- Resumen
- Identificación y delimitación del
problema - Antecedentes
- Metodología
- Estudio de las variables
- Algunas consideraciones sobre las
técnicas a utilizar en el ámbito del trabajo de
laboratorio con técnicas habituales en
inmunología básica - Bibliografía
Resumen
Se plantea la posibilidad de
utilización de material embrionario de artrópodo
para la inducción en mamíferos (incluidos los
humanos) de anticuerpos capaces de reaccionar con los
"antígenos ocultos" de los artrópodos
patógenos .
La actual lucha contra las enfermedades
transmitidas artrópodos, está muy limitada por la
dificultad de encontrar una solución eficaz de profilaxis
y el tratamiento en su caso las medidas de control en la
mayoría de los casos son caras, de difícil
despliegue y aplicación. Cualquier progreso en este
ámbito de control de enfermedades transmitidas por
vectores y / o causados por artrópodos por pequeña
que pueda parecer, puede representar a salvar muchas vidas
humanas y prevenir el sufrimiento así como reducir
causando graves pérdidas económicas en el ganado y
en las mascotas domesticas.
Identificación
y delimitación del problema
La evolución de los Artrópodos durante
millones de años, les ha permitido conquistar los
más diversos medios adaptándose a una gran variedad
de hábitat ,gracias al perfeccionamiento de mecanismos
,funciones y órganos ( locomoción,
protección externa y exoesqueleto, ciclos evolutivos,
diversidad, órganos sensoriales ,adaptación
digestiva etc.)
Uno de los más eficientes y sofisticados supuso
la ocultación de los elementos que antigénicamente
pudieran ser más vulnerables a las defensas inmunitarias
de los hospedadores y en concreto al tubo digestivo y otros
órganos de los artrópodos hematófagos a este
respecto, cabe destacar el desarrollo del exoesqueleto de
quitina. Una protección externa inerte, casi neutra desde
el punto de vista antigénico, con múltiples
adaptaciones a cada circunstancia. Un mecanismo casi perfecto
para conseguir ocultar dichos antígenos.
Es un hecho conocido que la naturaleza economiza sus
recursos de forma efectiva durante un proceso evolutivo y que si
un elemento, estructura, función u órgano resulta
eficiente y supone un avance en la adaptación ,
éste es conservado y /o perfeccionado en el tiempo ,
permaneciendo prácticamente inalterable mientras se
mantengan las circunstancias que la motivaron. Así, los
patrones estructurales en tejidos , órganos y funciones se
repiten de forma casi invariable en todo el reino animal y muy
especialmente en el de los artrópodos, como ponen de
manifiesto fósiles desde el Triásico 225 a 195
millones de años .Jurásico de 195 a 140 m.a.
Cretácico de 140 a 65 m.a. Terciario de 65 m.a. a nuestros
días.
Esta premisa se considera fundamental a la hora de
afrontar el estudio de la respuesta inmune que como defensa los
hospedadores puedan desarrollar contra los
artrópodos.
En el momento que los artrópodos perfeccionaron
un mecanismo por el cual en muy pocas circunstancia dejaban
expuesto sus elementos antigénicamente detectables ante
las defensas de los hospedadores ,consiguieron un gran salto
evolutivo al poder utilizar como recurso alimenticio de alto
valor nutritivo la sangre y tejidos de los vertebrados
superiores.
Partiendo de la imposibilidad que tiene un hospedador de
detectar antígenos de los artrópodos
parásitos se puede comprender cómo éstos se
sienten vulnerables y prácticamente indefensos a la
acción de los mismos ya sea de forma directa
(mecánica) o por hemofagia. con la consiguiente
patogeneicidad en sus diferentes manifestaciones de morbilidad,
mortalidad, perdidas productivas, económicas,
etc.
Antecedentes
La lucha actual contra las enfermedades trasmitidas por
artrópodos, se encuentra muy limitada tanto por la
dificultad de encontrar profilaxis efectivas y tratamientos
adecuados como medidas de control que la mayoría de las
veces son caras, de difícil implantación y
aplicación , otras veces lesivas para el medio ambiente y
en general inaccesibles a las economías más
desprotegidas.
Se han abierto nuevas líneas de
investigación y se están aplicando métodos
novedosos en el control de artrópodos como
ectoparásitos . Entre los métodos de lucha y
control actualmente en uso merece especial
atención:
Control químico :
Además de los plaguicidas clásicos (
organoclorados, organofosforados ,carbamatos, piretroides,
formamidinas , ivermectinas etc) se están utilizando
nuevas moléculas que inhiben o afectan a la
nutrición o a las células excretoras en los
diversos estadios ., productos químicos que dificultan la
aparición de resistencias etc.; en general caros y poco
accesibles a las economías mas deprimidas, generan a la
larga resistencias y lesivos para el medio ambiente
Control biológico:
Se están utilizando vacunas contra garrapatas
Boophilus microplus en Australia (Tick Gard 1989 donde la
proteína BM86 aislada del intestino de la garrapata, fue
expresada en Escherichia coli .
Este antígeno permanece en forma natural "oculto"
al sistema inmunológico del animal, o sea, no juegan
ningún papel en la interacción
hospedero-parásito para inducir de forma artificial la
inmunidad del hospedador (Willansed y Kemp, 1988).
Según Rodríguez (2000), la ventaja de usar
antígenos ocultos está en evitar los principales
mecanismos que posee el parásito para evadir la respuesta
inmune del hospedador. La falta de contacto entre los
antígenos ocultos y el sistema inmunológico permite
que los parásitos no desarrollen estrategias para escapar
a la acción de una repuesta contra ellos, esto los hace
especialmente atractivos para el diseño de vacunas contra
ectoparásitos (Rodríguez, 2000).
Posteriormente, investigadores cubanos, empleando
básicamente la misma tecnología pero expresando la
proteína en la levadura Pichia pastoris,
produjeron una vacuna denominada Gavac ® (CIGB,Cuba), la cual
tiene registro para su aplicación en varios países
de Latinoamerica como Colombia, Bolivia, Brasil, México,
además de encontrarse en fase de registro en otros
países de la región (Valdés et al,
2005).
Los anticuerpos específicos contra éste
antígeno que se obtienen en los animales vacunados, junto
con otros componentes como el complemento, son ingeridos por las
garrapatas junto con la sangre; esto favorece que los anticuerpos
se unan al antígeno provocando el daño intestinal y
el paso de las sustancias a la hemolinfa del parásito.
Ello resulta finalmente en la reducción del número
de garrapatas que completan el ciclo biológico y se afecta
la fertilidad de los parásitos resultantes.
Por lo tanto el resultado fundamental de este
inmunógeno no será la muerte directa de la
garrapata en una sola generación, sino el control
progresivo del número de garrapatas en generaciones
sucesivas mediante la reducción de la capacidad
reproductiva de éstos parásitos (Valdés
et al, 2005).
Otra formulación que se ha venido desarrollando
es la TickVac MK, la cual emplea un antígeno crudo
obtenido de la totalidad de la proteína natural de larvas
de B. microplus (Betancourt et al,
2004).
También estudios muy interesantes como se ha
puesto de manifiesto en trabajos donde se estudia el efecto de la
alimentación de Stomoxys calcitrans (Díptera
Muscidae)con sangre de Bos Taurus inmunizado con antígenos
ocultos de la mosca del establo, sobre la oviposición 2007
(Carlos Ramón Bautista Garfias / Ana Patricia
Martín Flores / Isabel Giles hernandez) Universidad
Nacional Autónoma de México.
Trabajos similares se han efectuado con la pulga
Ctenocephalides felis felis (Heart AW y col 1994….
Mosca lucilia cuprina y la mosca del cuerno Haematobia
irritans
(Bautista GR,
y col. 2004……
Control genético:
Mediante la selección de animales
que presentan una mayor resistencia natural p.e.
Cebú
Benavides, E. 1.988. Selección de
animales resistentes a enfermedades .Alternativa Genética
para el futuro. Revista Nacional de Zootecnia. Volumen V- No.
28.
Villar,C. 1.991. La resistencia natural de
los bovinos a los parásitos una alternativa de control.
ICA.
Villar, C. 1.997. Sostenibilidad utilizando
ganados criollos dentro de estrategias de control de
parásitos. Disertación. Corpoica.
Tibaitata.
Control físico o natural :
Actuando sobre el medio ambiente ,dificultando el normal
desarrollo o interfiriendo en cualquier etapa del ciclo evolutivo
del artrópodo a combatair , p.e desecación de
charcas y zonas húmedas, control de pastos y viviendas ,
barreras físicas como mosquiteras o repelentes de tipo
físico
Control integrado:
Se ha comprobado que ninguno de los métodos
explicados anteriormente, aplicados de forma aislada, resulta
totalmente eficaz en el control de los ixódidos (de Moura
Souza et al, 2005; Ortiz y Franco, 2005). Polanco (2001)
refiere que sólo un tratamiento integrado donde se
combinen armónicamente los diferentes métodos,
resulta verdaderamente efectivo en el control de estos
ectoparásitos, lo que puede ser aplicado a la mayor parte
de los artrópodos causantes de enfermedades.
HIPÓTESIS :proponemos la siguiente
hipótesis de trabajo.
Considerando que los Artrópodos comparten un
origen filogenético común y que presentan
estructuras y órganos que se han mantenido casi
invariables durante su historia evolutiva desde hace millones de
años hasta nuestros días (José Luis
Nieves-Aldrey y Félix Manuel Fontal-Cazalla
Utilizando como inmunógeno material
embrionario de otra especie de artrópodo es posible
inducir en el hospedador una respuesta inmune eficiente contra
los antígenos ocultos de ectoparásitos
patógenos.
El único material que en principio
podría ser susceptible de un ataque inmunitario por parte
del hospedador hacia los artrópodos serían los
"Antígenos ocultos" presentes en el epitelio de diferentes
estructuras internas (aparato digestivo ,excretor o reproductivo)
de éstos.
Las dificultades metodológicas que
se deben afrontar son las siguientes.
1) Existencia del exoesqueleto quitinoso
que dificultaría la respuesta del sistema inmune del
hospedador a los antígenos del parásito.
2) Obtención de una cantidad
suficiente de material biológico para inducir la
inmunización del hospedador.
3) Necesidad de conseguir epitelio de cada
especie para producir una respuesta inmune específica . Su
cultivo in vitro resultaría difícil y
costoso
4) Posibilidad de que determinados
antígenos provoquen en el hospedador reacciones adversas
que podrían desarrollar choque
anafiláctico.
5) Posible contaminación de los
antígenos con elementos patógenos (virus,
bacterias, protozoos etc).
La estrategia que se propone consideramos
que podría superar las dificultades anteriormente
expuestas y además cumpliría 2 requisitos de gran
importancia social y económica:
a) Sería asequible para la
mayoría de la población de forma fácil ,
masiva , libre y gratuita tanto para su aplicación en
personas como en animales .Como objetivo de bienestar global ,
sin estar sujeto al control exclusivo de las multinacionales
farmacéuticas.
b) Serviría para proteger contra
diferentes especies de artrópodos patógenos con
relevancia medica, independiente-mente del área
geográfica y situación socio-económica de la
población afectada.
En la actualidad no existe ninguna terapia
similar a la propuesta e salvo los casos que reseñamos
como antecedentes que son de utilización limitada a las
especies mencionadas.
JUSTIFICACIÓN
Cualquier avance en este campo del control
de enfermedades trasmitidas por vectores y /o provocadas por
artrópodos por pequeño que parezca , puede
representar salvar muchas vidas humanas y evitar sufrimiento
así como evitar o disminuir las graves perdidas
económicas que provocan en la ganadería sobre los
animales domésticos.
Metodología
FUENTE DE ANTIGENOS
EMBRIONARIOS
Utilización de material embrionario
obtenido a partir de huevos de la mariposa de la seda
(Bómbix morís) . Dado que la producción de
dicha especie se encuentra perfectamente estudiada y
estandarizada , no requiere grandes desembolsos económicos
, es asequible a cualquier economía y teóricamente
permite obtener grandes cantidades de dicho material.
El material necesario para la
inmunización se podría obtener tanto de
explotaciones industriales de sericultura como mediante su
colecta en pequeñas explotaciones de sericultura en
áreas deprimidas , sin recursos económicos
.
Los gusanos serán alimentados con
hojas de morera y se mantendrán en condiciones
idóneas de humedad e higiene.
Los capullos serán retirados a
medida que se vayan formando y colocados en una caja adecuada
para la eclosión de las mariposas . Las mariposas se
pasarán a otra caja de plástico en cuya base se
colocarán laminas de platico transparentes , Una vez
terminada la cópula y realizada la oviposición. las
láminas con los huevos correspondientes a ese día
se marcan con rotulador y pasan a una caja de para su
maduración dependiendo del día ( D) donde se
consiga la mayor formación de material embrionario
inespecífico , o sea las tres capas germinativas antes de
que se formen órganos concretos ni procesos de
queratinización. Suele coincidir con el cambio de
coloración del huevo fecundado de amarillo claro a
pardo.
Llegados a este punto se guardan en
refrigeración para parar la embriogénesis hasta
conseguir reunir la cantidad de huevos deseada.
Una vez recolectado todos los huevos en el
punto de maduración determinado se procede a extraer el
Antigeno ( FC fracción celular completa ) según se
especifica más abajo.
OBJETIVOS DE
EXPERIMENTACIÓN
Caracterización y uso de los
antisueros (según metodología de Trujillo y
Saettler (1981). ) en :
1. Titulación de los sueros
inmunes mediante ELISA indirecto usando como antígeno
los extractos de huevo de la mariposa de la seda utilizados
en la inmunización.2. Estudiar mediante
técnicas de ELISA la reacción de los sueros
inmunes con extractos de diferentes tejidos de los
artrópodos parásitos por ej. tubo digestivo de
garrapata, pulga y mosquito.3. Identificación tisular
de la reacción antígeno anticuerpo mediante
técnicas de Inmunofluorescencia en distintos tejidos y
órganos de los artrópodos
parásitos.4. Comprobar la unión de
los anticuerpos a los antígenos del tracto digestivo y
otros órganos de artrópodos parásitos
alimentados con sangre de los mamíferos (conejos)
inmunizados. Esto se hará mediante una técnica
conocida como "inmunocitoquimica incompleta", esto es, una
técnica inmunocitoquimica convencional en la que se
omite la incubación con el anticuerpo primario porque
la interacción antígeno-anticuerpo se ha
producido "in vivo".5. Estudio del efecto de los
anticuerpos sobre la fisiología de artrópodos
hematófagos.6. Comprobar que la
utilización de material embrionario como origen de los
diferentes estructuras internas susceptible de
interacción inespecífica Ectodermo ,Mesodermo y
Endodermo( Aparato digestivo Estomodeo ,Mesenterón y
Proctodeo ) , Sistema excretor ( Tubos de malpighi) , Aparato
reproductor ( Espermateca) y Sistema glandular
(Glándulas salivares .) genera una respuesta
inmunitaria ( producción de Inmunoglobulinas G ) en
mamíferos7. Comprobar que efecto produce
una inmunización activa con dicho producto sobre
animales que sufren la acción de
Ectoparásitos.
Sospechamos que en unos casos los
anticuerpos actuarían hipotéticamente a nivel del
tubo digestivo ( anterior -estomodeo , medio
–mesenterón o el posterior -proctodeo ) sobre los
epitelios libre o expuestos en los que no estén
desarrollada una membrana peritrófica (de tipo
mucilaginoso-protectora) o cuticular en otros casos , como sucede
en los diferentes especies, provocando : daño en dicho
epitelio de revestimiento a estos niveles , indigestiones o
procesos de aceleración del transito intestinal con la
consiguiente malnutrición. En otros casos se espera que
los antígenos ocultos se encuentren en órganos como
el aparato reproductor y sean afectadas las espermatotecas
,oviductos ,glándulas accesorias o incluso ovarios y la
consiguiente merma en la oviposición . Pudieran ser
afectadas las glándulas salivales provocando procesos de
obstrucción o estrechamiento de los conductos excretores
dificultando la secreción de sustancias relacionadas con
la lubricación de las diferentes piezas bucales , de
sustancias analgésico-anestésicas o de
anticoagulantes etc.
No se descarta un posible efecto REPELENTE
sobre los artrópodos que puedan detectar de alguna manera
mediante sus potentes quimiorreceptores (olfativos y gustativos )
que ese hospedador pueda representar un riesgo por las causas
anteriormente expuestas. Se sabe que ciertos animales son
más resistentes que otros a sufrir los efectos ( picadura
, fijación, etc.) y se sospecha que sea debido al rechazo
que provoca (repelencia) sobre el vector en cuestión el
cual detecta que esa posible fuente de alimentos no es del todo
adecuada ya sea por haber tenido un contacto previo o por un
efecto de "repugnancia" al mismo.
Realizaremos este estudio en vertebrados
superiores con especial afectación por : pulgas ,
garrapatas , ácaros auriculares en gatos o perros y sarna
demodésica u otras en perros y mosquitos culicoides en
équidos como posibles causantes de las "
rasquiñas"
8. Comprobar según el
diseño y el protocolo de la investigación en
los diferentes lotes de animales (sujetos de la
aplicación) y atendiendo a las variables establecidas
si los efectos producidos se ajustan a los
esperados.9. Comprobar mediante la
titulación de anticuerpos las distintas respuestas a
los casos anteriores. Para tal fin se utilizaría un
método ELISA ( ensayo inmunoenzimático
indirecto) para determinar el titulo de anticuerpos
anti-material embrionario del gusanos de seda BÓMBIX
MORI obteniendo suero de los animales inmunizados el
día 60 postinmunización con antigenos
embrionarios ,suero de conejo anti IgG de las diferentes
especies a estudiar (canino , felino, equino) conjugado con
peroxidasa y ortofenilendiamina como sustrato . La lectura se
efectúa con un lector de ELISA utilizando un filtro de
492nm.10. Aplicar técnicas de
Inmunofluorescencia sobre cortes histológicos de
diferentes especies de artrópodos ( garrapatas,
pulgas, mosquitos) alimentados con sangre de animales
inmunizados y comprobar que dichas inmunoglobulinas se fijan
a los antígenos del epitelio de los distintos
"órganos dianas" de estos .
Comprobar en estudios posteriores mediante
técnicas de inmunocitoquimica (Proteína A-oro) en
microscopía electrónica los puntos exactos de donde
dichas IgG actúan a nivel histológico.
OBJETIVOS APLICATIVOS.:
Si como resultado de las investigaciones se
obtienen los resultados esperados o satisfactorios.
Se plantea en definitiva la
utilización de dicho material inmunógeno para su
implantación en todos los ámbitos que se requiera
(uso en animales y personas )
Para ello por una parte la obtención
de grandes cantidades LIOFILIZADAS producidas en explotaciones de
alto rendimiento y su posterior aplicación como
1- Vacunación normal con o
sin adyuvantes por vía subcutánea2- Mediante un sistemas de
fácil manejo , almacenamiento, distribución y
aplicación de dicho producto para su
utilización por otras vías como la nasal
,conjuntival o percutánea ( por frotamiento
/excoriación) , pensando en los países donde
los medios económicos no permitan el uso extra de (
jeringuillas, agujas, frigoríficos, personal sanitario
etc)
O en zonas endémicas o
enzoóticas de economía muy deprimida se plantea la
posibilidad de obtener macerado fresco total de huevos
embrionados a partir de la producción en pequeñas
explotaciones, que podrían crearse en aldeas y utilizando
para su conservación un producto tan natural como la miel
para su aplicación por vía percutanea previa
frotamiento/escoriación de la piel
Estudio de las
variables
Dependientes del material
inmunógeno
1. Tipo de material : se plantean
varias opciones
FC ( fracción celular ) : FCC
material completa del huevo embrionado : Los huevos de la
mariposa de la seda (estadío D idóneo) se
homogenizarán a 4ºC en solución salina
amortiguadora de fosfatos ( SSAF) a 4ºc y pH 7,2, con
antibióticos ( penicilina 100 UI/ml y estreptomicina 100
microgramos/ml y un coctel de inhibidores de proteasas mantenido
en agitación durante 1h a 4ºC en un homogeneizador de
cristal
O de forma específica las diferentes
fracciones : FCE la fracción celular ectodérmica :
FCM fracción celular mesodérmica y FCEn
fracción celular endodérmica ,que se obtienen por
el método de micro centrifugación o
ultracentrifugación (se determinará previamente con
la utilización de métodos de microscopia y
tinción para determinar cual es la fracción
más rica en material en cada momento del proceso de
embriogénesis atendiendo al ciclo de esta especie durante
la maduración del huevo)
C (conservación) :C1
congelación ;C2 liofilizado C3 en miel (solo por via
percutanea)
V ( vía de aplicación) : Vsc
subcutánea ; Vc conjuntival ;Vn nasal ; Vpc
percutanea
D (día) Momento idóneo de su
obtención: dado que el periodo embrionario para
esta especie Bómbix mori con un ciclo evolutivo completo
de 60 días es de unos 7 días a temperatura de 20 a
25 ºC habrá de establecerse el momento donde la
concentración celular es mayor, en tal caso se hace
necesario un estudio microscópico para establecer el mismo
y al mismo tiempo establecer varios lotes identificados como: D3
, D5 y D7 ( día 3 ,5 y 7) por ejemplo.
P peso Cantidad de material estimado para
poder tener una respuesta inmunitaria idónea. Habrá
de establecerse varios lotes según la cantidad utilizada
medida en microgramos de FC fracción celular obtenida
ultracentrifugación a 3000 g durante 30 min. Luego de
recolectar el sobrenadante (Antig-embrionario) se determina la
cantidad de proteínas por el método lowry et al.(
Lowry OH, como indicador de la concentración celular d y
lo indicaremos como P1, P2 , P3 ( peso 1,2 y 3)
Dependientes del sujeto de aplicación y criterios
de inclusión ,exclusión
1. Animales domésticos : (ubicados en
centros de acogidas por ser vagabundos y de propietarios
voluntarios ) perros , gatos ,caballos ; parasitados
externamente (ectoparásitos visibles en
infestación ponderable a simple vista (pulgas y
garrapatas) , por raspado (sarna demodésica en perros)
o por frotis auricular ( sarna auricular en gatos o perros )
por lesiones cutáneas (alopecias , eczemas, eritemas ,
pústulas , descamaciones etc.) , por signos
clínicos como rascado, perdidas de peso ,stres
,
Se escogerán los animales más afectados,
más sensibles, con mayor numero de manifestaciones
clínicas y que vivan en ambientes poco controlados ,con
medidas higiénico-sanitarias deficientes. Se
ponderará mediante lista de chequeo confeccionada a tal
efecto como influye la inmunización del sujeto objeto de
estudio en el tiempo ( ensayo longitudinal) y se valorará
la mejoría o curación con respecto a la
situación inicial o de partida y sin la utilización
de tratamientos externos ni cambios en el hábitat o
condiciones higiénico-sanitarias. etc) se descartan los
más resistentes , tratados con productos antiparasitarios
, los que vivan en ambientes controlados y con correctas medidas
higiénico-sanitarias .
2. Animales de experimentación. ( en
animalario del laboratorio) con ambiente controlado de
alimentación, temperatura, etc. Ponderándose
todas las constantes de forma más exhaustiva. Siendo
el objeto de estudio cobayas distribuidas en varios lotes
(lote control y otros dependientes de las Variables
seleccionadas FC ; C ;P ; V ; D estudiándose los
efectos frente a la acción de distintos
artrópodos parásitos y principalmente el
posible efecto repelente.
Se determinarán los valores significativos
resultantes del ensayo por una parte , se procede a la
titulación de anticuerpos La IgG se purifican según
el método descrito por Butler;18 se comprueba su
pureza por electroforesis en geles de poliacrilamida en presencia
de duodecil sulfato de sodio (SDS)19 y se determina su
concentración por los métodos
espectrofotómetricos;18 de Lowry y otros20 y del
ácido bincinconínico.12 (los anticuerpos
secundarios anti-IG de mamíferos están disponible
comercialmente por lo que no hay que producirlos, se
compran.
Algunas
consideraciones sobre las técnicas a utilizar en el
ámbito del trabajo de laboratorio con técnicas
habituales en inmunología básica
Titulación de los sueros inmunes
mediante ELISA indirecto.
Los métodos de inmunización
están bien establecidos y, en general, es relativamente
fácil obtener anticuerpos específicos contra
sustancias inmunogénicas (p.e. proteínas) que son,
en general, las que poseen elevada masa molecular. Sin embargo,
las sustancias (moléculas neutras, iones, etc.) de masa
molecular inferior a 5000 D, tales como aminoácidos,
plaguicidas, péptidos, etc., no son inmunogénicas
por sí mismas y deben unirse a moléculas portadoras
o "carriers" para inducir respuesta inmune, es decir, producir
anticuerpos contra ellas. La bibliografía especializada
recoge ampliamente estos aspectos.
El método inmunoenzimático
(ELISA) para la detección de anticuerpos, se utiliza para
la cuantificación de muy pequeñas cantidades de
éstos, que habitualmente no son detectables por los
métodos convencionales; además esta técnica
presenta la característica de una alta especificidad y
sensibilidad, así como rapidez, lo que posibilita el
estudio de grandes poblaciones en corto tiempo, en forma
rutinaria y sencilla
Por otra parte, su cuantificación se
basa en la reacción enzima-sustrato que produce un cambio
de coloración que se evalúa mediante un
espectrofotómetro lo que evita resultados
subjetivos.
Por lo general, un esquema que incluya un
sonicado de células completas como antígeno en un
ELISA indirecto va a tener una buena sensibilidad
Características de las que
depende la antigenicidad
-PM: debe ser mayor de 10KD, sin
embargo hay moléculas como la de la insulina
( PM:6KD) y el glucagon (PM: 3.8KD) que
pueden generar RI si son inoculadas con un adjuvante.
Otras sustancias de bajo PM como es el caso
de los haptenos en cambio, deben inyectarse acopladas a una
molécula inmunogénica llamada carrier para
transformarse así en antigénicas.
Inmunogenicidad de especie: por ej.
los polisacáridos neumococcicos son buenos
inmunógenos para el hombre pero no para el
conejo.
-Relación propio-no propio:
para ser inmunógeno, un Ag. no debe pertenecer a la
especie animal de la cual se pretende obtener la respuesta inmune
hacia él.
–Grupos químicos: – los
radicales ácidos o básicos fuertes en las
proteínas las hace
mas inmunogénicas (principalmente
los ácidos).
– la presencia de aminoácidos como
tirosina o fenilalanina, ( la gelatina no los posee y por ello
solo es antigénica cuando se inyecta con
adyuvante).
-Rigidez de la molécula: las
largas cadenas de las moléculas de los hidratos de carbono
son fácilmente distorsionables y por lo tanto no generan
una buena respuesta inmune. La alta especificidad de los grupos
aromáticos en los aminoácidos de síntesis es
debida a la rigidez del benceno. A su vez la posición de
estos grupos también es significativa para la
especificidad dado que los derivados D o L pueden diferenciarse
serológicamente.
La mayoría de los antígenos
son proteínas de alto PM, con aminoácidos
particulares (sobre todo con grupos aromáticos) y
estructura definida.
En los hidratos de carbono la antigenicidad
esta dada por la condensación de 2 o más grupos de
hexosas.
Los ácidos nucleícos se
tornan antigénicos sí se les rompe la doble
hélice por ej. por calentamiento y enfriamiento
rápido.
Los ácidos grasos no son
antigénicos pero si los son los lípidos complejos
sobre todo los asociados a glúcidos y proteínas (
ej. lipopolisacáridos).
En orden de antigenicidad
tendríamos:
1º proteínas
2º hidratos de carbono
3º lípidos ( principalmente
fosfo y gluco-lípidos) y ácidos grasos.
En la interacción in vitro de un
Ag. con su correspondiente Ac. se distinguen 2
etapas:
1º Interacción primaria:
es la mera unión de un Ag. y su correspondiente Ac. No es
visualizable directamente y no es demasiado influenciada por la
temperatura, la concentración salina o la fuerza
iónica ni la agitación. Sólo depende de la
complementaridad ya que cuando mayor sea ésta mayores
serán las fuerzas de unión
( afinidad) y menores serán las
fuerzas de repulsión (ej. repulsión
estérica).
Los ensayos inmunológicos basados en
la interacción primaria son, por ej. ELISA, RIA
(radioinmunoensayo), IF (inmunoflorescencia).
En estos ensayos la visualización
del complejo se hace marcando uno de los reactivos
( Ag. o Ac.), con alguna sustancia
detectable.
En el caso del ELISA ¡la
marcación se realiza con una enzima como por ej. la
peroxidasa, de manera que al agregar un cromógeno y el
sustrato de dicha enzima, se puede calcular la cantidad de
complejos formados midiendo la intensidad del color
producido.
En IF (inmuno fluorescencia) marcamos
con una sustancia fluorescente.
Podemos hacerlo directamente sobre un corte
de tejido, impronta etc. y la observación se realiza
directamente con microscópio de
fluorescencia.
También podemos marcar una
suspención celular, en cuyo caso la medición se
hará por ej. por citometria de flujo, esta
técnica se usa actualmente en clínica para
cuantificar células inmunes en el monitoreo del
HIV,
Todas las técnicas de
interacción primaria pueden ser
Directas : marcamos uno de los
reactivos del complejo.
Indirectas: la marca estará
en un 2º Ac. dirigido contra alguno de los componentes del
complejo.Esta es mas sencible que la anterior ya que al aumnetar
el tamaño del sistema podemos detectar menores
cantidades.
Los tipos de reacciones de
precipitación son:
a) En medio
líquido:
Cualitativa: se usa poco ya que
existen mejores métodos para detectar presencia o
ausencia, además, debido a lo que mencionamos antes sobre
la posible existencia de mas de un complejo en la mezcla, para
utilizar este método debemos asegurarnos de que uno de los
reactivos este puro.
Semicuantitativa: tampoco se usa,
constituye un método poco práctico.
Cuantitativa: esta es la primera
técnica que permitió medir en masa la cantidad de
Ag. o Ac. presente en una solución.
Por ej. queremos medir la masa de Ac. anti
proteinas embrionarias de tubo de epitelio de tubo digestivo del
gusano de seda en un suero.
Disponemos del polisacárido
purificado (esto es importante para asegurarnos de tener un solo
sistema reaccionante). Se colocan en una serie de tubos
cantidades crecientes del antisuero y constantes del
polisacárido, se incuba la mezcla 1hr a 37ºC y luego
se centrifuga, lavamos el precipitado para eliminar las
proteínas contaminantes y lo resuspendemos, finalmente
medimos la cantidad de proteínas por ej. por absorbancia a
280nm. En este caso como el Ag. no es proteico, la medida
obtenida corresponderá solo a los Ac. presentes en el
suero.
Si ambos reactivos fueran proteicos, el
cálculo se haría restando la cantidad agregada del
reactivo conocido.
Para obtener la masa debemos tener una
curva de calibración: masa de proteína vs DO y, a
partir de la DO medida en nuestros tubos, obtenemos la masa
incognita.
La medición de DO se realiza en el
tubo de máximo precipitado, donde sabemos que todo el Ag.
y Ac. presentes formará parte del mismo.
b) En medio sólido (
precipitación en gel) :
Se usa como soporte de la reacción
un gel de manera que las moléculas difundirán
libremente a través de él de manera que, a lo largo
del recorrido se irá formando un gradiente de
concentraciones que hará que en un determinado punto los
reactivos se encuentren en su relación de equivalencia, en
ese punto se producirá un precipitado que sobre el gel se
verá como una nítida banda blanca que permanece
estable mientras un mayor flujo de reactantes no provoque su re
disolución.
Como se recordara, en la
precipitación en medio líquido no era posible
distinguir en el precipitado la presencia de más de un
sistema reaccionante, en el caso de que las moléculas
estén disueltas en un medio gelificante sumamos a los
fenómenos de la precipitación, los de la
difusión simple, de manera que aquellos complejos cuyos
coeficientes de difusión sean distintos formaran bandas en
distinta posición. De esta manera podemos resolver la
existencia de más de un complejo reaccionante en la
mezcla. Sin embargo no podremos separar complejos con igual
coeficiente de difusión, y decimos que cada banda que se
forme estará compuesta por lo menos por 1 sistema
.
Como soporte se usan medios semi
sólidos como agar blando (agar 1% en solución
salina) agarosa 0,5% etc. Todos aquellos que permitan una libre
difusión de macromoléculas.
La precipitación en gel puede
ser:
– Cualitativa: existen
diferentes esquemas que nos permiten detectar la presencia de un
Ag. o un Ac. (según el caso).
– Difusión simple
monodimensional ( método de Oudin): Se coloca en un
tubo de ensayo agar fundido mezclado con un vol. igual del
antisuero a analizar (en este caso queremos detectar la presencia
de un Ac.)
Se deja solidificar y se añade la
solución de Ag., este va a difundir por el agar formando,
como dijimos, un gradiente de concentración decreciente
hacia el fondo del tubo, significa que en determinada zona Ag. y
Ac. alcanzarán la relación de equivalencia,
formándose ahí la banda de precipitado.
Se formarán tantas bandas como
sistemas haya, siempre que la velocidad de difusión sea
distinta para cada uno de ellos.
Se ha intentado utilizar este sistema con
fines cuantitativos, ya que la distancia a la que se forma la
banda es directamente proporcional a la concentración del
reactivo que difunde, entonces mediante distintas fórmulas
matemáticas se puede calcular la concentración en
función de la distancia recorrida.
– Difusión doble monodimensional
( método de Oakley Fulthorpe): En este caso colocamos
en la parte inferior del tubo un vol. de agar 1% fundido,
mezclado con un vol. igual del antisuero, dejamos solidificar y
agregamos igual vol. de agar 0,5%, dejamos solidificar y por
ultimo agregamos agar 1% donde se encuentra disuelto el
Ag.
Tanto el Ag. como el Ac. migrarán
hacia la zona media de menor concentración, de manera que,
otra vez, se formarán gradientes que harán que en
deteminado punto los reactivos estén en equivalencia y
precipiten.
Vemos acá, que si la
concentración de Ag. y Ac. están en relaciones
óptimas (equivalentes) la banda se formará en un
punto intermedio del tubo, mientras que si, por ej. la cantidad
de Ag. esta en exceso necesitará recorrer una mayor
distancia para alcanzar una dilución tal que se encuentre
en equivalencia con el Ac. y así la banda se
formará más cerca del fondo. Lo contrario
ocurrirá cuando la cantidad de Ac. sea la que esta en
exceso
Difusión doble bidimensional
(método de Oüchterlony) : Constituye un
método muy completo ya que permite obtener mas
información que los anteriores.
Consiste en colocar en una placa de Petri
agar 1,5% al cual luego de solidificar se le realizan
perforaciones en forma de pocillos a distancia conveniente y en
dichas perforaciones se colocan pequeñas cantidades de Ag.
y Ac.
En este caso los reactivos difunden en
forma radial a partir del pocillo generando bandas de
precipitación cuyas características
dependerán de varios factores.
Igual que en el caso anterior, cuando
las concentraciones colocadas en los pocillos estén cerca
de la de quivalencia la banda se formará a mitad de
distancia entre ellos.
Además, nos permite tener idea de
los PM de cada reactivo ya que al tratarse de una difusión
radial, la concavidad de la banda estará hacia el lado del
pocillo donde se halla colocado el reactivo de mayor PM, y
viceversa, si ambos PM son semejantes la banda será recta.
Por otro lado, la posibilidad de hacer
varios pocillos en una placa permite obtener información
sobre similitud de los Ag. reaccionantes.
Recordemos que las macromoléculas
antigénicas tienen en su superficie zonas llamadas
determinantes antigénicos y que son los sitios reconocidos
por el Ac.
Así, dos Ag. emparentados ( por ej.
dos albúminas de distinta especies) tendrán
probablemente determinantes antigénicos comunes a
ambos.
Mediante la técnica de Ouchterlony
podemos determinar la existencia o no de determinantes comunes
entre Ag. según las características de las bandas
formadas
La reacción de identidad (I),
corresponde a los Ag. que comparten todos los determinantes
antigénicos, es decir que estamos ante la misma
molécula, en la de no identidad (II), ningún
determinante es compartido y por lo tanto son Ag. distintos
mientras que en la identidad parcial ( III), hay determinantes en
común, o sea que hablamos de Ag. emparentados, esto se ve
como un espolón dirigido hacia el pocillo con menos
determinantes reactivos. Nótese que en este caso
último, ab es una sola molécula
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