Transfecciones

La introducción de DNA en las células procariontes y levaduras se llama Transformación
La transformación de células eucariontes superiores se refiere a cambios en las características del cultivo celular
Por ello se utiliza el término transfección para denominar la entrada de DNA foráneo a la célula

Fibroblastos humanos COS

Cultivos primarios

Lineas celulares establecidas

Por transformación con oncogenes
Provenientes de tumores
Cultivos celulares

Curva de cultivos celulares
TRF
Divisiones celulares
Somáticas (telómeros se acortan
telomerasa inactiva)
Germinales (telomerasa activa)
senecencia
crisis
Extensión
de la vida celular
Células inmortales
(tel.activa)

TRANSFECCIONES
OBJETIVOS
Expresión de proteínas para su purificacón
Expresión de proteínas para estudiar su efecto sobre el fenotipo celular
Estudio de promotores y elementos regulatorios
Estudio de mecanismos involucrados en el procesamiento del RNA, postraduccionales, etc.
Interacción de proteínas
Clonado
Terapia génica

Problemas que pueden surgir de expresar proteínas en sistemas procariontes

Inestabilidad
Sin actividad biológica
Contaminantes procariontes
Características bioquímicas diferentes

Modificaciones postraduccionales imcompletas o ausentes

Clivaje proteolítico
Glicosilación
Alteraciones de los aminoácidos
fosforilación
acetilación
Sulfatación
Adición de ácidos grasos

Depende del tipo celularHeLa, HEK 293T, COS7,
Liposomas alta eficiencia, no-tóxicoe.g. Lipofectamine Plus (Invitrogen), Tfx20 (Promega)
Fosfato de calcio simple, baja eficiencia
DEAE-dextrano simple, alta efficiency, no para estable
Electroporación alta eficiencia, altos niveles de muerte
Microinyección laborioso, alta eficiencia
Biobalística para células vegetales
Retrovirus muy eficiente, trabajoso

Métodos de Transfección

Liposomas: mezcla
Moléculas lipídica catiónicas (N,N,N´,N´-tetramethyl-N,N´-bis(2-hydoxyethyl)-2,3-di(oleoyloxy)-1,4-butane-diammonium iodide)
Y de un lípido neutro L-dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE).

Electroporación