Indice
1.
Introducción
2. Embriogénesis cigótica y
somática
3. Tecnología de la semilla
artificial
4. Aplicación
Práctica
5. Literatura Consultada
La semilla es el vehículo que conecta una
generación con otra en gran parte del reino vegetal. Por
medio de la semilla, las plantas son
capaces de transmitir su constitución genética
en forma generacional y por lo tanto las semillas son el medio de
multiplicación, almacenaje y dispersión mas
adecuado ( 1 ).
Son el sistema ideal de
propagación; ellas contienen cantidades importantes de
sustancias de reservas que aseguran el crecimiento y
establecimiento de las plántulas, son quiescentes para
minimizar la respiración y maximizar la longevidad y
están recubiertas por una testa que permite su
manipulación y reduce el ataque de patógenos ( 2
).
En los vegetales existen dos sistemas de
propagación: sexual y asexual.
En el caso de la reproducción sexual, se forman células
reproductoras especializadas, llamadas gametos. La fusión de
los gametos masculino y femenino lleva al desarrollo de
un embrión y posteriormente a la formación de la
semilla ( 1 ).
En la reproducción asexual, las nuevas plantas se originan
por medio de órganos vegetativos especializados, tales
como tubérculos, rizomas, estolones, bulbos, etc.; pero
además, lo hacen por otros métodos de
propagación como embriogénesis somática
natural ( apomixis, embriogénesis adventicia, etc. ),
micropropagación y embriogénesis somática in
vitro ( 3 ).
La embriogénesis somática in vitro es posible ya
que virtualmente cualquier tejido somático vegetal tiene
la capacidad de desarrollarse en un embrión (totipotencia)
a través de la manipulación de las condiciones de
cultivo y la aplicación de reguladores del crecimiento. La
primera demostración de que las plantas podían
producir embriones somáticos in vitro fue publicada en
1958 ( 4 ).
En la actualidad, la embriogénesis somática in
vitro es un hecho bien establecido en mas de 150 especies de
importancia agronómica. Los embriones somáticos se
pueden obtener de células vegetativas, de tejidos
reproductivos, de embriones cigòticos o de callos
producidos de cualquiera de los anteriores ( 5 ).
En otras palabras, embriogénesis somática in vitro
es el proceso por el
cual se forman embriones a partir de células vegetativas.
Por lo tanto, los embriones somáticos se desarrollan sin
la precedente fertilización, como ocurre en la
formación de los embriones cigóticos ( 4 ). A los
embriones somáticos les falta la testa y el endospermo,
los cuales proveen protección y nutrición al
embrión cigótico en las semillas naturales ( 6
).
Entre las ventajas que ofrece la producción de embriones somáticos
están: la posibilidad de producir una gran cantidad de
embriones ( alta eficiencia de
producción ); la característica de bipolaridad que distingue
a los embriones como plantas individuales; la similitud en
diferentes niveles de organización ( morfológico,
fisiológico y bioquímico ) con sus contrapartes
sexuales y su capacidad para producir una planta nueva durante
los procesos de
germinación y conversión ( 7 ).
Pero la característica sobresaliente de los embriones
somáticos es que se desarrollan de células
somáticas y por lo tanto presentan la potencialidad de
producir duplicados de un genotipo especifico. Esta
característica no solo permite la propagación
clonal, tanto en especies propagadas vegetativamente como por
semillas; sino también la multiplicación de
células somáticas a las cuales se les han
introducido genes específicos por ingeniería
genética. Los individuos genéticamente
modificados pueden ser multiplicados en forma segura y eficiente,
evitando los riesgos de la
incorporación de genes extraños
meióticamente inestables en el resto del germoplasma ( 8
).
La propagación de plantas, a través
de la embriogénesis somática, representa el
método
más eficiente de multiplicación clonal de plantas
que se ha desarrollado hasta la fecha ( 6 ).
Se puede emplear tanto en especies que se reproducen por semillas
como en aquellas de propagación vegetativa ( 9
).
La semilla artificial se define como la ingeniería de los embriones
somáticos que permite su uso en la propagación
comercial de plantas ( 10 ).
La tecnología de las
semillas artificiales implica el empleo de
embriones somáticos encapsulados en una testa
sintética protectora. Es un sistema de alta eficiencia de
multiplicación y por lo tanto al momento de dominar esta
tecnología los costos de
producción serán bajos.
Las ventajas inherentes a la semilla artificial son la
producción de muchos embriones somáticos y el
empleo de técnicas
de manejo convencionales de las semillas naturales. Estas
semillas artificiales son propágulos clonales de la fuente
parental, que tienen la capacidad para ser sembradas directamente
en el suelo o germinar
in vitro y luego sus plántulas ser
transplantadas.
El objetivo de la
tecnología de la semilla artificial es desarrollar un
sistema de propagación clonal, capaz de almacenar por
periodos largos de tiempo
propágulos vegetativos y que éstos se transformen
en una planta nueva ( 11 ).
Actualmente, la propagación vegetativa es una
practica limitada a cultivos de alto valor
comercial. Esta practica se podría difundir ampliamente si
se logran bajar significativamente los costos de
producción de la semilla artificial.
Con el empleo de la semilla artificial se
mejoraría la producción de especies propagadas
vegetativamente como papa, árboles
frutales, vid, etc. También aumentaría la
eficiencia de producción de árboles forestales,
palma datilera, hortalizas, ornamentales y oleaginosas como el
coco y la palma
En leguminosas y gramíneas forrajeras, como
alfalfa y dactylis, donde los cultivares son poblaciones
heterogéneas y heterocigotas; la semilla artificial
permitiría la multiplicación eficiente de plantas
sobresalientes ( 5 ).
Genotipos de especies de alto valor comercial podrían ser
propagados de esta manera, evitando el consumo de
tiempo y dinero de los
programas de
mejoramiento genético para desarrollar líneas
parentales.
Especies de coníferas con ciclos reproductivos muy largos
para producir semillas se podrían beneficiar de esta
tecnología.
Cultivos autógamos, como soya y algodón, donde la
producción de semilla híbrida solo es posible en
forma manual; la
semilla artificial seria la solución.
El empleo de la tecnología de la semilla artificial para
obtener semillas híbridas de tomate y sandia sin semilla,
donde el costo de la
semilla híbrida es muy alto ya que se debe producir
manualmente, permitiría el acceso de un gran numero de
agricultores a dicha semilla ( 12 ).
Finalmente, la semilla artificial puede cumplir funciones de
almacenamiento de
germoplasma. En especies de propagación vegetativa, la
conservación del germoplasma de hace muy difícil y
riesgoso; el empleo de embriones somáticos desecados
parece el método ideal para conserva este tipo de
germoplasma ( 2 ).
Dos tipos de semilla artificial han sido desarrollados en el
transcurso de esta linea de investigación.
En una primera etapa se emplean embriones somáticos
hidratados sin protección en la propagación de
plantas de alto valor, como las ornamentales, donde la eficiencia
de la embriogénesis somática reduce los costos en
comparación con la micropropagación que requiere
recursos
humanos especializados e infraestructura adecuada. Sin
embargo, los propágulos eran muy débiles y
delicados.
Para evitar este problema, embriones somáticos
individuales fueron encapsulados en un hidrogel, tal como
alginato de calcio. Los embriones son mezclados con alginato de
sodio y luego sumergidos en una solución con una sal de
calcio para formar cápsulas de alginato de calcio ( 3 ).
Estos embriones hidratados y encapsulados pueden ser almacenados
usando temperaturas bajas por algunas semanas. La frecuencia de
conversión ( porcentaje de embriones somáticos que
forman una planta completa ) en vitro para alfalfa fue de 60-90%,
mientras que en siembras en invernáculos fue de tan solo
2-10% ( 11 ).
La etapa actual de desarrollo es la producción de semilla
artificial deshidratada.
Este tipo de semilla permite prolongar el periodo de almacenaje
por varios años, para ello los embriones somáticos
deben ser
inducidos a presentar tolerancia a la
desecación, para luego bajar el contenido de humedad de la
semilla que permita su almacenaje seguro ( 13
).
La producción de semilla artificial desecada se aproxima
al ideal, que es la semilla natural ortodoxa.
A la fecha, ninguno de los métodos de encapsulacion es
completamente satisfactorio. Las cápsulas hidratadas son
más difíciles de almacenar, debido a los
requerimientos de respiración de los embriones. Un segundo
problema de estas cápsulas es que se secan
rápidamente, por lo que deben ser almacenadas en un
ambiente
húmedo o emplear una membrana hidrofóbica.
Para ambos métodos de encapsulación, todavía
no se ha podido desarrollar un endospermo artificial apropiado.
Sé esta estudiando el suministro de carbohidratos
y otros nutrientes necesarios en el crecimiento del
embrión.
Sin embargo, el aspecto más limitante de esta
tecnología es la producción de embriones
somáticos vigorosos de alta calidad
fisiológica. Para que la semilla artificial sea
competitiva en el ámbito comercial, sus embriones
somáticos deben germinar rápidamente y desarrollar
plántulas en frecuencias similares a la semilla natural (
15 ).
De lo anterior se desprende que la producción a gran
escala de la
semilla artificial debe superar algunos retos. Primero se debe
contar con un sistema de embriogénesis somática
modelo, el
cual sea reproducible en condiciones controladas y que al mismo
tiempo se tengan altos niveles de producción de embriones
de alta calidad fisiológica ( 16). En segundo lugar se
debe caracterizar el germoplasma, ya que la embriogénesis
somática es controlada genéticamente.
Por ultimo, se requiere del diseño
de bioreactores específicos para la producción de
embriones somáticos a gran escala y de este modo lograr
bajar los costos para que dicha tecnología sea competitiva
( 17 ).
2. Embriogénesis
cigótica y somática
Una primera diferencia entre embriones cigóticos
y somáticos son sus sistemas de iniciación. Los
embriones cigóticos se forman a partir de la unión
de los gametos, la doble fecundación y las plantas que se originan
son híbridas por la recombinación meiótica
de sus genes.
Por el contrario, los embriones somáticos se originan de
células vegetativas de un único individuo y las
plantas resultantes son duplicados genéticos o clones de
la planta madre.
Sin embargo, tanto los embriones cigóticos como
somáticos comparten similar ontogenia. Ambos embriones
pasan por los estados globular, torpedo y cotiledonal en especies
dicotiledóneas y coníferas ( 18 ) o por los estados
globular, escutelar y coleoptilar en monocotiledóneas ( 9
).
No obstante, existen diferencias significativas que limitan su
uso como método de propagación. Por ejemplo,
especies que son monoembriónicas y producen embriones
cigóticos vía un suspensor, generalmente dan origen
a embriones somáticos por un sistema evolutivo poco
desarrollado donde se forma una masa de tejido embrional (
denominado complejo proembrional ) con múltiples embriones
somáticos. Las razones para este retroceso hacia un tipo
de desarrollo primitivo son desconocidas ( 8 ). Dicha masa de
embriones somáticos se desarrolla en forma
asincrónica, de tal forma que múltiples estados de
desarrollo embrional están presenten en el cultivo en
cualquier momento. Al desarrollarse en diferentes momentos
están sujetos a cambios en el régimen nutricional
del medio de cultivo. En este ambiente fluctuante desde el punto
de vista nutricional, los embriones se vuelven desorganizados,
forman nuevas células embriogénicas y de esta
manera contribuyen a la asincronía
También ocurre una germinación precoz, donde dichos
embriones forman solo raíces o tallos; no es una
germinación que de origen a una plántula
normal.
Otro problema es que los embriones somáticos generalmente
muestran anormalidades estructurales como cotiledones extras y
meristemas apicales pobremente desarrollados ( 18 ).
Todos estos problemas se
deben a las condiciones de cultivo y no a factores
intrínsecos de los embriones somáticos, ya que
embriones cigóticos inmaduros al ser removidos de las
semillas y cultivados in Vitro presentan similares
irregularidades ( 20 ).
Otra diferencia significativa entre embriones cigóticos y
somáticos, es que a los embriones somáticos les
falta la fase de quiescencia ( 21 ).
Los embriones cigóticos maduros de las semillas ortodoxas,
al llegar a la madurez se deshidratan y entran en un periodo de
reposo o quiescencia, que es el principal factor para que las
semillas puedan ser almacenadas.
Por el contrario, los embriones somáticos continúan
creciendo, algunos germinan, otros se vuelven desorganizados y se
transforman en tejido proembrional y otros mueren. La falta de
una fase de reposo en los embriones somáticos es el mayor
obstáculo de su utilización como semilla artificial
( 9 ).
3. Tecnología de la
semilla artificial
En esta sección se describirá la
tecnología de la semilla artificial de alfalfa
( Medicago sativa L.), ya que es la especie donde se han logrados
los mayores avances y por tal motivo ha sido usada como sistema
modelo para desarrollar los conceptos y principios de
esta tecnología. En consecuencia, se considera pertinente
resumir la información generada hasta la fecha ( 2
).
A.- Producción de embriones somáticos
Para inducir la embriogénesis somática se requiere
un cambio en el
destino de la célula
vegetativa (somática). Generalmente, se requiere de un
tratamiento inductivo que inicie la división celular y
establezca una nueva polaridad en la célula
somática ( 6 ). Las auxinas cumplen esta función y
en alfalfa se emplea comúnmente el 2,4-D, pero otras
auxinas como 2,4,5-T son efectivas ( 6 ).
La respuesta de las auxinas es muy compleja; algunas auxinas como
ácido indolacético son inefectivos y otros
estimulan la formación de callos pero no de embriones
somáticos ( ácido clorofenoxiacético ).
Compuestos inorgánicos como potasio y compuestos
orgánicos como prolina en el medio de cultivo se han
empleado para regular la embriogénesis o formación
de callos, pero ellos no reemplazan a las auxinas ( 22 ).
Un aspecto muy importante de la embriogénesis
somática es su control
genético ( 23 ).
Como en la mayoría de las especies, muy pocas plantas de
una población de alfalfa responden al 2,4-D en
un medio de cultivo y producen embriones somáticos. La
embriogénesis somática es una característica
controlada genéticamente y que se hereda sexualmente ( 24
). Está controlada por dos genes dominantes independientes
( 25 ).
En la variedad Rangerlander se identificó un genotipo,
denominada RL 34, que es altamente embriogénico y
genéticamente estable en cultivos in Vitro ( 6 ).
Sin embargo, tienen una serie de características
agronómicas indeseables ( susceptible a enfermedades, bajo vigor y
rendimiento de semilla ).
Por tal motivo, se estableció un programa de
selección recurrente con el fin de
transferir estos dos genes que controlan la embriogénesis
somática en RL 34 a variedades de alfalfa adaptadas de
Canadá y USA.
Luego de 4 retrocruzamientos en 7 variedades, se encontró
una alta frecuencia de estos genes en dichas variedades.
La evaluación
a campo de este germoplasma mostró individuos con alto
potencial de rendimiento de forraje, buena producción de
semilla y capacidad combinatoria elevada con otros genotipos ( 26
).
B.- desarrollo de embriones somáticos
Para permitir el desarrollo de embriones somáticos en un
medio de cultivo, la suspensión se filtra y la
fracción colectada se esparce en un medio de cultivo que
le falta reguladores de crecimiento. El filtrado permite la
homogenización en tamaño y estado de
desarrollo de los embriones somáticos. Aproximadamente a
los 4 días posteriores al filtrado, comienzan a aparecer
embriones en el estado
globular, luego pasan por el estado de corazón y
a los 7-10 días se encuentran en el estado de torpedo ( 6
). Una vez que están en el estado de torpedo, los
embriones somáticos comienzan a presentar
germinación precoz . Al germinar en este momento, no han
tenido suficiente tiempo para almacenar sustancias de reservas o
adquirir la tolerancia a la desecación, por lo que estos
embriones no entran en el estado de quiescencia. Para evitar
estos inconvenientes, los embriones se colocan en un medio con
tensión osmótica al incluir 5-6% de sucrosa en
lugar del 3% normal; de esta forma se previene la
germinación precoz y los embriones siguen su desarrollo.
Por lo tanto, los embriones siguen acumulando proteínas
y carbohidratos ( 27 ). La acumulación de proteínas
de almacenaje se favorece por la inclusión de una fuente
de nitrógeno orgánico ( glutamina ) y una fuente de
sulfuro inorgánico (sulfato de potasio ) ( 28 ).
El estado de maduración final se logra al transferir los
embriones a un medio conteniendo ácido abscisico. Este
regulador del crecimiento aparentemente inicia un proceso que
lleva a la adquisición de la tolerancia a la
desecación.
Otros tratamientos físicos como frío, calor,
tensión osmótica, etc. pueden lograr similar
respuesta, presumiblemente debido a que estimulan la síntesis
endógena de ácido abscísico
Los embriones somáticos, al desarrollarse en un medio de
cultivo normal, no pueden acumular las proteínas de
reserva 2S y 11S que se encuentran en los embriones cigoticos. La
causa de esto es la insuficiencia de nutrientes ( 28 ).
Para entender este fenómeno, se debe reconocer que el
potencial embriogénico del sistema de medio de cultivo es
espectacularmente alto. Por ejemplo, en una caja de Petri se
pueden desarrollar al mismo tiempo 900 embriones somáticos
en un medio de 25-30 ml. Aquí no hay suficiente N y S para
el crecimiento de 900 embriones. Por lo que los medios de
cultivos para la fase de maduración deben contener grandes
cantidades de glutamina y sulfato . Si los requerimientos de los
embriones son satisfechos, tanto por el agregado de estos
nutrientes como por la transferencia a un medio nuevo, los
embriones somáticos acumulan proteínas de reserva
que se aproxima el 50% de la cantidad encontrada en los embriones
cigoticos ( 27 ).
La proporción de sustancias de reservas que se acumulan en
los embriones somáticos es regulada por la relación
C:N en el medio de cultivo ( 27 ). Una alta relación C:N
incrementa la acumulación relativa de carbohidratos con
respecto a las proteínas.
Considerando que la nutrición juega un rol crítico
en la maduración de los embriones, se debe controlar
aquellos factores
físicos que tienen influencia en la nutrición, como
la densidad de
siembra ( número de embriones somáticos por caja de
Petri ). En forma similar la intensidad de luz debe ser
considerada durante el proceso de desarrollo del cultivo ( 29
).
C.- Tolerancia a la desecación
La tolerancia a la desecación es una característica
de los embriones somáticos que debe ser inducida y por lo
tanto requiere de un pretratamiento con ácido
abscísico u otro factor para lograr la respuesta
deseada.
El tipo de pretratamiento, la duración de su
aplicación y el estado de desarrollo del embrión
son factores críticos ( 30 ).
El sistema de secado de los embriones tiene una importancia
secundaria. Si los embriones son inmaduros, un secado lento
durante una semana es lo ideal, pero si predominan los embriones
maduros un secado rápido es preferible ( 31 ).
Tolerancia a la desecación es una característica
cuantitativa y no cualitativa, por lo que los embriones
varían en el grado de tolerancia. Esto es particularmente
cierto entre diferentes especies, pero también se pone en
evidencia con diferentes tratamientos inductivos ( 2 ).
Durante el secado los embriones experimentan cambios
metabólicos, en particular con el tipo y cantidad de
carbohidratos. Antes del secado, los embriones somáticos
de alfalfa contienen cantidades importantes de sucrosa, glucosa y
fructosa; mientras que luego del secado, las cantidades de
glucosa y fructosa disminuyen significativamente ( 32 ). Dada la
importancia de estos azucares en el proceso de tolerancia a la
desecación en las semillas, estos cambios podrían
ser muy significativos ( 33 ).
El método de secado en alfalfa consiste en colocar los
embriones somáticos en una cámara sellada
conteniendo una solución salina saturada que controla la
humedad relativa interior ( 31 ). Diariamente, durante una
semana, los embriones son transferidos a cámaras con
humedades relativas progresivamente mas bajas y finalmente se
secan en condiciones de laboratorio.
En este momento los embriones somáticos han alcanzado un
contenido de humedad de 10-15 % y de este modo pueden ser
almacenados por un periodo de tiempo superior al año, sin
que se afecte significativamente su viabilidad ( 32 ).
D. – Encapsulado
Los materiales
usados para encapsular los embriones somáticos son
análogos a la testa de las semillas naturales ( 9 ).
Las testas sintéticas no solo deben cumplir la
función de protección física de los
embriones somáticos, sino que además deben permitir
que dichas cápsulas contengan nutrientes,
antibióticos, funguicidas, microorganismos, etc. como
elementos que favorecen la germinación y posterior
sobrevivencia de la plántula( 5 ).
El encapsulado de los embriones somáticos permite
además el manipuleo y empleo de equipos convencionales de
siembra ( 10 ).
Dos tipos de encapsulación han sido desarrollados:
hidratado y seco.
Para ciertas especies hortícolas, que deben ser sembradas
en el invernadero previo a ser transplantadas, embriones
somáticos no quiescentes colocados en una cápsula
hidratada puede ser la solución. Tal encapsulación
suministra protección a los embriones somáticos y
permiten un conveniente manejo similar a las semillas naturales.
Para este tipo de encapsulación se emplea alginato de
calcio y ha tenido éxito
en varias especies; sin embargo, el establecimiento permanece
bajo todavía ( 14 Los estudios de encapsulación con
hidrogeles como el alginato han sido pioneros en el desarrollo de
la tecnología de semillas artificiales, la
información que se ha generado sientan las bases para
buscar nuevas alternativas que hagan más cercano el
concepto de "
semilla somática " ( 34 ).
Este método tiene el inconveniente de la capacidad de
almacenaje, no se han podido lograr periodos de almacenaje
superiores a los 30 días.
La forma de semilla artificial que más se asemeja a la
semilla natural en sus cualidades de almacenaje y manejo es la
utilización de embriones somáticos quiescentes y
desecados en cápsulas simulando una testa. En este sistema
se trata de hacer todavía más semejante la fisiología y bioquímica
de los embriones somáticos con los sexuales.
En zanahoria se ha desarrollado dicho método, donde se
emplea una resina plástica soluble llamado Polyox ( 35
).
Un medio de cultivo rico en embriones somáticos se mezcla
con Polyox y se secan con aire
estéril en condiciones ambientales de temperatura y
humedad relativa. El secado es rápido, se alcanza el
equilibrio en
aproximadamente 4 horas. Solo los embriones encapsulados en
Polyox sobreviven al secado; embriones somáticos sin
encapsular no sobrevivieron al secado.
E.- germinación, conversión y vigor
Si bien los embriones somáticos pueden ser secados y
alcanzar contenidos de humedad del 10-15%, ser almacenados por
varios meses; cuando se ponen a imbibir y germinar, el vigor de
las plántulas de estos embriones somáticos es muy
inferior al vigor de las plántulas de semillas naturales (
6 ).
La razón de este bajo vigor no esta claro, pero existen
varias explicaciones posibles.
A los embriones somáticos secos les puede faltar
proteínas de reserva o algún otro requerimiento
esencial para el desarrollo de las plántulas. Incrementos
en el nivel de proteínas de reserva han mejorado el vigor
( 36 ).
Los embriones somáticos almacenan almidón y
sucrosa, mientras que las semillas naturales almacenan una
hemicelulosa en las paredes celulares llamada galactomanana. En
un principio se pensó que los carbohidratos no estaban
disponibles para la germinación de los embriones
somáticos, sin embargo, se observó que las reservas
de almidón y sucrosa en los embriones somáticos
eran rápidamente consumidas luego de la germinación
( 37 ).
El consumo de agua de los
embriones somáticos secos es muy rápido en
comparación a las semillas naturales. Debido a que los
embriones somáticos les faltan una testa, no hay una
barrera que controle el consumo de agua. Por lo que otra posible
causa del vigor bajo de las semillas artificiales son los
daños ocurridos durante el proceso de
imbibición.
Otra causa que influye significativamente en el pobre vigor de
las plántulas es el desarrollo anormal de la
plúmula.
En el proceso de germinación de embriones somáticos
se deben diferenciar dos términos: " germinación "
que es definida como el proceso que culmina con la
potrusión de la radícula y " conversión "
que es la emergencia de la radícula y el tallo. Raramente
un embrión somático da origen a una plántula
con parte aérea sin raíces; pero la emergencia de
la radícula sin la plúmula es muy común.
Esto nos estaría indicando que los meristemas radiculares
son más resistentes al proceso de desecación que
los meristemas apicales. Por lo que si bien los porcentajes de
germinación entre semillas naturales y embriones
somáticos secos son muy similares; los porcentajes de
conversión son mucho más bajos en embriones
somáticos ( 37 ).
Aunque las proteínas y carbohidratos de reservas son
hidrolizados rápidamente en el proceso de
imbibición, la germinación de embriones
somáticos en un medio con nutrientes, origina
plántulas sustancialmente más vigorosas ( 38 ).
Se piensa que uno de los principales factores que limita el
desarrollo de las semillas artificiales es probablemente la
disponibilidad de nutrientes. Para superar este problema, los
embriones somáticos deben poseer su propia fuente de
nutrientes ( alto contenido de proteínas y carbohidratos
de reserva) o proporciónaselos en forma endógena a
través de un endospermo artificial ( 6 ).
F.- producción comercial
La automatización de la producción de
semilla artificial permitiría reducir los costos de
producción y por lo tanto ser competitiva con la semilla
natural ( 8 ).
La producción de semilla artificial puede ser dividida en
etapas, cada una de las cuales son factibles de
automatización.
Etapas :
1º.- Crecimiento de células embriogénicas en
un medio de cultivo.
2º.- Selección de embriones somáticos
3º.- Encapsulado y deshidratación
Para la primer etapa se debe contar con sistemas de
embriogénesis somática bien desarrollados y
reproducibles cien por cien, que incluyan la producción de
embriones somáticos de alta calidad a gran escala por
medio de bioreactores
El empleo de bioreactores para la producción a gran escala
de embriones somáticos permite el control simultaneo del
pH, la
concentración de oxigeno, de
otros gases, el
potencial de oxido-reducción del medio, la temperatura y
el mezclado. Los bioreactores además permiten la cosecha
continua de embriones somáticos del medio de cultivo.
Minimizan la
contaminación y maximizan la homogeneidad del cultivo
( 10 ).
Un gran numero de embriones somáticos pueden ser
multiplicados en la masa de cultivo ( un gramo de inoculo origina
2300 embriones somáticos en Dactylis glomerata) de un
bioreactor.
Para la segunda etapa es posible desarrollar equipos de
clasificación basados en la tecnología de la
máquina de visión, ya que los embriones
somáticos se ajustan dentro de un rango discreto por su
tamaño y forma ( 8 ). Tales máquinas
deberán permitir la elección de embriones
somáticos de alta calidad.
Finalmente, la automatización del encapsulado y
deshidratación es factible de lograr en forma
simultánea con el empleo de una testa sintética
osmóticamente activa. Los embriones hidratados se
colocarían en dicho material y comenzarían a perder
agua durante el proceso de endurecimiento de la cápsula.
El contenido de humedad final de las semillas artificiales se
controlaría por medio de la composición de la
mencionada testa sintética ( 9 ).-
La semilla artificial al combinar el sistema de
propagación vegetativa
( multiplicación clonal ) con la capacidad de almacenaje a
largo tiempo tiene diversas aplicaciones en la agricultura (
3, 8 ).
La aplicación de este sistema en la producción de
semilla híbrida de alfalfa ha sido discutida en detalles (
4, 6 ).
La semilla artificial ofrece la oportunidad de almacenar plantas
genéticamente heterocigotas o plantas sobresalientes con
una única combinación de genes que no
podrían ser mantenidas por métodos convencionales
de producción de semillas debido a la recombinación
genética que existe en cada generación de
multiplicación de semillas ( 9 ).
Muchas especies son estériles y no producen semillas. La
embriogénesis somática puede ser una alternativa
con relación a los esquejes para propagar este tipo de
plantas.
Otras especies, en particular algunas tropicales, producen
semillas recalcitrantes que no pueden ser secadas. En
consecuencia, el almacenaje de larga duración en bancos de
germoplasma en estas especies no es posible. La semilla
artificial puede ser una alternativa en la medida que se conozca
más el mecanismo por el cual este tipo de semillas no
presenta tolerancia a la desecación ( 33 ).
En especies autógamas, donde la producción de
semilla híbrida es difícil y muy cara, la
tecnología de la semilla artificial ofrece muchas ventajas
y oportunidades ( 12 ).
Una de las limitantes del método de micro
propagación es que deben estar en un mismo sitio
físico los laboratorios de cultivo de tejidos y los
invernaderos, ya que la producción de propágulos
debe ser sincronizada en aquellos periodos de máxima
demanda del
mercado. La
producción de semilla artificial en estas especies no
implicaría ligar las instalaciones del laboratorio con los
invernáculos ( 8 ).
Especies ornamentales
El mercado de las especies ornamentales implica un movimiento
anual de dinero muy importante. El alto costo de
producción de estas especies esta dado por la laboriosidad
de la micro propagación y la mano de obra necesaria en las
etapas posteriores de multiplicación y producción.
El empleo del sistema de embriogénesis somática en
estas especies reduciría significativamente los costos de
mano de obra.
Especies hortícolas
En ciertas especies hortícolas se emplea semillas
híbridas de alto costo y por lo tanto el valor por planta
es muy alto. Por ejemplo, en tomate y sandia sin semillas se
emplean semillas híbridas de muy alto costo. El motivo de
este alto costo es que las polinizaciones se realizan en forma
manual, requiriéndose un alto consumo de mano de obra. En
otras especies se emplea la reproducción vegetativa que
también consume mucho tiempo, espacio y mano de obra.
El empleo de la tecnología de la semilla artificial
reduciría considerablemente los costos, al reducir la mano
de obra necesaria, el tiempo y el espacio ( 41 ).
Coníferas
Las especies forestales coníferas pueden ser propagadas en
forma económica a través de semillas.
Los programas de mejoramiento genético convencionales en
estas especies consumen mucho tiempo ya que el ciclo de vida
de las coníferas es muy largo.
Los montes de coníferas son muy heterogéneos ya que
la semilla de individuos sobresalientes no necesariamente da
origen a una progenie mejorada.
La semilla artificial ofrece la posibilidad de clonar aquellos
árboles sobresalientes a costos razonables y en un tiempo
mínimo ( 9 ).
Cultivos industriales
En el ámbito comercial es muy difícil producir
semilla híbrida a bajos costos en especies como
algodón ( Gossypium hirsitum L.) y soya ( Glicine max
Merril .) debido a que presentan flores cleistógamas y con
problemas de abscisión. Por lo que la semilla que se
emplea actualmente en estas especies proviene de
autopolinizaciones. Sin embargo, semilla híbrida en
pequeñas cantidades se produce en forma muy laboriosa por
medio de la polinización manual.
Este pequeño volumen de
semilla híbrida podría ser multiplicado en forma
masiva a través de la tecnología de la semilla
artificial. De esta forma, el vigor híbrido podría
ser utilizado a nivel comercial al originarse una
reducción importante de costos ( 42 ).
Especies forrajeras
La siembra de semilla de variedades sintéticas es una
práctica común en especies forrajeras como alfalfa
( Medicago sativa L. ) y orchargrass ( Dactylis glomerata L.).
Tales variedades provienen de la selección y
entrecruzamiento de líneas fenotípicamente
uniformes, pero distintas genotípicamente. Estas
líneas al cruzarse libremente año tras año
para producir semillas, originan poblaciones heterocigotas y
heterogéneas.
El empleo de la semilla artificial permite la
multiplicación de genotipos sobresalientes y
genéticamente uniformes, ya que por este método no
es necesario que anualmente se efectué la
polinización cruzada ( 6 ).
Frutales
La gran mayoría de las especies frutales se propagan
vegetativamente debido a la presencia de autoincompatibilidad y a
los ciclos de mejoramiento genético muy largos. El empleo
de la semilla sintética facilitaría su
propagación.
Sin embargo, la mayor utilidad de la
semilla artificial estaría en la conservación del
germoplasma de estas especies ( 43 ). Actualmente se mantienen
bancos de germoplasma como plantas vivas en el campo. Este
método de conservación es muy caro y peligroso, ya
que esta expuesto a los desastres
naturales. El uso de semilla artificial permitiría
conservar estos clones en un pequeño espacio, en
condiciones controladas ( cryopreservación) y sin el
peligro de los desastres naturales.
Además, este sistema de conservación de germoplasma
seria particularmente útil en especies tropicales donde
las medios de conservación son inadecuados o
inexistentes.
La vid ( Vitis spp.) es un ejemplo práctico de este
sistema de conservación.
Cereales
En especies alógamas como el maíz donde
la producción de semilla híbrida es una
práctica muy difundida. La creación de
híbridos a través de un programa convencional de
mejoramiento genético consume mucho tiempo y recursos en la
obtención y mantenimiento
de las líneas parentales adecuadas.
Una posibilidad es el empleo de la semilla artificial para
propagar aquellos genotipos sobresalientes sin la necesidad de
generar líneas parentales costosas en tiempo y dinero.
Esto podría facilitar la comercialización de nuevos híbridos
y estimular el surgimiento de nuevas empresas
semilleras, ya que seria posible producir nuevos híbridos
sin la necesidad de tener un gran volumen de líneas
parentales ( 9 ).
En especies autógamas como trigo, cebada y avena donde la
producción de semilla híbrida a nivel comercial no
es posible por los altos costos de producción, la semilla
artificial permitiría difundir la semilla
híbrida.
En este caso, se producirían pequeñas cantidades de
semilla híbrida en forma manual y luego, con la
tecnología de la semilla artificial se realizaría
la multiplicación masal ( 44 ).
Recuperación de la flora autóctona
En nuestro planeta cada vez son mas las especies que están
en proceso de desaparición por el manejo inconsciente del
ser humano. Aumenta la tala indiscriminada de las selvas, aumenta
la desertificación, desaparecen bosques, etc. Muchas de
estas especies nativas no se pueden propagar vegetativamente o
producen muy bajas cantidades de semillas.
Por tal motivo la semilla artificial es una alternativa para
estas especies ( 45 ).
Por ejemplo, en Australia ( 46 ) se ha logrado obtener eucaliptos
tolerantes a los suelos salinos.
Estos eucaliptos no pueden multiplicarse por estacas ni por
semillas verdaderas. Una opción es la tecnología de
la semilla artificial.-
Transgénicos
Los cultivos provenientes de plantas genéticamente
modificadas han experimentado un gran auge en los ultimos
años. Existe poca información de lo que ocurre con
estos organismos genéticamente modificados en su proceso
de reproducción sexual. Cabe la posibilidad que durante su
multiplicación sexual, los genes introducidos de otras
especies, sea inestables meióticamente y se pierdan.
Con el empleo de la tecnología de la semilla artificial se
evitarían tales riesgos. En forma similar, esta
tecnología se podría emplear en la
propagación de híbridos somáticos y
citoplásmicos ( obtenidos a través de la
fusión protoplásmica ) y en genotipos
estériles e inestables ( 44 ).
5. Literatura
Consultada
1.- Bewley,J.D. y M. Black. 1985. Seeds : Physiology of
development and germination. Plenum Press. New York. 367
pp.-
2.- McKersie, B.D. 1995. Somatic Embryogenesis in
Alfalfa : A Model for the Development of Dry Artificial Seed
Technology. Pags. 833-846. En: Seed Development and Germination.
Eds. Kigel, J. y Galili, G.- Marcel Dekker, Inc. New York. 853
pp.-
3.- Redenbaugh, K. (ed.). 1993. Synseeds : Application of Seeds
to Crop Improvement. Boca Raton, Fla. CRC Press. 481 pp.-
4.- McKersie, B.D. y S.R. Bowley. 1993. Synthetic Seed of
Alfalfa. En : K. Redenbaugh (ed.) Synseeds : Application of
Synthetic Seeds to Crop Improvement. CRC Press. Pgs :
231-255.-
5.- Copeland,L.O. y M.B. McDonald. 1995. Principles of Seed
Science and Technology. 3ª edition. Chapman & Hall. New
York.- 409 pp.-
6.- McKersie,B.D. y D.C.W. Brown. 1996. Somatic embryogenesis and
artificial seeds in forage legumes. Seed Science Research 6 :
109-126.
7.- Zimmerman, J.L. 1993. Somatic embryogenesis : a model for
early development in higher plants. Plant Cell 5 :
1411-1423.-
8.- Gray,D.J. y A. Purohit. 1991. Somatic Embryogenesis and
Development of Synthetic Seed Technology. Critical Review in
Plant Sciences 10 (1) : 33-61.-
9.- Gray, D.J. 1997. Synthetic Seed for Clonal Production of Crop
Plants. Págs. : 29-45. En : R.B. Taylorson ( ed.) Recent
Advances in the Development and Germination of Seeds.
10.- Desai,B.B., P.M. Kotecha y D.K. Salukhe. 1997. Seeds
Hanbook. Biology, Production, Processing and Storage. Capitulo 6.
Pags. 91-113.-
11.- Redenbaugh, K. 1990. Application of Artificial Seed to
Tropical Crops. HortScience 25 (3): 251-255.-
13.- Senaratna,T, B.D. McKensie y S.R. Bowley. 1989. Desiccation
tolerance of alfalfa ( Medicago sativa L.) somatic embryos. Plant
Sci. 65 : 253-259.
14.- Redenbaugh, K., D.Slade, P. Viss y J. Fujii. 1987.
Encapsulation of somatic embryos in synthetic seed coats.
HortScience 22 : 803-809.-
15.- Anandarajah, K. y B.D. Mckensie. 1990. Enhanced vigor of dry
somatic embryos of Medicago sativa L. with increased sucrose.
Plant Sci. 71: 261-266.
16.- Parrot, W.A., S.A. Merkle y E.G. Williams. 1993. Somatic
embryogenesis : Potential use in propagation and gene transfer
systems. En : Synseeds Applications of synthetic seeds to crop
improvement. Redenbaugh, K. (ed.). CRC Press. Pags. 158-199.-
17.- Takayama, S. y M. Akita. 1994. The types of bioreactors used
for shoots and embryos. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 39 :
147-156.
18.- Ammirato, P.V. Organizational events during somatic
embryogenesis. En Plant Tissue and Cell Culture. Alan R. Liss.
New
York. 1987.
19.- Conger,B.V., J.C. Hovanesian, R.N. Trigiano y D.J. Gray.
1989. Somatic embryo ontogeny in suspension cultures of
orchardgrass. Crop Sci. 29 : 448-450.
20.- Norstog, K. 1965. Development of cultured barley embryos.
Am.J. Bot. 52: 538-540.
21.- Gray, D.J. 1987. Quiescence in monocotyledonous and
dicotyledonous somatic embryos induced by deshydration.
HortScience 22 : 810-814.
22.- Shetty, K. y B.D. McKersie. 1993. Proline, thioproline and
potassium mediated stimulation of somatic embryogenesis in
alfalfa ( Medicago sativa L.). Plant Sci. 88 : 185-193.-
23.- Henry, Y. y P. DeBuyser. 1994. Genetic análisis of in vitro plant tissue culture
responses and regeneration capacities. Euphytica 79 : 45-58.-
24.- Hernandez, M.M. y B.R. Cristie. 1989. Inheritance of somatic
embryogenesis in alfalfa ( Medicago sativa L.). Genome 32 :
318-321.
25.- Kielly, G.A. y S.R. Bowley. 1992. Genetic control of somatic
embryogenesis in alfalfa. Genome 35 : 474-477.-
26.- Bowley, S. R. et al. 1993. Fiel evaluation following two
cycles of backcross transfer of somatic embryogenesis to
comercial alfalfa germplasm. Can. J. Plant Sci. 73 : 131-137.
27.- Lai, F.M. y B.D. McKersie. 1994. regulation of starch and
protein accumulation in alfalfa ( Medicago sativa L.) somatic
embryos. Plant Sci. 100 : 211-219.-
28.- Lai, F.M., T. Senaratna y B.D. McKersie. 1992. Glutamine
enhance storage protein síntesis in Medicago sativa L.
somatic embryos. Plant Sci. 87 : 69-77.
29.- Anandarajah, K. y B.D. McKersie. 1992. Influence of planting
density, sucrose and light during development on the germination
and vigour of medicago sativa L. somatic embryos after
desiccation. Seed Sci. Res. 2 . 133-140.
30._ Lecouteux, C., F.M. Lai y B.D. Mckersie. 1993. Maturation of
somatic embryos by abscisic acid, sucrose and chilling. Plant
Sci. 94: 207-213.
31.- Senaratna, T., B.D. Mckersie y S.R. Bowley. 1989.
Desiccation tolerance of alfalfa ( Medicago sativa L.) somatic
embryos. Influence of abscisic acid, stress
pretreatments and drying rates. Plant Sci. 65: 253-259.-
32.- Horobowicz, M., R.L. Obendorf, B.D. Mckersie y D.R. Viands.
1995. Soluble saccharides and cyclitols in alfalfa ( Medicago
sativa L.) somatic embryos, leaflets and mature seeds. Plant Sci.
109 : 191-198.
33.- Leprince, O., G.A.F. Hendry y B.D. Mckersie. 1993. The
mechanisms of desiccation tolerance in developing seeds. Seed
Sci. Res. 3 . 231-246.-
34.- Redenbaugh, K., J.A. Fujii y D. Slade. 1993. Hydrated
coating for synthetic seeds. En . Synseeds : Applications of
synthetic seeds to crop improvement. Redenbaugh, K. (editor). CRC
Press, pp 35-46.-
35.- Kitto, S.L. y J. Janick. 1985. Production of synthetic seeds
by encapsulating asexual embryos of carrot. J. Am. Soc. Hort.
Sci. 110 : 277-280.
36.- Lai, F.M. y B.D. McKersie. 1994. regulation of storage
protein síntesis by nitrogen and sulphur nutrients in
alfalfa ( Medicago sativa L.) somatic embryos. Plant Sci. 103:
209-221.
37.- Lai, F.M., C.G. Lecouteux y B.D. Mckersie. 1995. germination
of alfalfa ( Medicago sativa L.) seeds and somatic embryos. I.
Mobilization of storage reserves. J. Plant Physiol. 145 :
507-513.-
38.- Lai, F.M. y B.D. McKersie. 1995. germination of alfalfa (
Medicago sativa L.) seeds and somatic embryos. II. Effect of
nutrient supplements. J. Plant Physiol. 146 : 731-735.-
39.- Stuar, D.A., S.G. Strickland y W.A. Walter. 1987. Bioreactor
Production of Alfalfa Somatic Embryos. HortScience 22 (5) :
800-803.-
40.- Datta,K.B., B. Kanjilal y D. De Sarker. 2001. Artificial
seed technology : Development of a protocol in Geodorum
densiflorum ( Lam ) Schltr.- An endangered orchid. Current
Science 76 (8) . 1142-1145.-
41.- Cheé, R.P. y D.J. Cantliffe. 1992. Improved
production procedures for somatic embryos of sweet potato for a
synthetic seed system. HortScience 27: 1314-1316.
42.- Tian, I. Y D.C. Brown. 2000. Improvement of soybean somatic
embryo development and maturation by abscisic acid treatment.
Can. J. Plant Sci. 80 : 721-726.
43.- Towill, L.E. 1988. Genetic considerations for germplasm
preservation of clonal materials.- HortScience 23 : 91-93.-
44.- Kumar, U. 1998. Synthetic Seeds for Commercial Crop
Production. 160 pp. Vedams Books (P) Ltd. New Delhi. India.
45.- Park,Y.S., J.D. Barret y J.M. Bonga. 1998. Application of
somatic embryogenesis in high-value clonal forestry. In Vitro
Cell. Develop. Biol. 34 83) : 231-239.
46.- Dixon, K. 1998. New synthetic seed technology. Kings Park
and Botanic Gardens. West Perth. Australia.
Autor:
Alberto Artola