Virtualización de un modelo matemático para la polimerización de la Hemoglobina S

Resumen

La Anemia Drepanocítica o Sicklemia, primera enfermedad de origen molecular descubierta, aún constituye un problema de salud a escala mundial. La polimerización de la Hemoglobina S desoxigenada dentro del eritrocito es el evento fisiopatológico primario de la enfermedad. Los mecanismos moleculares de formación del polímero ocupan un papel central para entender la enfermedad y seleccionar las estrategias terapéuticas a seguir. Desde el 2001 se realiza una colaboración entre el Departamento de Matemática y el Centro de Biofísica Médica, ambos de la Universidad de Oriente, en la modelación de la polimerización de la Hemoglobina S, desarrollándose diversos modelos y sus soluciones. Dichos modelos presentan algunas limitaciones, por lo que en este trabajo se reformula el modelo matemático del proceso de polimerización de la Hemoglobina S desoxigenada, este emplea un sistema dinámico de ecuaciones diferenciales, teniendo presente cuatro estados fundamentales (monómeros, núcleo crítico, polímero y dominio) con una nueva función de polimerización no lineal.

Palabras clave: polimerización, hemoglobina S, modelación matemática

Introducción

La mayoría de los enfermos que padecían Anemia Drepanocítica (AD) o anemia de hematíes falciforme no esperaban pasar de la infancia. En 1994, un estudio afirmó que el 85% de los niños que habían desarrollado completamente esta enfermedad y el 95% de aquellos con una variante menos grave, llegaban hasta la edad adulta. Otro estudio de 1997 asegura que el índice de mortalidad en niños afroamericanos con la enfermedad de la AD ha disminuido en hasta un 53 %, quizás debido a los tratamientos preventivos. En el mundo millones de personas sufren de las complicaciones de esta enfermedad [33], [34].

Los estudios realizados revelaron que la AD evoluciona con la presencia de la hemoglobina S (Hb S). El grado del paciente drepanocítico, la severidad clínica, entre otros factores, depende de la concentración de Hb S que exista y de la identidad de la hemoglobina que la acompaña. La razón responsable de los procesos de falciformación ha sido estudiada por muchos años y en la actualidad se identifica el proceso de polimerización de la Hb S dentro del hematíe, como causa fundamental en su fisiopatología, destacándose varios factores fundamentales que influyen en el desarrollo de la polimerización, entre ellos los siguientes: el grado de oxigenación de Hb S, su composición, su concentración, la temperatura y el pH según [36].

Entre las complicaciones, se pueden incluir, entre otras, las siguientes: anemia, crisis de dolor o crisis de bloqueo, síndrome agudo de tórax, secuestro esplénico, accidente cerebro vascular, ictericia o color amarillo de la piel, los ojos y la mucosa bucal. Todos y cada uno de los órganos principales se ven afectados por la anemia de células falciformes. El hígado, corazón, riñones, vesícula biliar, ojos, huesos, las articulaciones pueden sufrir daños como consecuencia de la función anormal de las células falciformes. Los problemas pueden incluir: úlceras en las piernas, daño óseo, colelitiasis prematura (cálculos biliares), daño renal y pérdida de agua corporal en la orina, daño ocular [35].

Producto del grado y la severidad, que se expresan en los factores genéticos y a los factores externos como geográficos y la sociedad, existe una diferenciación en las manifestaciones clínicas de la enfermedad entre pacientes.

La modelación matemática ayuda a comprender los efectos que causan algunos fenómenos en sistemas biológicos, físicos, químicos, fisiológicos, etc. En esta afirmación está incluida la polimerización de la Hb S que ocurre dentro del glóbulo rojo en los pacientes con AD.

Se conocen modelos que explican desde el punto de vista teórico y experimental el comportamiento de la cinética de polimerización de la Hb S, empleando fundamentalmente el punto de vista termodinámico. En estos modelos predomina el comportamiento de la concentración de hemoglobina libre o monómeros y en los polímeros, utilizando los mecanismos de la doble nucleación.

El Centro de Biofísica Médica conjuntamente con el Departamento de Matemática, ambos de la Universidad de Oriente, han desarrollado investigaciones conjuntas en el desarrollo de un modelo matemático aplicando las Ecuaciones Diferenciales Ordinarias. Los resultados obtenidos hasta la fecha se basan en el modelo propuesto por Cabal y Ruíz donde se estudiaron

las consecuencias cualitativas del mecanismo de reacción para la formación de agregados moleculares de Hb S. La primera propuesta incluye la participación inicial de la Hb S en estado desoxigenado, considerándose esto una limitante, puesto que en la realidad existen moléculas de Hb en estado oxigenado.

Además han aparecido estudios [35] que demuestran que se puede lograr una despolimerización de los microtúbulos (fibras de hemoglobina) y se conoce que pueden existir otros factores que modifiquen la cinética de polimerización. Otros autores introducen los términos de hemoglobina oxigenada, pero los casos resueltos no se tienen en cuenta. Todos los modelos o sus variantes se han realizado en base a análisis lógicos teniendo presente sólo la presencia de la Hb en sus estados libre o asociado y no se han podido corroborar en la práctica y vincularlo a los parámetros que se han medido experimentalmente.

Partiendo de las limitantes de los modelos anteriores, en este trabajo se diseña un nuevo esquema del sistema. El campo de acción será la modelación matemática de un sistema biológico particularizando en modelos matemáticos de reacción difusión combinado con estructurados; al nuevo modelo le es posible aplicar un análisis cualitativo para encontrar condiciones de estabilidad y teniendo en cuenta estas realizarle entonces una experimentación numérica para obtener una aproximación de las soluciones. Una característica distintiva en este modelo es la definición que se utiliza para la función de polimerización, que no es lineal y tiene presente las interacciones entre núcleos críticos y polímeros; por tanto, se define como objetivo general de la presente investigación: el desarrollo de un modelo matemático en Ecuaciones Diferenciales Ordinarias usando los cuatro estados fundamentales del proceso de polimerización de la Hb S desoxigenada, considerando como función de polimerización un polinomio de segundo grado que lleva implícito las iteraciones entre núcleos críticos y polímeros.

Anemia Drepanocítica

La importancia de las hemoglobinopatías en el ámbito de la Salud Pública ha suscitado un acelerado desarrollo de tecnologías para su análisis en el laboratorio, particularmente de procedimientos diagnósticos rápidos y precisos. Se ha podido detectar directamente el trastorno genómico asociado con cada una de las diferentes alteraciones moleculares de la hemoglobina.

El defecto básico en la AD o hemoglobinopatía SS reside en un gen mutante autosómico recesivo que produce un amino ácido diferente al correspondiente en la síntesis de la Hb, constituyendo esta Hb anormal un ejemplo de mutación puntual simple donde el codón normal GAG fue sustituido por GUG [1] [2].

La AD es una de las más frecuentes en el mundo, una anemia hemolítica que se transmite con una intensidad variable pero habitualmente grave. Constituye un modelo genuino de enfermedad molecular, desde los niveles de la estructura y de la acción genética hasta el síndrome clínico final en el paciente [3] [4] [5]. Es una enfermedad común en Cuba y una de las patologías hematológicas de carácter genético que constituye todavía un problema social y de salud pública.

De acuerdo a un informe de la Organización Mundial de la Salud (OMS) cada año nacen 200 000 niños afectados. En Cuba el 3.1 por ciento de la población es portadora de la Hb anormal [6]. Su prevalencia varía en cada uno de los subgrupos de población, de acuerdo con el pool genético, las condiciones ambientales y climáticas, el nivel de salud pública y social, y los patrones matrimoniales [3] [6].

Fisiopatología de la Anemia Drepanocítica

La Hb S puede encontrarse en el individuo portador del gen mutado en dos estados característicos, el estado heterocigoto o portador (AS) y el estado homocigoto (SS), constituyendo este último la máxima expresión de la enfermedad. Las primeras manifestaciones clínicas no aparecen en el momento del nacimiento debido a la alta concentración de la hemoglobina fetal (Hb F) en este momento de la vida, pero pueden presentarse entre los tres y seis meses de edad. A partir de este momento se observan en la sangre periférica células o glóbulos rojos en forma de hoz o media luna, responsables de las manifestaciones clínicas y hematológicas de la enfermedad como consecuencia de la excesiva destrucción eritrocitaria e hiperplasia del sistema eritropoy ético [3] [5]. La hipoxia tisular causada por la vasooclusión en la microcirculación, y el consiguiente daño de los órganos, constituye la primera causa de morbilidad y mortalidad en esta enfermedad [4] [8] [9].

El cuadro clínico de la AD muestra grandes diferencias entre pacientes, desde una anemia muy severa hasta una vida prácticamente normal. Se presenta en forma de manifestaciones sistemáticas y eventos vasooclusivos con el consiguiente daño de los órganos y los tejidos [1] [6]. Se caracteriza por signos y síntomas propios de una anemia hemolítica crónica grave, susceptibilidad a las infecciones incrementada, retraso del crecimiento, desarrollo de crisis de dolor por oclusión vascular, cuadro torácico agudo, síndrome de secuestro esplénico, daño tisular, trastornos del sistema nervioso central, crisis aplásicas y hemolíticas y asplenia funcional [10] [11]. Muestra variabilidad en las manifestaciones hematológicas y clínicas, lo cual afecta a las tasas de morbilidad y mortalidad de los pacientes con este síndrome drepanocítico en diferentes partes del mundo [12] [13].

La principal causa de morbilidad en esta enfermedad es la crisis de dolor [14], razón más frecuente de ingresos a los hospitales, que se origina por infartos de la médula ósea, huesos, perióstio y tejidos periarticulares grandes, como consecuencia de la oclusión causada por células falciformes en los vasos que irrigan las regiones afectadas. Además están presentes otros tipos de crisis hematológicas que agravan al paciente [15].

Polimerización de la Hemoglobina S

La pequeña sustitución de amino ácidos en esta Hb anormal ha derivado en profundas consecuencias biofísico-químicas; en estado de desoxigenación ocurre el proceso de polimerización, es decir, las moléculas de dHbS forman agregados moleculares en forma de estructuras microtubulares elongadas o polímeros paracristalinos, también llamados gel, cristal líquido o tactoide [16]. Estas estructuras rigidifican y distorsionan el glóbulo rojo (sickling celular) los cuales con su flexibilidad disminuida pueden obstruir los pequeños capilares en la circulación y ocasionar una oxigenación deficiente de los tejidos [17].

La polimerización intracelular parece ser el factor primario esencial que determina las manifestaciones patofisiológicas de la enfermedad. Por estudios en los que la polimerización ha sido inducida por cambios de temperatura se ha visto que el tiempo de gelificación es muy inusual, existiendo dos tipos de procesos de nucleación: homogéneo y heterogéneo [18].

La polimerización es iniciada por la nucleación homogénea, previo a que se dispare la reacción, hay un tiempo de demora (td) donde no hay una formación medible de fibras, las moléculas de Hb S se van agregando para formar un núcleo crítico (nucleación). Una vez que se ha formado el mismo la polimerización procede por la adición sucesiva de monómeros de Hb, que aumentan la estabilidad del agregado, ésta se completa en un 90 por ciento en un tiempo igual o menor al td. De esta manera se conforman las fibras, las que se encuentran organizadas formando los dominios. A medida que las fibras crecen, éstas se alinean espontáneamente precediendo este proceso la nucleación heterogénea, o sea, la formación de un núcleo en la superficie del polímero ya existente [19]. En este modelo el paso limitante es la nucleación homogénea al ser este el más lento [5] [16] [18] [20].

La interacción proteína-proteína de las moléculas de dHbS durante la nucleación están dadas por interacciones débiles del tipo hidrofóbico [21] [22]. Cabe destacar que sólo una de las dos amino ácidos mutados Val _6 en cada tetrámero participa en estos enlazamientos hidrofóbicos moleculares [2] [7]. Posteriormente las moléculas de Hb S hidrofóbicamente asociadas interactúan con otros sitios de contacto del polímero resultando en la formación de un complejo con una estructura ordenada. Un importante puente de hidrógeno que ayuda a estabilizar el contacto lateral de la Val _6 [21]. Esta segunda reacción en la formación del núcleo no puede ocurrir sin la primera reacción hidrofóbica [5] [18] [20] [23] [24].

Por estudios de difracción de rayos X y microscopía electrónica se ha visto que los tetrámeros de dHbS al formar el polímero se van uniendo alrededor de un eje vertical formando anillos helicoidales espirales de moléculas de Hb que se encajan unas encima de las otras dando lugar a la formación de largas fibras. La estructura de la fibra es un ensamblamiento helicoidal complejo de 14 trenzas de moléculas de HbS (con un corazón núcleo central de 4 trenzas y 10 externas rodeándolas) donde cada fibra está compuesta de 7 pares de moléculas en un empaquetamiento aproximadamente hexagonal [17] [22] [25], las cuales posteriormente van creciendo y formando agregados moleculares de mayor nivel de organización.

Factores que influyen en la polimerización

Al analizar el proceso de polimerización son varios los factores fisiológicos que influyen en este, siendo los de mayor incidencia [1] [5] [8]:

• El grado de oxigenación de la Hb S [26]

La unión del oxígeno con la Hb S ejerce un efecto determinante sobre la polimerización, demostrándose que la dependencia en la formación de los drepanocitos irreversibles con la tensión de oxigeno se debe al defecto de la hemoglobina Hb S intracelular [5] [8]. La gran mayoría de los estudios de la cinética de polimerización de la Hb S "in vitro" que reporta la literatura parte de la desoxigenación total de la muestra, empleándose diversos agentes químicos como el Ditionito de Sodio o presiones de gases que desplacen al oxígeno, como es el caso del N2, el CO2. En los estudios sobre la influencia del grado de oxigenación se han detectado polímeros a valores relativamente altos de saturación de oxigeno [27] [28].

• La concentración de monómeros Hb S

La polimerización es muy dependiente de la concentración de Hb S (supersaturación), a una temperatura constante al aumentar la concentración de dHbS, se llega a un punto de saturación por encima del cual la Hb deja de encontrase disuelta y forma el polímero. La solubilidad de la Hb S en condiciones experimentales usuales (solución Buffer de Fosfato de Potasio 0,15 mol/L, pH 7.15) varía de 0.32 g/cm3 a 0 ºC a un mínimo de 0.16 g/cm3 cercano a 35 ºC mientras que otros tipos de Hb presentan una solubilidad mayor que 0.5 g/cm3 [28]. La concentración de Hb corpuscular media (CHCM) es habitualmente mayor de 0.30 g/dL, independiente del sexo y la edad, lo que provoca el comportamiento no ideal de la solución de dHbS intracelular que polimeriza [8] [28]. La concentración y la temperatura de la solución tienen una relación muy estrecha.

• La presencia de otras hemoglobinas

Se conoce desde hace muchos años la capacidad de algunas variantes hemoglobínicas de facilitar o inhibir la polimerización de la Hb S. Al mezclar Hb S con otras hemoglobinas como la Hb A(_2_2); la Hb F(_22) y la Hb A2 (_2_2), éstas han mostrado un efecto fuertemente inhibidor [29] [30]. Esta baja probabilidad de copolimerización se puede explicar por los efectos desestabilizadores en los contactos intermoleculares de la doble hélice debido a que la secuencia de la cadena difiere de la composición de bs por 39 residuos aminoacídicos [5] [29] [30].

• La temperatura

La polimerización de la Hb S muestra un coeficiente de temperatura negativo,

un polímero formado de una solución de Hb S desoxigenada con una concentración determinada a 37 ºC, se convierte a 4 ºC en una solución homogénea de monómeros. Esta observación prueba la intervención de enlaces hidrofóbicos en el fenómeno de la polimerización [5] [31].

• El pH

El reconocimiento de la contribución del pH sobre la polimerización es atribuido a Hanh y Gillespie (1927), quienes reportaron que la polimerización es inhibida a pH alcalino e incrementada por la acidificación. La contribución puede deberse a la disminución de la afinidad por el oxígeno por vía del efecto Borh [4] [6] [8] [9], lo cual incrementa la cantidad de Hb desoxigenada, o a los cambios en el número de grupos ionizables sobre la proteína [32].

Para estudiar la polimerización de la Hb S se han empleado un grupo de técnicas experimentales, entre estas la RM Protónica; su uso en el Centro de Biofísica Médica dio pie al desarrollo de una metodología que ha posibilitado el estudio de la cinética de polimerización de la Hb S, en diversos estados del paciente drepanocítico, así como el estudio de la influencia de agentes químicos en el proceso de polimerización de la Hb S y su acción terapéutica.

Aún no se han descrito modelos biofísicos y matemáticos que describan con precisión todo el proceso cinético de la polimerización de la Hb S. Los primeros modelos emplearon la termodinámica pero sólo lograron explicar el inicio del proceso, nuevos intentos no han fructificado.

Modelos matemáticos

La aplicación de la modelación matemática consiste en el reemplazo del objeto cognitivo por su imagen matemática (modelo matemático) la cual, implementada en algoritmos lógicos o numéricos en un ordenador, permite estudiar las cualidades del proceso original. Este método de cognición conjuga las ventajas de la teoría y del experimento. Al trabajar con el modelo matemático y no con el objeto cognitivo, en forma relativamente rápida y a bajos costos, se pueden estudiar y pronosticar sus propiedades de estado (ventaja teórica). Al mismo tiempo los algoritmos numéricos permiten, apoyándose en la potencia de cálculo de los ordenadores, verificar las cualidades del objeto cognitivo en una forma no accesible para los enfoques teóricos (ventajas del experimento).

Por tanto, la modelación matemática tiene gran importancia, ya que brinda ventajas como:

• Se basa en análisis cualitativo en forma de formulas

• Se puede comprobar en los experimentos

• Se puede interpolar e interpretar situaciones que no se pueden realizar directamente en el material vivo

• Permite predecir el comportamiento de un proceso en un momento dado, así como su reacción frente a un agente externo

La modelación del proceso de polimerización se ha realizado por diversos autores. Hace varios años se han venido realizando investigaciones conjuntas entre el Centro de Biofísica Médica y el Departamento de Matemática, ambos de la Universidad de Oriente, en el desarrollo de un modelo matemático que sea capaz de representar la cinética de polimerización de la Hb S.

En los estudios preliminares vinculados a esta investigación, se comprobó que los modelos existentes si bien mostraban un comportamiento real de la dinámica de la Hb S, tenían en su generalidad limitantes como las que a continuación se muestran:

• Identifican los monómeros en su estado libre y como parte del núcleo critico

• El núcleo crítico no es reconocido como una unidad estructural que da pie a la formación de los polímeros o agregados de mayor nivel de organización

• No se tenían presentes en la mayoría de los mismos las interacciones entre los diversos estados

• Se utilizan simbologías diferentes para procesos autovinculados

• Al resolver los casos particulares se simplificaban parámetros perdiéndose así en muchos casos su carácter no lineal, es decir, se analizan en primera aproximación

Teniendo presente las limitantes de los modelos estudiados, se realiza una modelación matemática del proceso de polimerización de la Hb S empleando sistemas dinámicos de ecuaciones diferenciales, reconociendo al núcleo crítico como un estado de este debido a que es una unidad estructural de elevada importancia en la formación de polímeros o agregados de mayor organización; se tienen en cuenta todas las interacciones entre los diversos estados, ofreciéndose un nuevo polinomio de polimerización que lleva explícito la estructura de las funciones de polimerización y despolimerización usadas en trabajos anteriores que caracterizan la nucleación homogénea y la heterogénea, usándose una nueva simbología para cada reacción y su inverso.

Modelación matemática

Nuestra modelación parte de la compartimentación, confeccionando un nuevo esquema que ilustra el proceso de polimerización, en el cual X1, X2, X3 y X4 representan los estados de monómeros, núcleos críticos, polímeros y dominios, respectivamente, y los todas las posibles reacciones entre estos. Lo antes expuesto se observa en el Modelo de Compartimentación (ver figura).

Modelo de Compartimentación

Se procede ahora a determinar las relaciones entre las velocidades de crecimiento de cada uno de los estados, es decir, la confección del modelo matemático.

La dinámica de la variación de monómeros en el tiempo está sujeta a las siguientes leyes:

• los monómeros que se desprenden de los núcleos críticos, polímeros y dominios; estas reacciones las definen los coeficientes y respectivamente.

• los monómeros que reaccionan con los núcleos críticos, polímeros y dominios; estas reacciones las definen los coeficientes y respectivamente.

Atendiendo a los aportes de este compartimiento se obtiene la siguiente relación:

La dinámica de la variación de núcleos críticos en el tiempo está sujeta a las siguientes leyes:

• los núcleos críticos que se desprenden de los polímeros y dominios; estas reacciones las definen los coeficientes y respectivamente.

• los núcleos críticos que reaccionan con los monómeros, polímeros y dominios; estas reacciones las definen los coeficientes y respectivamente.

• los monómeros que reaccionan con los núcleos críticos; esta reacción la define el coeficiente

Atendiendo a los aportes de este compartimiento se obtiene la siguiente relación:

La dinámica de la variación de polímeros en el tiempo está sujeta a las siguientes leyes:

• los polímeros que se desprenden de los dominios; esta reacción la define el coeficiente

• los polímeros que reaccionan con los monómeros, núcleos críticos y dominios; estas reacciones la definen los coeficientes y respectivamente.

• los monómeros y núcleos críticos que reaccionan con los polímeros; estas reacciones las definen los coeficientes y respectivamente.

Atendiendo a los aportes de este compartimiento se obtiene la siguiente relación:

La dinámica de la variación de dominios en el tiempo está sujeta a las siguientes leyes:

• los polímeros, núcleos críticos y monómeros que se desprenden de los dominios; estas reacciones las definen los coeficientes y respectivamente.

• los monómeros, núcleos críticos y polímeros que reaccionan con los dominios; estas reacciones las definen los coeficientes y respectivamente.

Atendiendo a los aportes de este compartimiento se obtiene la siguiente relación:

Estas ecuaciones que se han obtenido caracterizan las variaciones de cada uno de los estados, lo cual permite arribar al siguiente sistema de Ecuaciones Diferenciales Ordinarias:

más la ecuación de conservación de masa

donde N es una constante.

La función de polimerización se definirá usando los dos tipos de nucleación en el coeficiente

donde caracterizará la nucleación homogénea y la heterogénea, por lo que finalmente se obtendrá el siguiente sistema:

Coeficiente de la reacción de adición de monómeros a núcleos críticos

Coeficiente de la reacción de separación de monómeros en núcleos críticos

Coeficiente de la reacción de polimerización por adición de monómeros

Coeficiente de la reacción de despolimerización por separación de monómeros

Coeficiente de la reacción de cristalización por adición de monómeros

Coeficiente de la reacción de descristalización por separación de monómeros

Coeficiente de la reacción de polimerización por adición de núcleos críticos

Coeficiente de la reacción de despolimerización por separación de núcleos críticos

Coeficiente de la reacción de cristalización por adición de núcleos críticos

Coeficiente de la reacción de descristalización por separación de núcleos críticos

Coeficiente de la reacción de cristalización por adición de polímeros

Coeficiente de la reacción de descristalización por separación de polímeros

Conclusiones

en este trabajo se desarrolló un nuevo modelo matemático que describe la cinética de polimerización de la Hemoglobina S desoxigenada a partir de estudios preliminares realizados a modelos matemáticos elaborados por la colaboración del Centro de Biofísica Médica y el Departamento de Matemática, ambos de la Universidad de Oriente. Dicho modelo suprime las limitantes de los obtenidos anteriormente y adiciona un nuevo estado en el proceso de polimerización de la Hemoglobina S, así como una nueva definición de la función de caracteriza dicho proceso.

Por otra parte, al resultado obtenido es posible realizarle un análisis cualitativo aplicando la teoría de ecuaciones diferenciales no lineales para luego analizar el comportamiento de las trayectorias en una vecindad de las posiciones de equilibrio. Posteriormente, se recomienda realizar una experimentación numérica para calcular el intervalo de variación de algunos parámetros y comparar las condiciones de estabilidad con el comportamiento de las soluciones obtenidas por otros autores.

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[33] Sickle-Cell Disease Association of America, Inc., 200 Corporate Pointe, Suite 495, Culver City, CA 90230 – 7633. Call (800 – 421 – 8453) or (310 – 216 – 6363) or on the Internet (http://SickleCellDisease.org/).

[34] This is a very helpful organization. It puts people in touch with support groups, genetic counselors, and provides information on some disorders. American Pain Society, 4700 W. Lake Avenue, Glenview, IL 60025. Call (847 – 375 – 4715) or on the Internet (http://www.ampainsoc.org/).

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Autor:

Lic. Emilio Soto Rey

DrC. Sandy Sánchez Domínguez

Profesores Asistentes, Departamento de Matemática, Facultad de Ciencias Naturales y Exactas, Universidad de Oriente, Santiago de Cuba, Cuba