Microscopio óptico – Contraste de fase
Células HeLa (Henrietta Lacks)
Eritrocitos Humanos
Zygnema Filamentous Algae
Microscopio óptico – Contraste de fase
Microscopio óptico – Interferencia
Permite la visualización detallada sin teñir
Maximiza la diferencia entre los índices de refracción entre las partes de la muestra de forma de hacer visibles los limites celulares
Mismo principio que el microscopio de contraste de fase pero utiliza luz polarizada
Microscopio óptico – Contraste de fase e interferencia
Contraste
de fase
Interferencia
diferencial
Los objetos pueden también visualizarse por la luz que ellos mismos emiten
Microscopio óptico – Fluorescencia
(Gp:) Restringe infrarrojo
(Gp:) Pasa sólo la ? que permite la excitación del fluorocromo
Aequoria victoria
Microscopio óptico – Fluorescencia
Algunos “objetos” fluorescentes…
GFP
(Green fluorescent protein)
(Gp:) hela
(Gp:) Drpspphila
(Gp:) Célula de cebolla (peroxisomas)
Microscopio óptico – Fluorescencia – Confocal
Microscopio óptico – Fluorescencia – Confocal
Microscopio óptico – Fluorescencia – Confocal
Microscopía electrónica – Microscopio electrónico de transmisión (TEM)
Bacilos en división
Mitocondria 60.000x
Herpes virus ensamblándose en el núcleo
Bacteria fagocitada por un macrófago
Microscopía electrónica – Microscopio electrónico de transmisión (TEM)
Microscopía electrónica – Microscopio electrónico de barrido (SEM)
Glomérulo renal 1200x
Célula en corte transversal
Piel humana
Espermatozoides bovinos
Microscopía electrónica – Microscopio electrónico de barrido (SEM)
Célula vegetal con cristales (falsa tinción)
Bacterias sobre un estoma
Glób. Rojo
Glób. Blanco
Microscopía electrónica – Microscopio electrónico de barrido (SEM)
Elevados costos de los equipos y una infraestructura adecuada no permiten el uso de la técnica en cualquier laboratorio.
Altos costos de procesamiento de las muestras
La manipulación de reactivos se torna peligroso por la elevada condición toxica de los mismos.
Procesamiento tedioso de la muestra. Creación de artefactos
La complejidad de los equipos requiere de personal técnico especializado.
Proporciona resultados de amplia resolución y magnificación
Microscopía electrónica – Ventajas y desventajas
Técnicas inmunológicas
ELISA
Western blot
Inmunohistoquímica
Inmunofluorescencia
Citometría de flujo
Técnicas inmunológicas
Introducción a las Técnicas inmunológicas
Técnicas inmunológicas – Inmunoglobulinas
Anticuerpo
Antígeno
Técnicas inmunológicas – Anticuerpos
epitope
Linfocito B
Activación
Antígeno
Técnicas inmunológicas – Anticuerpos
Epitope A
Epitope C
Epitope B
Técnicas inmunológicas – Anticuerpos policlonales
Antigeno
Activación
Linfocitos B
Técnicas inmunológicas – Anticuerpos policlonales
Suero
(Gp:) Centrifugación
Sangre
(Gp:) Purificación
Técnicas inmunológicas – Anticuerpos policlonales
Técnicas inmunológicas – Anticuerpos monoclonales
Antígeno
Purificación de
Linfocitos B
Sangrado
Cultivo de células
tumorales
+
Fusión
Hibridoma
Hibridomas
Screening: Búsqueda de hibridoma positivo y aislamiento
Purificación de anticuerpos monoclonales del sobrenadante de cultivo de los hibridomas
Técnicas inmunológicas – Anticuerpos monoclonales
ELISA
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
Para detectar
Antígenos
Anticuerpos
ELISA
ELISA Para detectar Anticuerpos
Sensibilización
Bloqueo
Incubación con Suero
ELISA
ELISA Para detectar Anticuerpos
Lavado
Anticuerpo 2º
Revelado
ELISA
ELISA Para detectar Antígenos
Sensibilización
Bloqueo
Incubación con Suero
ELISA
ELISA Para detectar Antígenos
Lavado
Anticuerpo 2º
Revelado
ELISA
Técnicas inmunológicas – Detección indirecta
(Gp:) Biotina
(Gp:) Avidina
Técnicas inmunológicas – Complejo avidina/biotina
Antígeno
Ac. primario
Ac. secundario
Biotina
Cromógeno
Cromóforo
Avidina
Peroxidasa
Técnicas inmunológicas – Detección indirecta
Western blot
Western blot
Transferencia
SDS PAGE
Gel
Membrana
Western blot
Bloqueo
Anticuerpo 1º
Anticuerpo 2º
biotinilado
Avidina-peroxidasa
Revelado
Sustrato coloreado que precipita al reaccinar
Sustrato que emite luz al reaccionar con la enzima
Inmunohistoquímica
Trozo de tejido
Se corta en secciones muy finas y se coloca en un portaobjetos
Anticuerpo 1º
Anticuerpo 2º
biotinilado
Avidina-peroxidasa
Revelado
Inmunohistoquímica – Sustratos
Inmunohistoquímica – Revelado
Anti MMP-13 revelado con DAB
Contratinción hematoxilina
(Gp:) Rodamina
(Gp:) Fluoresceina
(Gp:) Ficoeritrina
(Gp:) DAPI
(Gp:) Bromuro
de Etidio
(Gp:) Naranja
de Acridina
Inmunofluorescencia
(Gp:) N-myc/CD56
Rat neurons
Inmunofluorescencia
Inmunofluorescencia – colocalización
La colocalización permite determinar si dos antígenos se encuentran en el mismo lugar (nucleo, vacuola, retículo, etc) dentro de una célula
Inmunofluorescencia – colocalización
Citometría de Flujo
Citometría de Flujo
Célula
Medida
En movimiento
Medida de las propiedades de las células mientras están en un flujo de líquido
Inmunofenotipificación
Viabilidad/apoptosis/Proliferación
Ciclo celular
Cambios en la superficie
Actividad enzimática
Citometría de Flujo
Mezcla de células
Marcación con anticuerpos monoclonales
Citometría de Flujo
La presión ejercida por una columna de fluido obliga a las células a “enfilarse” de a una
Citometría de Flujo
Columna de células
Citometría de Flujo
Laser
Detector
Citometría de Flujo
Tamaño
Granularidad
La luz que se detecta en la misma dirección del laser (forward) es detectada por el canal Forward Scatter Channel (FSC).
La intensidad de la señal detectada se relaciona con el tamaño, y el indice de refracción de las células
La luz que se detecta a 90 grados del haz del laser (side) es detectada por el canal Side Scatter Channel (SSC)
La intensidad de la señal es proporcional a la cantidad de estructuras citosólicas en la célula (gránulos, inclusiones, etc)
Citometría de Flujo
Dado que FSC es proporcional al tamaño y SSC a las estructuras internas, una correlación entre ellos permiten la diferenciación de los distintos tipos celulares en una población celular heterogenea
(Gp:) FSC
(Gp:) SSC
Linfocitos
(Gp:) Monocitos
(Gp:) Granulocitos
RBCs, debris,
Células muertas
Citometría de Flujo – Histograma
Intensidad de fluorescencia
Cuentas
Citometría de Flujo – Dot Plot
FL1
FL2
Citometría de Flujo – Dot Plot
Citometría de Flujo – Cell sorting
Citometría de Flujo
Citometría de Flujo
 Página anterior | Volver al principio del trabajo | Página siguiente  |