajustando el ritmo de
dilución y el nivel de nutriente, el experimentador puede
obtener a voluntad una variedad de densidades de población
de diversos ritmos de crecimiento.

3. RAPIDEZ CINÉTICA DE
   DILUCIÓN:

De la cinética se conoce que uno de los modelos
más ampliamente aceptados en Enzimología es el de
Michaelis-Menton, quienes han propuesto una ecuación para
ligar la velocidad de formación de producto, con la
máxima velocidad de producción, V, con la
concentración del sustrato, S, y con la constante de
Michaelis-Menten (que a su vez relaciona la constante de
equilibrio de la disociación del complejo enzima-sustrato
con las constantes de velocidad de formación de producto y
de formación del complejo enzima-sustrato) km:

ν = VS/(km + S)
(Ec.10.7.3-1)

En los procesos de Biomasa, el producto de la fermentación es precisamente la masa
molecular, en consecuencia ν es equivalente a la velocidad de
crecimiento específico μ, h –1, y V
equivalente a μ
max de tal manera que el modelo
propuesto por Monod es el siguiente:

μ =
μ max S/(Ks + S)
(Ec. 10.7.3-2)

Donde Ks es la constante de
saturación, g/l y numéricamente es igual
a S para cuando μ = ½ μ
max.

4. Los cultivos continuos tienen cierta ventaja con
   relación a los cultivos por lotes. Pueden operar por
   largos períodos de tiempo y tener niveles de
   crecimiento constantes, la productividad puede ser mayor, en
   comparación al método por lotes, se maximiza
   la conversión y se reducen los problemas de
   inhibición del sustrato por el mantenimiento de
   sustrato residual de baja concentración.

   También tiene inconvenientes, lo cual
   consiste en la sofisticación técnica y
   control, costo de
   instalación inicial alto debido al suministro
   continuo de nutrientes estériles y la continua
   separación de productos.

5. PRODUCTIVIDAD:

   Se sugiere que cuando el crecimiento se realiza a
   gran velocidad y cuando la concentración de sustrato
   es alta, se pueden considerar las siguientes
   relaciones:

   Y = -dx (Ec. 10.7.5-1)

   ds

   o lo que es lo mismo

   dx = Y ds (Ec.
   10.7.5-2)

   dt dt

   Sin embargo hay ocasiones que el sustrato se
   consume también en "mantenimiento del sistema", tal
   es el caso de la glucosa que puede emplear un
   microorganismo para respirar pero no para la
   multiplicación. Por este motivo a bajas
   concentraciones la expresión de rendimiento debe
   incluir un factor que contabilice el sustrato limitante que
   se consume en "mantenimiento" y la ecuación sugerida
   es la siguiente:

   rx + dx =- Y ds (Ec.
   10.7.5-3)

   dt dt

   donde :

   r = requerimiento, para mantenimiento
   específico de sustrato limitante por unidad de masa
   molecular.

6. DETERMINACIÓN DE LAS CONSTANTES
   CINÉTICAS Y DE RENDIMIENTO:

   Monod encontró que cuando se opera con el
   "Quimiostato" y existe un solo sustrato limitante, tiene
   vigencia satisfactoria un modelo muy simple que se parece
   al modelo de Michaelis-Menten de la cinética
   enzimática. El sustrato limitante se caracteriza
   porque al modificar su concentración se afecta a la
   formación de productos. Al consumo de sustrato por
   el microorganismo, y al crecimiento mismo del
   microorganismo. El modelo propuesto por Menod ha sido
   comprobado experimentalmente razón por la que tiene
   mucha aceptación. Con este modelo se describen muy
   satisfactoriamente los procesos de Biomasa de tal manera
   que se utiliza como criterio de diseño en Fermentación
   Continua.

7. DESVIACIONES DE LA CONDUCTA
   IDEAL DEL QUIMIOSTATO:
8. MODIFICACIONES A LA TEORÍA BÁSICA DEL
   QUIMIOSTATO:

Cuando X aumenta.- Considerando las ecuaciones
anteriores, se observa que al aumentar X, la concentración
de sustrato S tiene que disminuir, lo cual implica que μ debe
disminuir. Lo que se ha asumido significa que, S ≠ 0. Pero la
disminución de μ a su vez implica un efecto contrario
al supuesto al principio.

Cuando X disminuye. Implica también que S ≠
0.

Al disminuirse la concentración de
microorganismos aumenta la concentración de sustrato S,
por lo que debe aumentar μ con lo que se produce el efecto
contrario al que se supuso.

Cuando aumenta F. Considerando que el factor de
dilución D es la relación entre caudal de alimentación y el
volumen de sustrato fermentescible y debiendo permanecer V
constante en razón de o asumido para definir el
Quimiostato, el único parámetro de operación
es F.

F = VD (Ec. 10.7.7-1)

Esto es que al aumentar el caudal F, aumenta el factor
de dilución D provocándose el "lavado" del reactor,
es decir hay disminución de la concentración
celular X.

De los análisis realizados se puede concluir que
es conveniente que la concentración del sustrato de salida
S sea lo más bajo posible, pero en cambio que la velocidad
de reproducción o de crecimiento del microorganismo X sea
lo más alto posible. Sin embargo se debe también
puntualizar que:

• Si el sustrato es barato puede lograrse la
  máxima conversión lo cual permite trabajar con
  valores de D correspondientes al máximo valor
  X
• Si el sustrato es costoso, no se puede trabajar con
  el factor de dilución D demasiado alto con lo que X es
  menor que el valor óptimo.

4. VENTAJAS DEL CULTIVO CONTINUO SOBRE EL
   CULTIVO POR LOTES:

Las ventajas de este tipo de cultivo se las puede
enumerar de la siguiente manera:

• Opera por periodos largos; tiempos muertos
  bajos
• Costos de operación y trabajo
  bajos
• El cultivo se mantiene con coeficientes de
  crecimiento constantes
• Crecimiento balanceado, composición celular
  constante
• Generación de biomasa constante como
  productividad y conversión
• Volumen de reactor reducido en comparación a
  la productividad similar en proceso por lotes

4. DESVENTAJAS DEL CULTIVO CONTINUO SOBRE EL
   CULTIVO POR LOTES:

Las desventajas de este tipo de cultivo se las puede
enumerar de la siguiente manera:

• Alto costo por alta calidad de
  equipos y accesorios
• Requiere gran reservorio para almacenamiento de
  MÉDIUM o suministro continuado de
  sustrato.
• Esterilización continuada, separación
  continuada de producto y niveles de
  purificación
• Biosensores sofisticados y automatización computarizada para
  operación óptima
• Se incrementa el riesgo de
  contaminación debido a la amplia
  operación
• Posibilidad de mutación, incremento de FAGOS
  por los cambios genéticos debido a la presencia de
  plasmidios e incremento de estos
• La conversión total de sustrato exige
  sistema de multiniveles, inmovilización celular o
  recirculación celular que encarece el costo de
  operación.

7. APLICACIONES
   DEL CULTIVO CONTINUO:

En todos los sistemas de cultivo continuo las densidades
de población son mantenidas a niveles considerablemente
bajos que los que se presentan en la fase estacionaria del
crecimiento. El tipo más simple de sistema de cultivo
continuo que hay que comprender es el llamado turbidostato. En
este sistema la turbidez del cultivo es medida
fotoeléctricamente y la señal eléctrica se
utiliza para controlar una bomba que añade medio de
cultivo a fin de diluir el cultivo a un ritmo justamente
suficiente para equilibrar el aumento de turbidez debido al
crecimiento. El dispositivo está ajustado de tal modo que
una turbidez determinada puede ser mantenida indefinidamente. Si
se desea poca turbidez, el medio se añade más
rápidamente, mientras que si se desea un alto grado de
turbidez el medio se añade más lentamente. El medio
utilizado contiene todos los nutrientes esenciales en exceso, de
forma que la población crece en una manera similar a la
fase exponencial. En el turbidostato el ritmo de crecimiento no
es controlado por el investigador, sino por condiciones internas
del sistema tales como las condiciones ambientales utilizadas, la
especie de organismo y el medio.

Los turbidostatos son dispositivos útiles para
proporcionar aportaciones continuas de células en estados
fisiológicamente controlados, y pueden ser especialmente
importantes en la microbiología industrial, campo en el
que los procesos de producción continua suelen ser
más económicos.

En otro tipo de dispositivo de cultivo continuo, el
quimiostato, tanto la densidad de población como el ritmo
de crecimiento son controlados por el investigador. Para la
regulación del quimiostato se utilizan dos elementos: el
ritmo de flujo y la concentración de un nutriente
limitante, como una fuente de carbono, de energía o de
nitrógeno, o factor de crecimiento.

CONCLUSIONES:

1. El cálculo del número de células
   que existen en una suspensión se puede llevar a cabo
   mediante el recuento celular (microscopía, número
   de colonias), masa celular (peso seco, medida del
   nitrógeno celular, turbidimetría) o actividad
   celular (grado de actividad bioquímica con
   relación al tamaño de la población). Todos
   estos métodos se clasifican en dos apartados:
   métodos directos y métodos
   indirectos.
2. El peso seco (contenido de sólidos) de las
   células bacterianas que se encuentran en una
   suspensión se obtiene por el secado de un volumen en un
   horno a 105°C hasta peso constante. Esta técnica es
   útil para grandes volúmenes de muestra, debido a
   que diferencias del orden de los miligramos representan el peso
   de un gran número de bacterias. La desventaja de este
   método es que componentes volátiles de la
   célula pueden perderse por el secado y puede existir
   alguna degradación. También la muestra seca puede
   recobrar humedad durante el pesado, principalmente si el
   ambiente tiene una humedad relativa alta.
3. Los métodos de dispersión de la luz son
   las técnicas más utilizadas para monitorear el
   crecimiento de los cultivos bacterianos. Son muy útiles
   y poderosos pero pueden llevar a resultados erróneos.
   Principalmente, dan información sobre el peso seco
   (contenido macromolecular).
4. El crecimiento de una población bacteriana
   puede ser entendido desde diferentes perspectivas y de acuerdo
   a éstas se puede llegar a determinar la medida del
   crecimiento mediante diversas metodologías. Para
   algunos, el crecimiento es la capacidad para multiplicarse que
   tienen las células individuales, esto es iniciar y
   completar una división celular.
5. Todos los microorganismos tienen una temperatura
   óptima de crecimiento. Esto significa que a determinada
   temperatura la velocidad de duplicación (o la velocidad
   de crecimiento poblacional) de los microorganismos es mayor.
   Hay que tener en cuenta que no todos los microorganismos crecen
   en el mismo rango de temperaturas.
6. El efecto de la concentración del nutriente
   sobre el crecimiento total es fácil de comprender, ya
   que gran parte del nutriente se convierte en material celular,
   y por tanto, si se limita la cantidad de nutriente se convierte
   en material celular. La razón del efecto de las
   concentraciones muy bajas de nutriente sobre el ritmo de
   crecimiento es más incierta. Una opinión es que a
   estas bajas concentraciones de nutriente éste no puede
   ser transportado a la célula a una velocidad suficiente
   para satisfacer todas las demandas metabólicas de
   nutriente. Es presumible que no todos los lugares
   transportadores están ocupados. Esta propiedad de
   alterar el ritmo de crecimiento mediante la
   concentración del nutriente se utiliza en el aparato de
   cultivo continuo llamado quimiostato.

APLICACIONES:

El conocimiento
de la cinética de crecimiento de los microorganismos es de
sumo interés en
el campo industrial, ya que permite conocer la manera de
reproducción de las bacterias, permitiendo desarrollar
métodos de catalización e inhibición de
éstos y de prevención en caso de que el crecimiento
sea en una forma desproporcionada y peligrosa. Además este
conocimiento ayuda en diferentes campos, como por ejemplo, el
alimenticio, en el cual el
conocimiento de la cinética de crecimiento microbiano
es un parámetro que indica la forma en que se deben
colocar los preservantes en un producto determinado. En general
las aplicaciones de éste tema son innumerables y ya se han
detallado con bastante amplitud en puntos anteriores.

REFERENCIAS
BIBLIOGRÁFICAS:

CITAS
BIBLIOGRÁFICAS:

2. VARIOS, "Los Microorganismos", ed. Círculo de
   Lectores, cuarta edición, Barcelona, 1998,
   p.576.
3. Idem (1), p. 587.
4. Idem (1), p. 592.
5. VARIOS, "Enciclopedia Autodidáctica", tomo
   III, ed. Quillet, primera edición, Barcelona, 1999, p.
   349.
6. Idem (4), p. 355.

BIBLIOGRAFÍA:

Aurelio Hernández Muñoz,
"Microbiología", Editorial Paraninfo, Madrid, 1997.
VARIOS, "Enciclopedia Autodidáctica", Editorial Quillet,
Barcelona, 1998.
VARIOS, "Los Microorganismos", ed. Círculo Lectores, 4ta
edición, Barcelona, 1998

Url

http://www.promusmex.com
http://www.geocities.com

https://www.monografía.com

http://www.microbiología.com
http://www.biol.unlp.edu.ar/alimentos/ASIGNFERMEN.htm
http://www.uib.es/depart/dba/microcore/

Arias Edison – Lastra Jorge