Otra vez nos referimos a un sistema
reaccionante con un determinado coeficiente de difusión.
En caso de que los sistemas sean varios tendremos también
distintas bandas según las velocidades de difusión
de cada uno. Esto nos va a permitir determinar la pureza de una
solución antigénica, recordando siempre que cada
banda corresponderá a, por lo menos, un
sistema.
Otra utilidad de este método es la
de testear los pasos de purificacion por ej. de una
proteína , a partir del material a purificar ( 1) vemos la
desaparición de bandas en los distintos pasos, asi el
resultante del 1º paso, pocillo 2, presenta una banda menos
que el 1, y en el pocillo 3 ya vemos solamente la banda continua
correspondiente a la albúmina, es decir que el paso 4 no
sería necesario. En el pocillo central debemos colocar un
antisuero total que nos revele todas las proteínas del
suero a purificar. En este ejemplo será antisuero humano
total.
Como control debemos colocar un pocillo con
albumina humana purificada para verificar su identidad con la
banda presente en el ultimo paso de purificación. La banda
de albumina esta representada por la linea continua que rodea el
pocillo central.
– Semicuantitativo:En este
tipo de pruebas se busca determinar la cantidad de un determinado
reactivo .
Cuando la cuantificación es
relativa, el resultado depende del método usado, los
reactivos empleados etc., entonces hablamos de ensayos
semicuantitativos.
En inmunología el resultado de estos
ensayos se expresan como "título".
El título se define como la inversa
de la última diluc
ión que da resultado
positivo.
La metodología empleada consiste en
colocar sobre un porta objetos, agar 1,5% en sol.
fisiológica y sobre él realizar perforaciones
delimitanto pocillos en los que se colocarán los
reactivos, uno de ellos en concentración constante y el
otro, el que se va a cuantificar, en diluciones
crecientes.
Cuantitativo: En estos casos la
cuantificación se realiza en masa, es decir que el
resultado obtenido no debe variar de una técnica a otra ya
que representa una medida absoluta.
La técnica de precipitacion usada en
este caso es una difusión simple en placa o
inmunodifusión radial ( Mancini ).
Consiste en una placa de agar o agarosa al
3% en solución salina, en el que se encuentra disuelto el
Ac.Sobre el agar se realizan perforaciones en las que se colocan
las muestras a dosar.
Como mencionamos en párrafos
anteriores, la distancia a la que difunde un Ag. hasta alcanzar
la relación de equivalencia con su correspondiente Ac. y
precipitar, es proporcional a la concentración del mismo.
Entonces, cuando los sistemas son equivalentes, aparece alrededor
del pocillo un circulo de precipitación.
Debido a que la concentración del
reactivo disuelto en el agar es constante, el diámetro del
círculo descripto por la banda de precipitación
será directamente proporcional a la concentracion del
reactivo que difunde.
Para realizar el ensayo, se colocaran en
una serie de pocillos cantidades conocidas de un estandar del Ag.
a dosar y en los otros la o las muestras
incógnitas.
Luego se incuba la placa a temperatura
ambiente hasta que el diámetro de los halos no se
modifique (48-72 hs).
Se mide el diámetro de los halos y
con aquellos correspondientes a los estandares se construye una
curva de calibración relacionando la superficie de los
mismos (el r2 o d2) con la concentración.
Con la medida de los halos de las muestras incógnitas y
mediante esta curva, se calcula la concentración de las
mismas.
Este método, en el cual el
precipitado alcanza su punto de equilibrio y ya no se modifica,
constituye la llamada determinación de alta
precisión.
Se puede realizar una
determinación rápida de orientación
en la cual se incuba la placa entre 16 y 20 hs. y se
gráfica diámetro vs. log de la concentración
de Ag.
Fuente
Inmunología e inmunoquímica.
Ricardo Margni.
Tratado de Microbiología. David
Dulbecco.
Enzimainmunoensayo (ELISA)
Existen muchas variantes de ELISA y su diseño
depende de lo que se quiera determinar. La más
comúnmente utilizada es el ELISA indirecto que se usa para
determinar la presencia de Ac en una muestra problema, utilizando
como conjugado un Ac-antiIg marcado con una enzima. La prueba se
realiza en placas de poliestireno de 96 pocillos. La intensidad
del color es directamente proporcional a la cantidad de anti-Ig
marcada que se haya captado, y ésta a su vez será
proporcional a la cantidad de Ac que se encuentren en la muestra
problema. Se puede estimar a simple vista (cualitativo) o
mediante espectrofotometría, expresándose como
densidad óptica.
Esta prueba de enzima ligada a un inmunoabsorbente se
utiliza principalmente para la cuantificación de la
concentración de anticuerpos.
Los ELISA más aplicados en veterinaria son los
ELISA directo y ELISA sandwich.
En el ELISA directo se liga un antígeno a los
pocillos de la placa o en el ELISA sandwich se liga un anticuerpo
monoclonal o policlonal como captura de antígeno.
Generalmente en medicina veterinaria son anticuerpos
específicos ligados a un ligando sólido que
interacciona con el suero problema. Para poner en evidencia esta
interacción se adiciona subsiguientemente anticuerpos
específicos antiespecie ligados a una enzima que puede ser
una peroxidasa o una fosfatasa. Para que la enzima actúe y
pueda ser revelada se le adiciona un sustrato adecuado.
Posteriormente se realiza la lectura midiendo las densidades
ópticas en un lector de ELISA. En cada placa se colocan
controles del sistema y controles positivos y negativos de
absorbancia conocida.
Un gran número de pruebas ELISA han sido
desarrolladas tanto para humanos como para las diferentes
especies animales. Las principales ventajas de estos
métodos son su flexibilidad que lo hacen ajustable a los
niveles de sensibilidad, especificidad y discriminación
necesarios a cada situación en particular, así como
su uso para muchas otras enfermedades. Diversos antígenos
han sido ensayados: células enteras, sonicados, LPS,
proteínas, entre otros.
Inmunohistoquímica (IHQ) e Inmunocitoquímica
(ICQ)
Cuando el ELISA se realiza sobre cortes de tejidos o
células, se denomina inmunohistoquímica e
inmunocitoquímica, respectivamente. Estas pruebas se
realizan sobre tejidos o células de manera similar a las
IF, y pueden ser directas o indirectas. En el último caso,
el conjugado es una Ig marcada con una enzima que convierte un
sustrato incoloro en un producto de reacción coloreado.
Esta prueba se lee con microscopio de luz, observándose
una reacción positiva como un precipitado de color sobre
las estructuras histológicas que contengan el Ag
buscado.
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Vaccination of cattle against Rhipicephalus
appendiculatus with detergent solubilized tick tissue
proteins and purified 20 kDa. Ann Parasitol Hum Comp
1992;67:50-4.
Autor:
Antonio Carmona Vega
Frco. Javier Romero
Sanchez
LEMA: ARTROPOVACUNA UN NUEVO
ENFOQUE EN EL ESTUDIO DE LA PROTECCIÓN HUMORAL DE LOS
VERTEBRADOS SUPERIORES CONTRA LOS ARTROPODOS CAUSANTES DE
ENFERMEDADES
PROYECTO DE INVESTIGACIÓN
NOVIEMBRE 2008
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