Descripción de un protocolo estandarizado de toxicidad aguda para cladóceros

Indice
1.
Introducción
2. Bioensayos
3. Tipos
4. Bioensayos de toxicidad
aguda con cladóceros
5. Conclusiones y
Recomendaciones
6.
Bibliografía

1.
Introducción

La actividad humana produce gran variedad de desechos
que son liberados a los ambientes terrestres, aéreos y
acuáticos. La introducción de un determinado desecho
antropogénico puede o no introducir desequilibrios en un
ecosistema que
conduzcan a su deterioro. Para cada desecho existe una
concentración umbral, por encima de la cual se detectan
los efectos responsables de dichos desequilibrios (Cairns, 1986).
En general, los sistemas
naturales poseen la capacidad de soportar alteraciones debidas a
la presencia de agentes foráneos mediante los procesos
internos de autodepuración. El deterioro de un ecosistema se
produce cuando la cantidad y calidad de
desechos introducidos superan su capacidad de recuperación
(Tortorelli y Hernández, 1995).
La
contaminación es la impregnación del aire, el agua o el
suelo con
productos que
afectan a la salud del hombre, la
calidad de
vida o el funcionamiento natural de los ecosistemas
(Microsoft
Encarta, 2001). Esta es una consecuencia indeseable de los
procesos
productivos que afecta no sólo a la salud humana sino
también a la integridad de los ecosistemas,
ocasionando daños a veces irreversibles, tales como las
pérdidas de biodiversidad
(Paggi y de Paggi, 2000). Donde quizás el deterioro
ambiental se hace más acuciante es en el agua, pues es
un insumo básico para la subsistencia de todo organismo
vivo y para las actividades productivas del hombre (Paggi
y de Paggi, 2000).
Existen varias estrategias para
la elaboración del diagnóstico de la calidad de
agua de un
ambiente
determinado, tales como: la determinación de
parámetros físico-químicos y
bioquímicos; la detección de bioindicadores de
contaminación y la realización de
bioensayos de laboratorio y
de campo (Tortorelli y Hernández, 1995).
Los bioensayos son pruebas en las
cuales un tejido vivo, organismo o grupo de
organismos son usados como agentes para determinar la potencia de
cualquier sustancia fisiológicamente activa o de actividad
desconocida (Reish y Oshida, 1987), permitiendo comparar la
toxicidad de diferentes compuestos y conocer la sensibilidad de
las diversas especies, para determinar los mecanismos de los
efectos de las sustancias ensayadas (Alcazar, 1988).
Una de las formas básicas de prevenir los problemas
derivados de la
contaminación es el control periódico
de la calidad del agua, es decir, conocer qué sustancias
tiene disueltas o suspendidas. Para esto se debe hacer un
análisis específico por cada una de
las sustancias que se desee saber si existe, o en qué
concentración se encuentra (Paggi y de Paggi, 2000). En
este sentido los bioensayos de toxicidad permiten evaluar el
grado de afectación que una sustancia química tiene en
organismos vivos y éstos pueden ser agudos o
crónicos. Las pruebas agudas
cuantifican las concentraciones letales de un xenobiótico
a una especie en particular. El valor
calculado se denomina concentración letal media
(CL50) y corresponde a la concentración de un
xenobiótico que causa la muerte al
50 % de la población experimental al cabo de un
tiempo
determinado, generalmente en 48 o 96 horas. En contraste, las
pruebas crónicas estiman la concentración –
efecto media (CE50) de la sustancia de prueba que
causa un efecto al 50 % de la población experimental, al cabo de un
tiempo
determinado (Rodríguez y Esclapés, 1995).
Para regular las descargas de aguas residuales tóxicas hay
que utilizar datos de ensayos de
toxicidad hechos con organismos vivos y confiar en estos datos,
además de efectuar estudios detallados de las características físicas y
químicas de los contaminantes y de los cambios que ocurren
después de su descarga en el medio. Cuando se puedan
describir con precisión en términos químicos
y físicos los componentes tóxicos de un
contaminante y se disponga de técnicas
analíticas pertinentes y de suficiente información acerca de la toxicidad de esos
componentes para los organismos acuáticos, se
podrán establecer normas para tales
contaminantes en valores
numéricos para los componentes tóxicos (FAO,
1981).
Los bioensayos de toxicidad con agentes contaminantes en
organismos vivos bajo condiciones de laboratorio,
se han incrementado en estos últimos tiempos debido a la
brevedad con que se obtiene la información sobre las dosis letales y
subletales (CL50) que afectan negativamente organismos
vivos en los ambientes marinos, estuarinos (Villamar, 1996) y
dulceacuícolas.
La prevención, y más aún la
corrección, de los efectos negativos de la contaminación es muy costosa. Países
como Estados Unidos,
Japón,
y de Europa, han
incorporado a su rigurosa legislación de control de
calidad del ambiente
criterios que surgen de los bioensayos. La ventaja de estos
métodos es
que nos informan si en el agua hay
alguna sustancia que resulte tóxica, o sea, algún
agente que pueda producir un efecto adverso en el sistema
biológico, dañar su estructura o
función, o producir la muerte. En la
práctica estos métodos no
pueden reemplazarse por los análisis químicos (Paggi y de Paggi,
2000).
Los contaminantes según su efecto se pueden dividir en dos
grupos
principales (FAO, 1981):

• Los directos que tienen efectos bien definidos y
  nocivos en las poblaciones de organismos acuáticos. Este
  grupo abarca
  los contaminantes térmicos y químicos
  tóxicos que pueden degradarse fácilmente, como el
  fenol, o las sustancias tóxicas persistentes y
  posiblemente bioacumulativas, tales como plaguicidas clorados
  orgánicos.
• Los indirectos son capaces de modificar el medio
  ambiente acuático de un modo que afecta
  perjudicialmente a la fauna y la
  flora. Este grupo incluye las sustancias sólidas,
  orgánicas o inorgánicas, no tóxicas que
  pueden quedar en suspensión y que por ello estorban la
  penetración de la luz y en
  consecuencia la acción fotosintética de las
  algas, o bien pueden sedimentarse, con lo cual afectan a los
  seres bentónicos, y las aguas residuales con elevada
  demanda
  bioquímica de oxígeno, que son la causa de que en el
  medio haya bajas concentraciones de oxígeno disuelto.

De forma general, los contaminantes que llegan al medio
marino y se consideran críticos por sus efectos negativos
sobre dicho ambiente y el hombre, se
ordenan en metales pesados,
productos
químicos sintéticos, petróleo y
sus derivados, elementos radioactivos y desechos sólidos
(Lam et al., 1997). Los metales pesados
son de origen natural y antropogénico. Normalmente, se
encuentran en los sedimentos y son bioacumulados a lo largo de
las cadenas tróficas. No pueden destruirse, y pueden
combinarse con sustancias orgánicas formando complejos
sumamente tóxicos. En orden descendente de toxicidad los
metales pesados para organismos marinos, con respecto a las fases
más sensibles de los ciclos de vida, es como sigue:
mercurio (Hg), plata (Ag), cobre (Cu),
zinc (Zn), níquel (Ni), plomo (Pb), cadmio (Cd),
arsénico (As), cromo (Cr), estaño (Sn), hierro (Fe),
manganeso (Mn), aluminio (Al),
berilio (Be), y litio (Li) (Lam et al., 1997).
El uso de bioensayos para la evaluación
de toxicidad de sustancias liberadas al medio a través de
efluentes, ha llevado a la utilización de biomonitores
propios de los ambientes evaluados, lo cual favorece
indirectamente la preservación de la biodiversidad
local. Sin embargo, la variabilidad en la aplicación de
las técnicas
experimentales para el mantenimiento
de organismos silvestres afecta la interpretación y
comparación de los resultados entre laboratorios, por lo
que se hace necesario desarrollar metodologías
estandarizadas para establecer condiciones controladas (Palacios
y Pereira, 1997).
La captación y utilización de zooplancton como
biomonitores data desde comienzos de siglo XX (Sosnowski et al.,
1979), hoy en día, gracias al desarrollo de
técnicas para su cultivo en el laboratorio, representa una
herramienta que gana cada vez más reconocimiento en la
evaluación ecotoxicológica
(Maciorowski, 1981).
Al usar organismos provenientes directamente del hábitat
natural, los resultados pueden verse distorsionados por fuentes de
variabilidad no previstas, como nutrición y dinámica de la población, estrés por
depredación, etc. (Sosnowski et al., 1979). Estas variables
pueden ser controladas o eliminadas en las poblaciones de
laboratorio; además, el entrecruzamiento
consanguíneo que ocurre a lo largo del tiempo en esas
poblaciones, resulta en una considerable reducción de la
variabilidad genética
(Lewontin, 1974).
A causa de la complejidad del ambiente acuático y de las
comunidades biológicas que lo integran es difícil
establecer el grado de deterioro que afecta a las especies o
comunidades acuáticas. Por esta razón es
conveniente realizar bioensayos utilizando organismos vivos en
condiciones controladas de laboratorio. Sin embargo, el objetivo
primordial de un bioensayo es reflejar la realidad de cómo
afectaría a los organismos vivos en su medio natural y
para ello es necesario paralelamente investigar continuamente las
comunidades en su propio hábitat (Villamar, 1996).
Dentro de los organismos comúnmente utilizados en los
bioensayos de toxicidad se encuentran los cladóceros,
también llamados pulgas de agua, son crustáceos
pequeños que constituyen la mitad de la Clase
Branchiopoda. El caparazón (bivalvo) encierra al tronco,
pero no a la cabeza y suele terminar posteriormente en una espina
apical. La cabeza porta un sólo ojo nauplio mediano;
también posee antenas
frecuentemente largas y utilizadas en la natación.
Además, presenta de cuatro a seis pares de
apéndices troncales y el potsabdomen esta girado
ventralmente hacia delante. La mayoría de estos organismos
son pálidos y transparentes y viven casi exclusivamente en
agua dulce (Ruppert y Barnes, 1996). Debido a su importancia
ecológica y su sensibilidad a ambientes intervenidos, se
les considera especies indicadoras de condiciones ambientales
adversas. Además, por ser organismos de fácil
mantenimiento
bajo condiciones de laboratorio, normalmente se utilizan en
pruebas de toxicidad acuáticas. En nuestro país
existen numerosas especies de cladóceros que habitan los
lagos naturales y artificiales, zonas inundables y charcas
temporales (Rodríguez y Esclapés, 1995).
Según Reish y Oshida (1987), para la realización de
bioensayos es conveniente el uso de zooplancton por su
pequeña talla, requiere equivalentemente poco espacio de
laboratorio, poco volumen de agua,
poca cantidad de tóxico, ciclo de vida
corto, requerimientos nutricionales generalmente conocidos, lo
cual lo hace ideal para estudios de bioacumulación.
Existen numerosos trabajos realizados con cladóceros
sometiéndolos a metales pesados: Pereira y García
(1994), Rodríguez y Esclapés (1995),
Martínez-Tabche et al.(1997), Baillieul y Blust (1999),
Esclapés (1999). También se han hecho experiencias
utilizando insecticidas como contaminantes: Bergling y Dave
(1984), Gliwcz y Sieniawska (1986), Chu et al. (1997), Dewey y
Parker (1998), demostrando que estos organismos son ampliamente
utilizados como bioindicadores.

Los objetivos del
presente trabajo de investigación son:
Elaborar una descripción completa de los bioensayos y de
todos los elementos necesarios en su
realización.

• Definir bioensayo y establecer una
  clasificación.
• Describir los criterios generales requeridos en la
  selección de especies a utilizar en
  ensayos.
• Nombrar las ventajas que ofrecen los
  cladóceros como organismos utilizados en
  bioensayos.
• Describir la preparación del material, de las
  soluciones
  de exposición, desarrollo
  de los bioensayos y análisis de resultados.

Elaborar un protocolo
estandarizado específico para bioensayos de toxicidad
aguda con cladóceros.

• Describir la elaboración de medios de
  cultivo para cladóceros y para microalgas.
• Nombrar las condiciones óptimas necesarias en
  el desarrollo de los bioensayos con
  cladóceros.

2.
Bioensayos

Se entiende por bioensayo un ensayo en
que un tejido, organismo o grupo de organismos vivos se usan como
reactivo para determinar la potencia de
cualquier sustancia fisiológicamente activa cuya actividad
se desconoce (FAO, 1981).
Los bioensayos, o pruebas de toxicidad son experimentos que
miden el efecto de uno o más contaminantes en una o
más especies (Reish y Oshida, 1987), permiten evaluar el
grado de toxicidad de una sustancia química, un efluente,
un cuerpo de agua, etc., empleando organismos vivos
(Esclapés, 1999). Puede determinarse la influencia
relativa de cada factor sobre los parámetros
biológicos estudiados. Los rangos de variación de
los factores considerados pueden ser mayores que los existentes
en el ambiente natural, lo que muchas veces facilita el estudio
de su modo de acción. También pueden estudiarse
combinaciones de dos o más factores, lo que permite
revelar la existencia de antagonismos o sinergismos entre ellos.
La posibilidad de controlar muchas de las variables hace
posible la eliminación de las fluctuaciones propias de las
condiciones naturales, que generalmente oscurecen o interfieren
con la finalidad principal del estudio llevado a cabo
(Rodríguez et al., 1995).
Para proteger el medio acuático es necesario fijar
límites
superiores a las descargas de contaminantes perjudiciales
químicos y físicos, además de vigilar y
regular las descargas que se realicen posteriormente. Los
límites
superiores de las descargas se derivan de la consideración
de los criterios apropiados de calidad de agua formulados a
partir de datos de respuestas para sistemas
biológicos (bioensayos crónicos o agudos) (FAO,
1981).
Las pruebas pueden durar varios periodos de tiempo, pero las de
96 horas son las más comunes. Los individuos son expuestos
a concentraciones crecientes del tóxico para determinar
cambios en el organismo. En general la muerte es
el criterio más utilizado en la prueba de 96 horas. Uno o
más controles son utilizados en organismos expuestos a
similares condiciones excepto cuando existe falta de
disponibilidad del tóxico (Reish y Oshida, 1987).
Los bioensayos toxicológicos tienen por finalidad
determinar las concentraciones de un tóxico dado que
ocasionen efectos dañinos o nocivos en un organismo
modelo. Estos
efectos pueden incluirse en las siguientes
categorías:

• Afectación del término de
  vida
• Alteración de la tasa de
  crecimiento
• Cambios de los parámetros reproductivos (Reish
  y Oshida, 1987).

3. Tipos

1. Ensayos de respuesta directa. Bioensayos de
   toxicidad:
2. 1. Bioensayos agudos: Cuantifican las
      concentraciones letales de un xenobiótico a una
      especie en particular. El valor
      calculado se denomina concentración letal media
      (CL50), y representa la concentración que
      causa la muerte
      al 50 % de la población experimental, en un tiempo
      determinado (generalmente 48 o 96 horas) (Esclapés,
      1999).
   2. 1. De tipo estático: Se efectúa
         sin la renovación continua del flujo constante
         de las diluciones sometidas al ensayo (FAO, 1981).
      2. 1. Sin renovación: los organismos se
            exponen a la misma solución de prueba el
            tiempo de duración del ensayo (Esclapés,
            1999).
         2. Con renovación: los especimenes se
            someten a una preparación fresca de la misma
            concentración inicialmente empleada,
            periódicamente (generalmente cada 24 horas)
            (Esclapés, 1999). Tal renovación
            puede ser necesaria cuando importantes sustancias
            tóxicas se deterioran, o son absorbidas, o
            se pierden por cualquier otra razón, con
            suficiente rapidez para influir considerablemente
            con los resultados del ensayo (FAO,
            1981).
      3. De flujo continuo: Circula continuamente una
         corriente de sustancia de prueba nueva en contacto con
         los individuos experimentales (Esclapés, 1999).
         Se realizan con la renovación continua o casi
         continua de las diluciones sometidas al ensayo, con el
         fin de mantener casi constantes las concentraciones de
         las sustancias tóxicas activas (FAO,
         1981).
   3. Bioensayos crónicos: Estiman la
      concentración efecto media (CE50), la
      cual es la concentración de la sustancia de prueba
      que causa un efecto al 50% de la población
      experimental, al cabo de un tiempo determinado; depende del
      estadío de vida considerado o del ciclo de
      vida del organismo empleado. Alternativamente, un
      ensayo definitivo puede utilizarse para estimar el
      tiempo requerido para producir un efecto al 50% de los
      organismos (TE50), a una concentración
      específica (Esclapés, 1999).
   4. Bioestimulación: Se mide la facultad de
      las aguas residuales o de las sustancias químicas de
      estimular la multiplicación y el desarrollo de
      algas, efecto este de eutroficación que
      frecuentemente se traduce en una superabundancia o
      proliferación de algas (FAO, 1981)
   5. Bioensayos de repelencia: Trata de medir en el
      laboratorio las reacciones de escapes de los animales
      acuáticos frente a un contaminante. Al organismo
      utilizado (generalmente pez o crustáceo de buen
      tamaño) se le ofrece la oportunidad de elegir entre
      aguas "contaminadas" y aguas "limpias" en un tubo o tanque
      pequeño; el gradiente de interfaz puede ser brusco.
      Los aparatos y procedimientos miden también, por lo
      general, cuando existe la atracción hacia el
      contaminante. Para las especies con motilidad el
      escapamiento puede ser a veces la respuesta subletal clave,
      de naturaleza
      más sensible y más significativa que el
      deterioro de la reproducción medido mediante ensayos
      de toxicidad crónicos. Sin embargo, es
      particularmente difícil predecir, a partir de estos
      resultados de laboratorio, lo que ocurriría en el
      medio. Las respuestas de escape pueden estar o no
      relacionadas con la toxicidad del contaminante, en algunos
      casos los organismos no pueden soportar determinadas
      concentraciones tóxicas o pueden ser atraídas
      por ellas (FAO, 1981).
   6. Bioacumulación: Son necesarios para las
      sustancias que se acumulan en las plantas
      y animales
      acuáticos; las grandes concentraciones de sustancias
      tóxicas en los tejidos
      pueden causar la muerte, pero el organismo es capaz de
      acumular durante algún tiempo cantidades menores sin
      sufrir daño. En este último caso, los
      depredadores pueden acumular las sustancias en grado tal
      que resulte nociva para ellos o para los depredadores del
      nivel trófico siguiente (FAO, 1981).
   1. Ensayos organolépticos: Algunos
      contaminantes pueden producir olores o sabores
      desagradables en los organismos acuáticos. El
      contaminante puede no ser nocivo para el organismo
      acuático, pero puede ocurrir que el organismo pierda
      valor económico. El mejor procedimiento consiste en la
      evaluación por parte de personas experimentadas en
      bromatología y emplear gran número de
      catadores diestros (FAO, 1981).
   2. Ensayos de bioestimulación: Los efectos de
      los nutrientes adicionales pueden ser indirectos, como por
      ejemplo, la producción de sustancias
      tóxicas o la desoxigenación del agua debida a
      la proliferación de algas (FAO, 1981).
3. Ensayos de respuesta indirecta:

Los bioensayos se pueden realizar en el laboratorio bajo
condiciones controladas o en el campo directamente en el medio
natural (Tortorelli y Hernández, 1995).
Los bioensayos de laboratorio pueden ser mono o
multiespecíficos. Los monoespecíficos son
diseñados para obtener información acerca de los
efectos de la calidad de agua sobre la supervivencia y aspectos
de la estructura y
dinámica de una población dada. Los
multiespecíficos pueden ofrecer información sobre
el impacto a nivel de una comunidad
determinada (Tortorelli y Hernández, 1995).
Los bioensayos de campo consisten en la exposición
de una o más poblaciones a la acción directa del
cuerpo de agua, para ello se utilizan contenedores que permiten
mantener la población en estudio en un espacio adecuado,
sin afectar su relación con el medio. Estos proponen,
principalmente, estudiar los efectos sobre comunidades o
poblaciones, sin prestar atención a los mecanismos de acción
de los contaminantes a nivel de los individuos en particular
(Tortorelli y Hernández, 1995).
En la Tabla 1 se comparan las ventajas y desventajas que
presentan las pruebas de toxicidad realizadas en el laboratorio y
en el medio natural.

(Del Valls y Conradi, 2000)

No existe un ensayo ni un organismo universal para
utilizarlo en todos los experimentos de
laboratorio, pero todos tienen su utilidad; sin
embargo, es esencial entender las limitaciones de estas pruebas
de toxicidad (Del Valls y Conradi, 2000).
La selección
del tipo de prueba a emplearse dependerá de los objetivos del
ensayo, la disponibilidad de los recursos, los
requerimientos de los organismos de prueba, las características de la sustancia a evaluar y
de los objetivos y alcances particulares del estudio
(Rodríguez y Esclapés, 1995).
Al elegir un ensayo de toxicidad se deben tener en cuenta los
siguientes elementos: los resultados deben ser relevantes a nivel
ecológico y estar relacionados con los sucesos ocurridos
en el ecosistema objeto de estudio; el ensayo y
las variables a estudiar deben ser suficientemente sensibles para
identificar el problema y distinguir entre los distintos puntos o
sitios considerados; las pruebas deben ser rápidas,
reproducibles y la respuesta del control
predecible; la metodología debe ser estándar; las
variables a medir en las pruebas deben responder de manera
similar a sustancias químicas parecidas (Del Valls y
Conradi, 2000).
Para generar información más completa acerca del
estudio toxicológico en el ambiente es la
determinación de parámetros
físico-químicos de calidad de agua, completados con
la realización de bioensayos de laboratorio o de campo.
Obteniendo una descripción de las condiciones del cuerpo
de agua y del impacto de las mismas sobre aspectos estructurales
y/o dinámicos de determinadas poblaciones (Tortorelli y
Hernández, 1995).
Es importante señalar que un resultado negativo en un
ensayo de toxicidad aguda con una muestra dada, no
garantiza la ausencia de toxicidad crónica.
Adicionalmente, debido a la variabilidad temporal potencial que
existe en la toxicidad de un desecho, un resultado negativo en
una muestra
particular, no excluye la posibilidad de que muestras colectadas
de la descarga en otro momento, puedan mostrar toxicidad aguda o
crónica. La frecuencia con que los ensayos de toxicidad se
deben realizar en estudios de efluentes, dependerá de la
variabilidad y grado de toxicidad del desecho, cronograma de
producción y cambios en los procesos
(Esclapés, 1999).
Cuando varias sustancias químicas se encuentran presentes
en un cuerpo de agua, la interacción toxicológica
entre estas sustancias puede invalidar los datos de toxicidad de
las sustancias aisladas. Además, la elaboración de
un inventario
completo de las sustancias químicas presentes y sus
concentraciones individuales puede resultar difícil o
imposible de realizar. Para estos casos, puede ser útil la
determinación de la toxicidad total de las descargas al
cuerpo de agua y también la del cuerpo de agua mismo. Esta
medición de toxicidad puede emplearse para
evaluar el significado de cada descarga en el cuerpo de agua
(Thomann, 1994).

Selección de Especies
Para obtener la máxima información de los
bioensayos es necesario escoger los organismos más
apropiados. Se debe tener en cuenta que requieren diferentes
períodos de aclimatación en el laboratorio,
según las especies, y es sumamente importante que los
organismos de ensayo se manipulen con cuidado, no sufran
daños, se encuentren sanos y sean de edad o tamaño
uniformes (FAO, 1981); en la Tabla 2 se mencionan los grupos de
organismos utilizados en bioensayos y su adaptabilidad al
laboratorio.
Según Henry (1988) la selección de organismos para
bioensayos debe basarse en:

• Los objetivos del programa
  toxicológico
• La información disponible sobre los posibles
  organismos
• Las características de las
  especies
• Las instalaciones y equipos de
  laboratorio
• El nivel de capacitación de los
  técnicos

Criterios generales de selección:

• ¿Existe suficiente información sobre la
  historia de
  vida del organismo? ¿Sobre las técnicas de
  cultivo? ¿Sobre los procedimientos
  de bioensayos? (Henry, 1988).

Los organismos acuáticos frecuentemente tienen
ciclos de vida y requerimientos de cultivo y de manejo complejos.
El desarrollo de esta información es una tarea larga que
frecuentemente requiere años de investigación. Es recomendable que se
consideren solo aquellos organismos de los que se tiene
suficiente información en cada una de estas

(Henry, 1988)

Tareas. Las especies con información limitada
sobre cultivo y procedimientos de prueba deben evitarse (Henry,
1988).

• ¿Es apropiado el ciclo de vida de los
  organismos a los objetivos y diseños? (Henry,
  1988).

El diseño
de los bioensayos tiene que ser cuidadosamente considerado en el
contexto del ciclo de vida del organismo. La mayoría de
los protocolos de
bioensayos agudos y crónicos requieren organismos
jóvenes o recién nacidos. Sin embargo, algunos
protocolos tales
como la prueba de crecimiento de ostras, se aplican a organismos
adultos. Asimismo, para pruebas crónicas que involucran
reproducción, el tiempo requerido para la
reproducción del organismo es un factor clave (Henry,
1988).

• ¿El bioensayo es
  para toxicidad en agua o en sedimentos? Para sedimentos,
  ¿es el objetivo
  determinar las sustancias tóxicas que se
  filtrarán hacia el agua superficial o las sustancias
  tóxicas que pueden acumularse en los organismos
  bénticos? (Henry, 1988).

Los sedimentos pueden servir como fuentes de
sustancias tóxicas para el agua superficial o para los
organismos bénticos que viven en los sedimentos. Las
sustancias tóxicas que se mueven desde los sedimentos
hacia el agua superficial pueden ser determinados preparando
lixiviados del sedimento para bioensayos. También pueden
ser de preocupación las sustancias tóxicas que
están estrechamente ligadas a los sedimentos y que pueden
ser bioconcentradas en organismos bentónicos,
particularmente cuando éstos son un componente importante
de una cadena
alimenticia que resulta en la exposición humana
(Henry, 1988).
Los bioensayos para determinar toxicidad en agua o de sedimentos
en contacto con agua se realizan en mejor forma con organismos
planctónicos o de libre natación.
Aún cuando el sedimento puede ser el material de prueba,
la toxicidad puede ser evaluada exponiendo los organismos
planctónicos a un lixiviado o a un extracto del sedimento
usando el agua superficial (Henry, 1988).
Si se sospecha la presencia de sustancias tóxicas
firmemente ligadas a los sedimentos, entonces deben usarse los
organismos bentónicos en contacto directo con los
sedimentos. Estas pruebas revelarán cualquier toxicidad de
los sedimentos y también el potencial de
bioacumulación de las sustancias tóxicas y su
transferencia a través de la cadena
alimenticia (Henry, 1988).
Características de un organismo óptimo para
bioensayos:

1. Representativo de ambientes tropicales, de amplia
   distribución en el país o de
   importancia comercial (Esclapés, 1999).
2. Disponibilidad, ser fáciles de encontrar, en
   número suficiente y colectarse sin dificultad. Se debe
   tomar en cuenta problemas
   con el transporte
   (FAO, 1981).
3. Con un tamaño suficientemente pequeño
   para poseer los necesarios por experiencia y que sean
   representativos para los estudios estadísticos (FAO,
   1981).
4. De fácil cultivo, lo que garantiza un adecuado
   suministro de organismos en los ensayos y el establecimiento
   con exactitud de la edad o estado de
   desarrollo. La edad es de suma importancia en los bioensayos,
   ya que la sensibilidad puede variar significativamente durante
   su desarrollo (Esclapés, 1999).
5. Especies con gran susceptibilidad a exposiciones con
   sustancias xenobióticas. Garantizando cubrir el peor de
   los escenarios, y proporcionando resultados que ofrecen una
   alta protección al resto de la cadena trófica
   (Esclapés, 1999).

El uso de más de una especie permitirá una
determinación más cuidadosa de toxicidad porque los
organismos acuáticos varían en su respuesta a las
sustancias tóxicas. Por ejemplo, los peces pueden
ser más sensibles que los invertebrados a una sustancia
química, mientras que puede suceder lo contrario con otra
sustancia química (Henry, 1988).

Organismos criados en el laboratorio para bioensayos
Ventajas: Disponibilidad en forma inmediata de organismos
aclimatados, saludables, que han sido criados bajo las mismas
condiciones (Henry, 1988). Los organismos cultivados minimizan la
variabilidad genética
que supondría traer individuos capturados en diferentes
localidades geográficas (Esclapés, 1999).
La respuesta de los organismos para bioensayos a la sustancia
tóxica está influenciada por factores tales como su
edad (los animales jóvenes son usualmente más
sensibles), dieta (los animales bien alimentados brindan
respuestas más consistentes), estrés
(los organismos alterados son más sensibles) y condiciones
físicas como temperatura,
luz y el nivel
de oxígeno disuelto en el agua (Henry, 1988).
Los organismos para bioensayos cultivados en laboratorio
representan una fuente predecible de organismos de prueba de una
edad conocida. El uso de condiciones estándares de
laboratorio y de alimentación
asegurará que todos los organismos de prueba
responderán a las sustancias tóxicas en forma
similar con el paso del tiempo. Es una característica
importante cuando se comparan los resultados de diferentes
laboratorios (Henry, 1988).
Desventajas: Muchos organismos con ciclo complejo de vida o
información insuficiente sobre su cultivo no pueden ser
cultivados en el laboratorio. Por lo tanto, la variedad de
organismos está limitada cuando se usan los que han sido
cultivados en el laboratorio. Los requerimientos de cultivo para
organismos acuáticos varían sustancialmente,
aún entre especies estrechamente relacionadas. Es
necesario conocer el alimento óptimo, la temperatura,
el ciclo de luz y el agua a fin de mantener cultivos continuos en
el laboratorio. Aunque muchas algas, invertebrados y especies de
peces se han
usado como organismos para bioensayos, sólo existe
información disponible sobre algunas especies, que
permiten un cultivo satisfactorio de laboratorio (Henry,
1988).
Falta de representatividad a las condiciones y organismos en la
comunidad a
ser probada. El aspecto negativo de los organismos
estándares criados en el laboratorio es que ellos no son
necesariamente representativos de la comunidad acuática o
de las condiciones de salud de los organismos de cada lugar. Por
lo tanto, si el objetivo es estudiar un efluente
específico o la descarga a un río o lago, entonces
deben considerarse los organismos recolectados en el campo como
una alternativa (Henry, 1988).

Organismos recolectados en el campo para bioensayos
Según Henry (1988), existen circunstancias en las que los
organismos recolectados en el campo son apropiados. Las
siguientes son algunas preguntas que necesitan hacerse antes de
decidir usar los organismos recolectados directamente del
medio.

• ¿Puede recolectarse el organismo directamente
  del campo? ¿Esto ocurre en poblaciones grandes,
  monoespecíficas?
• ¿Están los organismos disponibles
  durante todo el año o sólo durante ciertas
  estaciones?
• ¿Es el organismo sensible al manejo durante su
  recolección y transporte
  al laboratorio?
• ¿Se adaptará el organismo al agua del
  laboratorio o se necesita un abastecimiento de agua fresca
  diariamente desde el campo?

Ventajas: Representativo de la comunidad impactada por
el efluente. Se puede seleccionar una especie importante en una
comunidad específica (Henry, 1988).
Las pruebas de microcosmos conteniendo muchas especies pueden
prepararse fácilmente. Se pueden desarrollar
exámenes con varias especies en la misma cámara de
prueba. Los organismos que son compatibles, tales como caracoles,
almeja, peces y plantas
acuáticas pueden incluirse en la misma cámara de
prueba, permitiendo un estudio simultáneo de efectos
múltiples (Henry, 1988).
Los bioensayos hechos en el laboratorio utilizando organismos
recolectados en el campo han sido menos satisfactorios, con muy
pocas excepciones. Los organismos recolectados en el campo son
más satisfactorios cuando el laboratorio está cerca
al lugar de recolección y el abastecimiento de agua desde
allí está siempre disponible (Henry, 1988).
Desventajas: El estrés y la mortalidad frecuentemente
están asociadas con los procedimientos de
recolección y transferencia. Muchos organismos pueden
morir antes o durante la prueba y otros pueden ser inusualmente
sensibles a sustancias tóxicas como resultado de la
presión
asociada con los procedimientos de recolección y
transferencia. Las muertes en los controles pueden invalidar la
prueba (Henry, 1988).
La disponibilidad de los organismos puede estar limitada. Muchas
especies no abundan durante todo el año o tienen varios
cambios en su ciclo de vida (Henry, 1988).
La edad, salud y condiciones de cultivo de los organismos son
desconocidas. No existe manera de obtener organismos
"estandarizados" del campo y frecuentemente hasta la edad es
desconocida (Henry, 1988).
Los invertebrados son un grupo mucho más diverso que las
algas o los peces, con diferencias dramáticas en su forma
física,
sus características históricas de vida y sus
requisitos de cultivo (Henry, 1988).
Es conveniente el uso del plancton en los bioensayos debido a su
pequeño tamaño y porque con ellos es posible
realizar muchos ensayos en espacios reducidos. Su ciclo vital es
muy corto y se conocen sus necesidades nutricionales. Son buenos
para los estudios de bioacumulación, puesto que se ubican
en el nivel más bajo de la pirámide trófica
(FAO, 1981).

Uso de los cladóceros en los bioensayos
Los cladóceros (Figura 1), están dentro de los
organismos más utilizados para bioensayos y son el grupo
recomendado en el informe de Henry
(1988) para representar a los invertebrados.
Ventajas: Corto ciclo reproductivo. Los cladóceros son
organismos partenogenéticos, es decir, tienen la habilidad
de reproducirse sin machos (Figura 2). Esta habilidad simplifica
significativamente su uso como organismos para bioensayos porque
su período de reproducción es corto y simple
(Henry, 1988).

Figura 1.- Vista general de cladóceros, Daphnia
pulex.
Fuente: Enciclopedia Microsoft
Encarta 2001.

Figura 2.-
Reproducción partenogenética, hembra Daphnia sp.
con huevos partenogenéticos.
Fuente: http://www.udec.cl/bioensayos/recursos_biologicos.html

Representante de un eslabón intermedio importante
en la cadena alimenticia. El zooplancton, especialmente los
"predadores" tales como dáfnidos que se alimentan de
algas, es un eslabón importante entre los productores
primarios y los peces. Las comunidades acuáticas pueden
sufrir un daño significativo por sustancias
tóxicas, tales como sulfato de cobre, que son
más tóxicas para el zooplancton que para los peces
(Henry, 1988).
Alta sensibilidad a sustancias tóxicas en el agua. En
general, se ha encontrado que los cladóceros son
más sensibles que los peces a las sustancias
tóxicas (Henry, 1988). Presentan sistema nervioso,
lo cual sugiere la presencia de la acetilcolina (Ach), este
neurotrasmisor normalmente es hidrolizado por la AChA, la cual es
muy sensible a diferentes contaminantes, entre los que se pueden
mencionar los metales pesados, detergentes e hidrocarburos
policíclicos (Martnez-Tabche et al., 1997). Es capaz de
detectar la presencia de, por ejemplo, 0,005 mg. del peligroso
mercurio en el agua, y aún menores concentraciones de
numerosos pesticidas y residuos industriales (Paggi y de Paggi,
2000).
Información extensa sobre técnicas de cultivo. Los
dáfnidos, tales como Daphnia magna (Figura 3),
Ceriodaphnia sp., han sido usados ampliamente para pruebas de
bioensayos y existe considerable información sobre las
técnicas de cultivo y la sensibilidad a las sustancias
tóxicas. Los requisitos de temperatura, luz y nutrientes
están bien definidos (Henry, 1988).

Figura 3.- Vista general de Dahpnia magna.
Fuente: http:
www.sacsplash.org/critters/
daphnia.htm

Las técnicas de cultivo son relativamente
simples. Como con las algas, la necesidad de capacitación en las técnicas de
cultivo es relativamente poca, y puede aprenderse frecuentemente
de manuales y
otra literatura,
aunque la capacitación "práctica" por un
técnico experimentado es siempre preferible (Henry,
1988).
Los requerimientos de cultivo no son prohibitivos. El zooplancton
es pequeño y requiere de poca agua comparado con los
peces. Los refrigeradores de temperatura regulada tales como los
usados para análisis de demanda
bioquímica
de oxígeno (DBO) pueden usarse para su cultivo y prueba
(Henry, 1988).
Pruebas de toxicidad crónica o de ciclo de vida pueden
hacerse en 1 a 3 semanas. El ciclo de vida de los invertebrados
es relativamente corto y se puede monitorear su
reproducción dentro de un período corto. Aunque el
tiempo para un estudio crónico de invertebrados es mayor
que para algas, es considerablemente menor que para peces (Henry,
1988).
Se puede usar para pruebas de suelo y sedimento
así como para pruebas de agua. Los cladóceros son
de libre natación y, por lo tanto, son más
apropiados para examinar agua y no sedimentos. Sin embargo, los
dáfnidos también han sido usados satisfactoriamente
con lixiviados de suelos y
sedimentos. La toxicidad del lixiviado se usa entonces para
reflejar la toxicidad del suelo o del sedimento (Henry,
1988).
Desventajas: Los cladóceros son los organismos preferidos
y tienen pocas desventajas comparados con otros organismos
(Henry, 1988).

Preparación del material de vidrio
Según Rodríguez y Esclapés (1995), toda la
vidriería que se utilice en los ensayos y en contacto con
los efluentes debe lavarse como sigue:

• Lavar con agua caliente y solución
  jabonosa
• Enjuagar tres veces con agua de chorro
• Enjuagar tres veces con solución de
  ácido clorhídrico (HCl) al 10%
• Enjuagar una vez con agua de chorro
• Enjuagar tres veces con acetona
• Enjuagar tres veces con agua desionizada.
• Una vez lavado el material, se debe colocar a secar,
  boca abajo, sobre material absorbente.

Preparación de las soluciones de
exposición
En la preparación de soluciones de exposición a
partir de efluentes o compuestos puros se debe emplear
vidriería volumétrica. En el caso de compuestos
puros se prepara una solución madre. Las soluciones de
exposiciones deben preparar en secuencia comenzando con la
más diluida (Rodríguez y Esclapés,
1995).
Mediciones iniciales de oxígeno disuelto (OD), temperatura
y pH se deben
tomar en una de las réplicas del control y para cada una
de las concentraciones. La conductividad se debe tomar en el
control y en cada concentración. El objetivo principal de
esta medida es asegurar que las soluciones de exposición
se prepararon correctamente (Rodríguez y Esclapés,
1995).
Todos los reactivos deben tener calidad American Chemical Society
(A.C.S.) o al menos un 99% de pureza. Se recomienda la
preparación de soluciones madres de 1000 mg/l (Centro
Internacional de Investigaciones
para el Desarrollo, 1998).
En los bioensayos con cladóceros las diluciones se
realizan con agua sintética dura o moderadamente dura,
dependiendo de cual es la especie utilizada (Esclapés,
1999; C.I.I.D., 1998).
Un mínimo de 200 ml de muestra se debe recolectar en
envases limpios de polietileno o vidrio, en el
control y en la concentración más alta, para la
determinación de alcalinidad total, conductividad y
dureza. Estas determinaciones se deben realizar siguiendo
metodología estandarizada (Rodríguez
y Esclapés, 1995).

Ensayos preliminares
Estos ensayos se utilizan para determinar en forma preliminar, la
toxicidad de una sustancia o de los efluentes. Los tratamientos
son dos y consisten de un control (se usa agua de la localidad o
agua de laboratorio preparada para el cultivo) y efluente sin
diluir (100 %). El número de réplicas, densidad de los
organismos y procedimientos generales son los mismos empleados en
el ensayo
definitivo para la especie en cuestión. A excepción
de los ensayos con microalgas, la duración de las pruebas
preliminares, generalmente es la mitad de la duración de
las definitivas. La determinación de oxígeno
disuelto, temperatura, alcalinidad, dureza total y conductividad
específica se realizan como en el ensayo definitivo
(Rodríguez y Esclapés, 1995).
Estos ensayos están diseñados para proveer un
estimado preliminar de las concentraciones, cuando se desconoce
la toxicidad de la muestra a evaluar. Se preparan de cinco a diez
diluciones de exposición. En este tipo de ensayo, es
suficiente que las concentraciones de las soluciones de
exposición sean aproximadas, por lo que se pueden utilizar
cilindros graduados para su preparación. Este ensayo
permite definir el orden de magnitud del intervalo de las
concentraciones entre las cuales se debe realizar el ensayo
definitivo (Rodríguez y Esclapés, 1995).

Ensayo definitivo
Es un experimento en el cual un grupo de organismos se exponen
durante un período de tiempo determinado a una serie de
concentraciones de un efluente o un compuesto de interés
(Esclapés, 1999).
Las soluciones de preparación en un ensayo definitivo son
aquellas que contiene una cantidad predeterminada de efluente o
compuesto puro, a las cuales se exponen los organismos. Las
soluciones de exposición se preparan diluyendo la muestra
a evaluar con el agua de dilución apropiada hasta alcanzar
las siguientes concentraciones de exposición: (6,25; 12,5;
25; 50 y 100) %. Si se sospecha que el efluente es altamente
tóxico o si ocurre una mortalidad significativa en la
dilución de 6,25 % durante las primeras horas de prueba,
entonces se deben incluir menores concentraciones del
tóxico (Esclapés, 1999).
En el caso de compuestos puros, el intervalo apropiado de
concentraciones se elige en base a un ensayo previo de
búsqueda de intervalo de concentraciones. Las
concentraciones en este intervalo deben estar separadas entre
sí en un orden de magnitud, aproximadamente
(Rodríguez y Esclapés, 1995).
Se deben consultar protocolos específicos en
relación a recipientes o envases de exposición,
volúmenes, densidad de
individuos, réplicas, duración y condiciones del
ensayo, mediciones rutinarias y otros detalles (Rodríguez
y Esclapés, 1995).
La sobrevivencia de los organismos se registra a los 15 min, 30
min, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 24 h, y luego cada 24 h
(Esclapés, 1999).

Mantenimiento diario del ensayo
Para bioensayos estáticos sin renovación se debe
realizar el contaje de organismos vivos en cada réplica de
las exposiciones respectivas, medidas de oxígeno disuelto
(OD) y temperatura en una réplica del control y de las
concentraciones; los organismos muertos se descartan. En ensayos
estáticos con renovación o recambio, se mide
oxígeno disuelto (OD), temperatura y pH en una
réplica del control y de todas las exposiciones, antes y
después de la renovación. La conductividad se mide
en todas las exposiciones. Se deben tomar muestras del control y
de las soluciones de exposición más altas, cada vez
que se realice renovación de las soluciones, para
determinar dureza total, alcalinidad total y conductividad
(Rodríguez y Esclapés, 1995).
Si el oxígeno disuelto disminuye por debajo del 40 % de
saturación en la solución de exposición, se
debe suministrar aireación. Las burbujas de aire se pueden
suministrar a las soluciones a través de una pipeta de
vidrio empleando
una bomba de aire de acuario. La velocidad de
burbujeo debe ser mínima, aproximadamente 100
burbujas/minuto son suficientes para mantener niveles de
oxígeno disuelto satisfactorio. La aireación de las
soluciones de exposición debe ser reportada
(Rodríguez y Esclapés, 1995).

Finalización del ensayo
Al final de la prueba, se realizan mediciones de oxígeno
disuelto, temperatura y pH en una réplica del control y de
las concentraciones. Muestras del control y concentraciones baja
y alta, se recolectan en botellas de vidrio o polietileno para
determinar alcalinidad total, dureza total y conductividad
(Rodríguez y Esclapés, 1995).

Análisis de datos provenientes de bioensayos
agudos
La mediana o cuantil 50% es el principal estadístico
utilizado en pruebas de toxicidad aguda, la cual es representada
como la concentración letal media (CL50). La
escogencia de este se debe a que suele estar asociado a una menor
varianza que la proporcionada por cualquier otro cuantil (Gelber
et al., 1985).
El programa de
Stephan (1977) realiza el cálculo
directo de dicho estadístico mediante cuatro diferentes
métodos y proporciona, además, un estimado de los
límites de confianza al 95 % (excepto para el método
binomial, el cual indica los correspondientes valores
utilizados en la interpolación). Los métodos
utilizados por el programa son los siguientes: Moving Average,
Probit, Logit y Binomial (Rodríguez y Esclapés,
1995).
El método
Moving Average se basa en una interpolación
numérica de las concentraciones utilizadas y los
resultados de mortandad obtenidos para cada concentración.
El método también genera un estimado
CL50 y sus correspondientes límites de
confianza al 95 %. Debido a que su cálculo se
genera por interpolación, se dificulta mucho lograr
estimados de otros cuantiles con precisión, puesto que la
variabilidad en torno a la
mediana pierde simetría, por lo que solo se puede utilizar
para estimar el cuantil 50 % (Rodríguez y Esclapés,
1995).
El método Probit, es un método paramétrico
basado en una transformación probit de los datos
según la ecuación:
P = @ (A + B) (1)
Donde:
P = probabilidad de
muerte de los organismos expuestos a la concentración
X
@ = distribución normal estándar
A Y B = parámetros desconocidos definidos por la
relación "concentración-mortandad"

La transformación probit resulta en un ajuste que
logra normalizar los datos, generando una curva sigmoidal que al
ser sometida a una transformación logarítmica,
logra una linealización de la misma (Rodríguez y
Esclapés, 1995).
El método Logit o Logístico, al igual que el
Probit, corresponde a un modelo
paramétrico que resulta en una función
sigmoidal. El programa de Stephan (1977) proporciona resultados
correspondientes a la CL50, limites de confianza al 95
% y además, indica la ecuación de regresión,
producto de un
análisis de mínimos cuadrados aplicados a los datos
transformados por una función logarítmica. Como
todo método paramétrico, existen una serie de
restricciones (principalmente normalidad), que dificultan su
aplicación en numerosas distribuciones de datos
(Rodríguez y Esclapés, 1995).
El método Binomial es aplicable a distribuciones de datos
cuyo ajuste es un modelo binomial. Dichas distribuciones, en
ensayos de toxicidad, se producen cuando no existen mortandades
parciales, sino una serie de concentraciones bajas con un 0 % de
mortandad y en el resto de las concentraciones más altas,
una mortandad total 100 %. La CL50 resultante, viene
siendo la media aritmética entre la máxima
concentración que produzca 0 % de mortandad y la
mínima concentración que logra una mortandad del
100 %. En estos casos de "todo o nada", los modelos
anteriores no pueden ser utilizados, pues los datos dejan de
ajustarse a los requisitos de los mismos. Ello hace que este
método, a pesar de ser de gran imprecisión en la
mayoría de los casos, sea de una enorme utilidad, puesto
que muchas sustancia tóxicas (como en el caso de ciertos
pesticidas), poseen límites umbrales muy irregulares, lo
cual hace prácticamente imposible el logro de mortandades
parciales (Rodríguez y Esclapés, 1995).
La ventaja de un programa como el de Stephan (1977), en el cual
se incorporan varios métodos de cálculo de
CL50, radica en tener disponibles varias opciones que
permitirán escoger la que mejor se ajuste a la
distribución de datos obtenidos de un bioensayo en
particular. Esto reduce considerablemente el tedioso proceso de
repetir N veces el bioensayo hasta lograr el ajuste deseado
(Rodríguez y Esclapés, 1995).
Existen otros métodos para el cálculo de la
CL50 resultante. El más popular de ellos es el
método gráfico de Litchfield y Wilcoxon (1949),
utilizado en aquellos casos en donde se carezca de apoyo
computacional. También se puede nombrar el método
no-paramétrico de Spearman-Kraber (S-K), el cual ofrece
razonable precisión sin que los datos estén sujetos
a restricciones de modelo, logrando obtener un valor de
CL50 cuando al menos existe una concentración
por encima de una mortalidad del 50 % y otra por debajo
(Rodríguez y Esclapés, 1995).