5. Aislamiento de Campylobacter fetus
- Medios de cultivo para el aislamiento
Actualmente se utilizan numerosos medios para el
diagnóstico bacteriológico de la
campilobacteriosis genital bovina (3). Siguen algunos
ejemplos:
• Medio de Skirrow (medio básico 1)
Se disuelven 40 g de medio básico de agar sangre nº 2
(Oxoid) en 1 litro de agua destilada
hirviendo y se distribuye la dilución caliente en botellas
previamente esterilizadas en el autoclave (121°C durante 14
minutos). Tras dejar enfriar a 55°C, se añade, en
condiciones estériles: sangre de caballo hemolizada (50
ml) y dos frascos de factor de crecimiento (mezcla de Skirrow)
(22).
• Agar de corazón–cerebro (medio
básico 2)
Se diluyen en 1 litro de agua destilada: infusión de
cerebro de ternero (200 g), infusión de corazón de
buey (250 g), peptona proteosa (10 g), glucosa (2 g), cloruro de
sodio (5 g), hidrogenofosfato disódico anhidro (2,5 g),
medio de tiol (3 g) y agar (20 g). Se esteriliza la
solución por autoclavado a 121°C durante 15
minutos.
Es posible preparar este medio al instante o con
antelación, en cuyo caso puede conservarse a 4°C
durante aproximadamente 15 días.
• Agar de corazón-cerebro con sangre
Este medio contiene medio básico 2 (enfriado hasta
63°C tras la esterilización o bien, si se parte del
medio frío, calentado durante 30 minutos en el baño
maría), más sangre de oveja calentada a 63°C
durante 3 minutos (7-10 % en volumen).
• Medio selectivo
Este medio consta de: medio básico 1 ó 2 (100 ml)
llevado a 63°C como se ha indicado anteriormente; sangre de
oveja (7-10% en volumen); y una de las dos mezclas
siguientes:
SEA mezcla inhibidora nº 1, que contiene (concentraciones
finales): bacitracina (15 UI/ml), novobiocina (50 µg/ml),
sulfato de polimixina B (1 UI/ml) y cicloheximida (20
µg/ml).
SEA mezcla inhibidora nº 2, que contiene (concentraciones
finales): vancomicina (20 µg/ml), trimetoprima (10
µg/ml), sulfato de polimixina B (5 UI/ml) y cicloheximida
(100 µg/ml).
Antes de su adición al medio de cultivo, las soluciones de
antibióticos deben ser esterilizadas por
filtración.
• Medio selectivo de Clark
Este medio consta de peptona (10 g), cloruro de sodio (5 g),
extracto de carne (5 g) y agar (15 g). Se disuelven estos
ingredientes, excepto el agar, en 1 litro de agua destilada (con
agitación en caso necesario). Se ajusta el pH a 7.4-7.6,
hecho lo cual se añade el agar y se lleva la mezcla a
ebullición. Se esteriliza por autoclavado (121°C
durante 15 minutos). Una vez enfriada la solución a
55°C, se añaden a ésta: en primer lugar un 10%
de sangre bovina u ovina desfibrinizada y estéril, y
después bacitracina (15 UI/ml), sulfato de polimixina B (1
UI/ml), novobiocina (sal sódica) (5 µg/ml) y
cicloheximida (10 µg/ml).
- Siembra del medio e incubación.
Se siembra cada muestra, bien
directamente o bien previo paso a través de un filtro con
un diámetro de poro de 0,65 µm, en una o dos placas
de medio básico y una o dos placas de medio selectivo. A
continuación se extiende el material con el asa
metálica para facilitar el aislamiento de colonias
individuales.
Se incuban las placas a 37±1°C en una atmósfera con un 5%
de O2, un 8% de CO2 y un 87% de N2 durante 5-7 días. El
empleo de una
estufa de triple gas con humedad
controlada (mínimo 70%) ofrece las condiciones
óptimas de cultivo. Cuando no se dispone de ella, es
posible utilizar en su lugar un frasco o recipiente similar,
introduciendo en él, en condiciones de vacío de 56
mmHg, una mezcla de 10% de CO2 y 90% de N2 hasta obtener una
presión
máxima de 0,2 bar. Se recomienda, cuando ello sea posible,
esterilizar los gases
introducidos en la estufa por filtración a través
de membrana.
Debe practicarse una comprobación sistemática de
las condiciones de cultivo e incubación, mediante la
siembra de dos cepas control. Dichos
controles deberían ser establecidos para cada uno de los
procesos de
aislamiento. Sin embargo, es innecesario disponer más de
un control por día, salvo si los lotes de medio utilizados
son diferentes, en cuyo caso cada lote deberá llevar
asociado su propio control.
- Lectura de los resultados
Las colonias de C. fetus suelen aparecer en los medios
recomendados al cabo de 2-5 días. El crecimiento puede ser
lento, especialmente en presencia de bacterias
contaminantes en las muestras. Transcurridos de 3 a 5 días
de incubación, las colonias suelen medir entre 1 y 3 mm de
diámetro. Son ligeramente rosadas, de forma circular,
convexas, lisas y brillantes, y presentan un reborde
regular.
Pruebas de identificación
Para realizar una prueba de identificación correcta es
preciso disponer de un cultivo puro. No obstante, y en el
supuesto de que existan muchas colonias sospechosas correctamente
aisladas, será posible realizar las pruebas
directamente sobre las colonias retiradas de las placas de
aislamiento. En tal caso, y tras inocular de nuevo las colonias
sospechosas a fin de obtener un cultivo puro, deberá
repetirse la prueba.
Las pruebas de identificación se basan en los siguientes
criterios: aspecto y motilidad, en el caso de organismos vivos;
tinción Gram; prueba de la oxidasa; y prueba de la
catalasa. Se recomienda utilizar un microscopio de
contraste de fases para la observación de las colonias vivas.
C. fetus toma a menudo la forma de un bacilo curvo y fino, de
0,3-0,4 µm de anchura y 0,5-8,0 µm de longitud. No
obstante, es posible observar simultáneamente formas
cortas (con apariencia de coma), formas de tamaño medio
(en forma de ’S’) y formas largas (helicoidales con
presencia de espirales). Las bacterias se hallan invariablemente
separadas unas de otras.
C. fetus es móvil. Presenta una motilidad típica de
tipo anfítrico polar, que desaparece frecuentemente en los
subcultivos.
Pruebas de confirmación
Estas pruebas (véase Tabla 1) deben ser realizadas sobre
cultivos puros, con empleo, siempre que ello sea posible, de una
suspensión estandarizada con un grado de turbidez inferior
o equivalente a un McFarland nº 1.
- Prueba de requerimientos respiratorios
Toda cepa sospechosa debe ser sometida a esta prueba.
Para su realización, se prepara una suspensión en
una solución tampón, pH 7.2, que se inocula en tres
placas de cultivo. Estas son después incubadas en
atmósfera normal, o en una atmósfera con un 7 a 10%
de CO2 o en una atmósfera que contenga la mezcla triple de
gases anteriormente descrita. Se incluyen asimismo en la prueba
dos cepas control.
La prueba resulta positiva si se produce crecimiento bacteriano
en alguna de las dos (o en ambas) atmósferas provistas de
una mezcla gaseosa especial, y si además no hay
crecimiento en la atmósfera ordinaria. No obstante, debe
tenerse en cuenta que algunas cepas pueden dar lugar a un cultivo
muy disperso en atmósfera normal. El crecimiento de C.
fetus subespecie venerealis es dependiente de la triple mezcla
gaseosa CO2-O2-N2, mientras que el de la subespecie fetus es
dependiente de CO2.
Tabla 1. Características diferenciales del género
Campylobacter.
Requerimientos respiratorios Metabolismo
respiratorio Prueba de crecimiento
CO2-O2-
N2 CO2 Oxidasa Catalasa H2S(e) 25°C 42°C Glicina 1% NaCl
3.5%
C. fetus subsp venerealis +(a) (+) 0(b)(+) + + – + – – –
C. fetus subsp fetus – (+) +(c)(+) + + – + – + –
C. jejuni – (+) -(d)(+) + + – – + + –
C. faecalis – (+) – (+) + + ++ – + + ±
C. sputorum subsp bubulus – (+) – (+) + – ++ ± – + +
+(a) = Requiere la mezcla gaseosa; – = Ningún
requerimiento; 0(b) = El requerimiento de CO2 no es estricto; (c)
Crecimiento difícil para algunas cepas; (d) = El
crecimiento de algunas cepas mejora en presencia de CO2; (e) = En
medio de agar con triple azúcar
y hierro; () =
Crecimiento (+)o ausencia de crecimiento (-)de la cepa en un
medio apropiado, en las condiciones que se
especifican.
- Prueba de crecimiento en presencia de
glicina
Toda cepa sospechosa debe ser sometida a esta prueba.
Para ello debe prepararse una suspensión en
solución tampón, pH 7.2. Se inocula dicha
suspensión en un medio con glicina (15 ml de medio de
sangre + exactamente 1,65 ml de solución acuosa de glicina
al 10%) y en un medio de sangre básico. Se incuban los
cultivos en las condiciones de atmósfera especificadas e
incluyendo en paralelo dos cepas control (de las subespecies
venerealis y fetus). Dado que todas las cepas son exigentes, la
introducción de cualquier cambio en los
medios, por pequeño que sea, puede condicionar el
crecimiento. La falta de crecimiento en el medio con glicina debe
ser considerada un indicio presuntivo de la presencia de C. fetus
subespecie venerealis.
- Prueba de crecimiento en presencia de cloruro de
sodio
Se prepara una suspensión de la cepa sospechosa
en solución tampón, pH 7.2. Después se
inocula dicha suspensión en un medio de sangre provisto de
un 3,5% de NaCl (15 ml de medio de sangre + 2,04 ml de NaCl 5 M)
y en un medio de sangre. Se incuban los cultivos en las
condiciones de amósfera especificadas. La prueba debe
incluir asimismo dos cepas control.
- Prueba de producción de sulfuro de
hidrógeno
La prueba del sulfuro de hidrógeno (H2S) se
efectúa en un medio de agar con triple azúcar y
hierro (triple sugar iron, TSI) cuya composición es la
siguiente: peptona (20 g/litro), extracto de carne (2,5 g/litro),
extracto de levadura (3 g/litro), cloruro de sodio (5 g/litro),
citrato férrico (0,5 g/litro), tiosulfato de sodio
(Na2S2O3) (0,5 g/litro), lactosa (10 g/litro), sucrosa (10
g/litro), glucosa (1 g/litro), rojo de fenol (0,024 g/litro),
agar (11 g/litro) y agua destilada (con la que se ajusta a 1
litro). Previa mezcla, y tras repartir el medio en tubos, se
esterilizan éstos por autoclavado a 115°C durante 15
minutos. Es posible preparar el medio en el momento de su
utilización o con antelación, en cuyo caso puede
ser conservado en las condiciones habituales durante
aproximadamente 3 semanas.
Antes de su empleo, deberá fundirse el medio en un
baño maría hirviendo e inclinar los tubos, de tal
manera que se obtenga una pendiente con 3 cm de profundidad. Este
medio, listo para usar, podrá ser conservado en las
condiciones habituales durante 8-10 días antes de su
utilización.
- Prueba de sensibilidad al trifeniltetrazolio, a la
cefalotina y al ácido nalidíxico.
Para medir la sensibilidad al trifeniltetrazolio (TTC),
a la cefalotina (CN) y al ácido nalidíxico (NA) se
emplea la técnica del disco (23). Esta técnica
consiste en empapar discos de papel de
filtro en soluciones de TTC (30 mg/ml), CN (3 mg/ml) y NA (3
mg/ml), de tal manera que el contenido final de los discos sea
respectivamente de 200 µg de TTC, 30 µg de CN y 30
µg de NA. A continuación se secan y almacenan los
discos hasta el momento de su utilización.
Para llevar a cabo la prueba se realiza una suspensión en
PBS, pH 7.2, de células
procedentes de cultivos de 72 horas de las cepas a examinar, a
una concentración de 109 bacterias/ml. A
continuación se toman volúmenes de 100 µl de
dicha suspensión y se reparten éstos
homogéneamente sobre un medio de sangre básico.
Tras secado de las placas se deposita el medio de cultivo sobre
su superficie y, por último, los discos de sensibilidad
sobre éste. Se incuban después los cultivos a
37°C en una atmósfera apropiada. Los cultivos
deberán ser examinados al cabo de sendos periodos de 48 y
96 horas. La presencia de una zona de inhibición de por lo
menos 3 mm alrededor del disco indica sensibilidad de la cepa en
cuestión al antibiótico. C. fetus subespecie
venerealis, venerealis intermedius y fetus son sensibles al TTC y
a la CN.
Para una correcta identificación bacteriológica
deben cumplirse los siguientes requisitos: ausencia de contaminación en las placas de cultivo;
crecimiento satisfactorio de las cepas control desde el segundo
día de incubación hasta el momento de la
observación; obtención de resultados similares a
los esperados en las pruebas realizadas sobre las cepas
control.
Un resultado negativo no será concluyente hasta
transcurridos por lo menos 6 días de incubación en
las condiciones requeridas.
Se considerará perteneciente a la especie C.
fetus cualquier bacteria que presente las siguientes
características:
• Aspecto característico de las colonias sobre los
medios de cultivo descritos anteriormente;
• ausencia de crecimiento detectable a simple vista al cabo
de 24 horas;
• crecimiento lento (2-3 días) a 37±1°C en
atmósfera especial (a una tensión de oxígeno
reducida);
• morfología
característica de una bacteria espiral;
• motilidad de tipo anfítrico;
• Gram negativa;
• oxidasa positiva;
• catalasa positiva;
• requerimientos respiratorios y propiedades
bioquímicas característicos.
Inmunofluorescencia
Esta prueba puede ser utilizada para identificar el organismo
mediante la técnica directa o para confirmar la
identificación de una cepa después de su
aislamiento. No permite, en cambio, discriminar entre diferentes
subespecies (22).
- Preparación de los sueros inmunes
Es preferible emplear cepas estándar de
Campylobacter, procedentes de colecciones de cultivos reconocidas
(C. fetus subespecie venerealis biotipo venerealis, C. fetus
subespecie venerealis biotipo intermedius o C. fetus subespecie
fetus). Se cultivan dichas cepas por separado, en
atmósfera microaeróbica y en un medio de agar
sangre, a 37°C durante 3 días. Pasado este tiempo, se
recogen los microorganismos en PBS, pH 7.2, y se lavan dos veces
por centrifugación. Después se inoculan conejos de
3 meses, por vía intramuscular, con 2 ml de una
solución de 1011 bacterias/ml de una subespecie de C.
fetus, previamente resuspendida en PBS más adyuvante
incompleto de Freund. La inoculación se practica en cuatro
sitios distintos, a razón de 0,5 ml por punto de
inyección. Los animales deben
ser sangrados antes de la inoculación, y a intervalos
semanales después de la misma. Cuando los títulos
séricos alcanzan valores
elevados, estimados mediante la prueba de inmunofluorescencia o
la de aglutinación, se inyectan a los conejos por
vía intravenosa entre 0,1 y 1 ml de organismos viables (a
razón de 1010 organismos/ml). 7 días más
tarde se sangra a los conejos y se mezclan todos los sueros
homólogos.
- Preparación de conjugados
La fracción de IgG se aísla por
precipitación con sulfato sódico. Para ello, se
ajusta el pH del suero a 8.0 con PBS 0,1 M, y se añaden 18
g de sulfato sódico anhidro por cada 100 ml. Se recoge el
precipitado por centrifugación, y se resuspende en agua
destilada hasta su volumen original. Después se precipita
de nuevo, por adición de 12 g de sulfato sódico/100
ml. Se recoge el precipitado, se redisuelve en agua destilada,
esta vez hasta la mitad del volumen original, y se dializa a
4°C frente a PBS, pH 7.2, hasta que todo el sulfato
sódico haya sido eliminado. Hecho esto, se determina el
contenido proteico y se ajusta la concentración de la
solución para que contenga 1,0-1,5 g de proteína
(albúmina sérica bovina) por 100 ml de PBS. Se
ajusta el pH de esta solución a 9.0 con carbonato
sódico 1 M. A continuación se añade el
isómero 1 del isotiocianato de fluoresceína
(fluorescein isothiocyanate, FITC) disuelto en un volumen
mínimo de carbonato sódico 0,1 M, en una cantidad
tal que proporcione una concentración final de 15 mg
FITC/1,0 g proteína. Se remueve a 4°C durante 18
horas, transcurridas las cuales se ajusta el pH a 7.0 con
ácido clorhídrico 0,1 M y se dializa a 4°C con
cambios frecuentes de PBS. Se eliminan las trazas de FITC libre
por filtración en gel (en Sephadex G25), y se guarda el
producto final
en pequeñas alícuotas a una temperatura
igual o inferior a -20°C.
La dilución de trabajo del conjugado se determina
sometiendo a prueba diversas diluciones del mismo en PBS frente a
frotis de un cultivo de C. fetus; deberá seleccionarse el
doble de la concentración más baja que llegue a
producir una fluorescencia brillante de estos organismos. Vistos
a gran aumento, los organismos adoptan un patrón de
fluorescencia de morfología característica, y se
localizan frecuentemente en los bordes del frotis.
- Prueba de inmunofluorescencia
Se fijan las muestras sobre portaobjetos de vidrio, se
colorean con el antisuero marcado con FITC y se observan al
microscopio en busca de organismos fluorescentes. La
reacción de coloración se lleva a cabo en una
cámara húmeda a 37°C durante 30 minutos.
Después se aclaran los portaobjetos lavándolos dos
veces en PBS durante 10 minutos a fin de eliminar el exceso de
conjugado. Hecho esto, se montan en glicerol tamponado (80% [v/v]
glicerol + 20% tampón fosfato 0,1 M, pH 8.0).
Por último, se sellan los cubreobjetos para evitar la
desecación y se observan las preparaciones al microscopio
bajo luz
ultravioleta.
Se trata de una enfermedad común al hombre y a
distintos animales domésticos especialmente a los
rumiantes, en los que produce abortos más bien de forma
esporádica que epidémica. La oveja es más
sensible que la vaca y la cabra.
Etiologia
Agente patógeno la Listeria monocytogenes es un germen
Gram (+), aerobio), hemolítico y catalasa positivo.
Ampliamente distribuido en la naturaleza en
forma saprofita ; en el animal infectado se distribuye
irregularmente, encontrándose en el SNC, lesiones
necróticas de hígado y miocardio, en los abortos y
envolturas fetales.
La infección se establece a través de diferentes
vías, especialmente por la mucosa nasal y ocular, y sobre
todo a través del tubo digestivo cuando consumen alimentos
contaminados. A ese respecto los forrajes mal conservados, ricos
en ácido butírico, y en amoniaco, constituyen un
medio favorable para la multiplicación de éste
agente y para su diseminación. Se ha señalado la
presencia de listerias en esperma de ovinos y caprinos,
sabiéndose que las vacas enfermas pueden excretar
éste germen por la leche durante
varios meses.
Lesiones
Se observan focos necróticos en el hígado y en la
placenta, que puede estar cubierta de un exudado abundante, rojo
marrón, particularmente en la oveja; infiltración
leucocitaria a nivel de estos focos necróticos.
Síntomas
Además de transtornos de naturaleza septicémica y
encefalítica tales como actitudes
anormales, desequilibrio, torneo, caída de orejas y
parálisis del labio inferior, hay que resaltar el aborto que se
produce en los últimos días de la gestación.
En caso de parto normal
el recién nacido puede morir en las primeras semanas de
vida. El aborto puede ir
acompañado de retención de envolturas fetales y
también de metritis.
Diagnostico
Por el cuadro clínico de la enfermedad puede ser
sospechada pero no confirmada. El diagnóstico requiere el
aislamiento de Listeria monocytogenes a partir de muestras de
líquido estomacal, de envolturas fetales, hígado,
sistema
nervioso o de los exudados de las cavidades. Corrientemente
el examen bacterioscópico resulta negativo y es necesario
recurrir a los cultivos o a las inoculaciones en animales de
laboratorio.
Las pruebas serológicas tienen un valor muy
limitado.
7. Tuberculosis
bovina
La tuberculosis es una enfermedad infecciosa
crónica causada por bacterias del genero
Mycobacterium, las cuales presentan como rasgo
característico el ser inmóviles, no esporulados y
ácido-alcohol
resistencia.
Esta enfermedad ha sido erradicada de los países
desarrollados. En otros países en donde la enfermedad
clásica se ha reducido, la enfermedad es producida por
micobacterias atípicas. Los niveles de infección de
tuberculosis bovina en el rodeo nacional se estima entre un 3% a
4%.
Etiología
Las micobacterias se encuentran ampliamente distribuidas en la
naturaleza, incluyendo desde saprofitas, patógenas,
oportunistas y estrictamente patógenas.
Los bacilos tuberculosos clásicos son:
M. tuberculosis (Hombre)
M. bovis (Bovinos)
M. avium (Aves)
También se incluye en este grupo el
Mycobacterium microti, el cual a diferencia de los anteriores no
afecta humanos, pero produce tuberculosis en las
ratas.
Transmisión
Del 80% al 90% de los casos la transmisión ocurre por
vía aerógena; con la tos o espiración de un
animal infectado se expelen gran cantidad de microgotitas que
contienen la bacteria las cuales al ser inhaladas por otro bovino
llegan al sistema
respiratorio dando comienzo a una nueva infección.
Esto se ve favorecido por contacto directo diariamente de los
bovinos en el pastoreo, comederos, corrales y salas de
ordeño.
Otra vía de ingreso es la digestiva por el consumo de
pastos y alimentos contaminados con secreciones nasales, materia fecal
y orina que contienen el agente causal.
La vía digestiva es muy importante en terneros que se
alimentan con leche cruda proveniente de las vacas enfermas,
debido a que del 1% al 2% de las vacas infectadas eliminan el
microorganismo en la leche. Otras vías no usuales pero
probables son: la vía cutánea, congénita y
genital.
Patogenia
Factores de manejo, edad y nutrición son
determinantes en la vía de infección, así
como en el periodo de incubación, proceso de la
enfermedad y diseminación.
A partir de la puerta de entrada los bacilos se localizan en el
complejo primario de los ganglios linfáticos regionales,
luego se diseminan por vía linfática a la cadena
ganglionar. Posteriormente la diseminación se da por
vía hematógena a órganos parenquimatosos por
ultimo el microorganismo es eliminado en exudados y secreciones
de órganos infectados.
La eliminación de Mycobacterium bovis por parte de los
animales infectados es intermitente y no esta en relación
con el grado de infección presente. Se ha comprobado que
los animales infectados recientemente eliminan el microorganismo
en las etapas tempranas de la enfermedad cuando a veces no son
detectadas por pruebas diagnosticas.
Síntomas
Los síntomas son poco manifiestos en el bovino, pero en
algunos puede presentarse. La vía de ingreso del M. bovis
y la localización de la lesión están
íntimamente relacionadas en esta enfermedad.
Las lesiones pueden localizarse en diferentes órganos y
ganglios linfáticos, en forma de nódulos o
tubérculos de material purulento-caseoso de color amarillento
cuyo tamaño y cantidad varían.
Diagnostico
El diagnostico de la tuberculosos en hatos primo-infectados se
hace por la caracterización macro y microscópica de
las lesiones en animales muertos en la finca o remitidos al
matadero, seguido del aislamiento y tipificación en el
laboratorio.
En las áreas endémicas el diagnostico se hace antes
de que muera el animal por dermoreacción, además
debe hacerse vigilancia en los mataderos y hacer evaluación
macro y microscópica de las lesiones compatibles con
tuberculosis.
Lesiones
Macroscopicas:
Las lesiones pueden variar dependiendo de la localización
anatómica y la forma de diseminación.
Generalmente el hallazgo pulmonar es áreas de
tamaño considerable con apariencia caseificada y zonas de
mineralización.
En las superficies serosas incluyendo las cápsulas de los
órganos se observan nódulos firmes de superficie
lisa, varían de 2 a 10 centímetros de
diámetro. También pueden presentarse zonas
caseificadas en las áreas profundas (Tuberculosis
perlada).
Nódulos firmes de aspecto granulomatoso con áreas
de calcificación y caseificación en ganglios
linfáticos y órganos parenquimatosos como el
hígado y el riñón.
Exudado de apariencia purulenta en meninges
Focos muy pequeños menores de 1cm de diámetro en
cualquier órgano (Tuberculosis miliar).
Microscópicas
En cualquiera de las formas en que se presenta la tuberculosis,
esta se caracteriza por la formación de granulomas.
Se pueden detectar bacilos ácido alcohol resistentes
libres en el citoplasma de los macrófagos, histiocitos y
células gigantes de la lesión
granulomatosa.
Dermorreaccion
El método
clásico para la detección de la tuberculosis bovina
es la prueba de la tuberculina.
Prueba Tuberculinica Cervical Simple
En esta prueba el lugar de inoculación es el tercio medio
del cuello. Esta zona se debe depilar con maquina o tijera a 5
cm. de diámetro aproximadamente. Se mide con un calibre el
espesor de la piel
previamente y se inyectan 0.1 ml de tuberculina PPD bovina de un
miligramo por mililitro.
La lectura se
hace mediante un calibre a las 72 horas (más o menos 6
horas). Cuando la lectura se ve
impedida por razones climáticas u otras causas, esta puede
hacerse hasta 24 horas mas tarde. Si la lectura se realiza mas
tarde de esto la prueba no tiene validez por lo que el
diagnostico no será confiable y debe repetirse la prueba a
los 60 días.
Positivo: 3mm o mayor
Negativo: menos de 3mm
Prueba Tuberculinica Ano-Caudal
Esta prueba se realiza en el pliegue ano-caudal interno a unos 6
cm. de la base de la cola y en el centro del pliegue. Esta zona
es menos sensible a la tuberculina que la piel del cuello. Se
inyectan 0.1 ml de PPD bovina de un miligramo por mililitro.
La lectura se hace mediante un calibre a las 72 horas (más
o menos 6 horas).
Positivo: 5mm o mayor.
Sospechoso: 3mm/ mas o menos de 5mm.
Negativo: menos de 3mm.
Hay que tener en cuenta que todo animal sospechoso en un
establecimiento donde se hayan detectado animales reaccionantes
positivos en pruebas anteriores o en la que se esta realizando se
le debe considerar positivo.
Prueba tuberculinica comparativa
La prueba intradérmica comparativa se utiliza para la
realización de un diagnostico diferencial entre animales
infectados por Mycobacterium bovis y aquellos sensibilizados a la
tuberculina por exposición
a otras micobacterias. Este tipo de sensibilización puede
ser atribuido a la gran reactividad antigénica cruzada
existente entre las especies de micobacterias y otros
géneros afines.
Esta prueba consiste en la inyección de tuberculina bovina
y tuberculina aviar en diferentes puntos del cuello y en la
subsiguiente evaluación de la respuesta transcurridos 3
días.
Para esta prueba comparativa la dosis de tuberculina no debe ser
inferior a 2.000 UI de tuberculina bovina ni a 2.00 UI de
tuberculina aviar. La distancia entre ambas inyecciones debe ser
de aproximadamente 12 a 15 cm.
Positivo: 4mm mayor que la tuberculina aviar
Dudoso: entre 1 y 4mm mayor que la tuberculina aviar
Negativo: cuando no hay reacción o cuando la
reacción es igual o menor que la tuberculina aviar.
En todas la inyección se realiza introduciendo la aguja
oblicuamente en las capas profundas de la piel e inyectando la
dosis de tuberculina. Después se comprueba que la
inyección ha sido bien realizada detectándose al
tacto una pequeña inflamación en el lugar de la
misma.
Aislamiento
Las micobacterias son bacilos ácido-alcohol resistentes,
no formadores de esporas y no encapsulados, por lo que en la
coloración de Zielh-Neelsen se observan como bacilos rojo
brillante sobre un fondo azul.
Estos microorganismos son aerobios obligados que crecen en medios
sintéticos simples, pero para el aislamiento primario a
partir de muestras clínicas se requiere de un medio
más complejo con una base de papa y huevo como el medio
Löwestein-Jensen, o con una base de agar y suero como el
medio Middlebrook.
El cultivo se hace a 37º C con una atmósfera de 5-10
% de CO2, el crecimiento es lento y dura de 3 a 6
semanas en desarrollarse, las colonias son pequeñas, secas
y con aspecto escamoso.
Control Y Erradicación
Detección y eliminación de todos los animales
infectados, control del movimiento de
estos, vigilancia en mataderos y dermoreacción, y
campañas de divulgación.
Prueba de la tuberculina
El método clásico para la detección de la
tuberculosis bovina es la prueba de la tuberculina, que requiere
la inyección intradérmica de tuberculina bovina y
ulterior detección, transcurridos 3 días, de una
inflamación en el punto de inyección.
La prueba intradérmica comparativa se utiliza para la
realización de un diagnóstico diferencial entre
animales infectados por Mycobacterium bovis y aquellos
sensibilizados a la tuberculina por exposición a otras
micobacterias. Este tipo de sensibilización puede ser
atribuido a la gran reactividad antigénica cruzada
existente entre las especies de micobacterias y otros
géneros afines. Esta prueba consiste en la
inyección de tuberculina bovina y tuberculina aviar en
diferentes puntos del cuello, y en la subsiguiente
evaluación de la respuesta transcurridos 3
días.
La prueba de la tuberculina se aplica normalmente en la
región de la tabla del cuello, aunque en circunstancias
especiales puede realizarse en el pliegue caudal de la cola. La
piel del cuello, no obstante, es más sensible a la
tuberculina que la del pliegue caudal. Para compensar esta
diferencia pueden inyectarse dosis superiores de tuberculina en
esta última zona.
Tradicionalmente se ha venido usando una tuberculina preparada en
un medio sintético y concentrada por calor
(Heat-concentrated synthetic medium, HCSM) aunque, en muchos
países, ésta ha sido substituida por un derivado
proteico purificado (Purified Protein Derivative, PPD). Siempre
que su actividad biológica haya sido estandarizada
correctamente, la tuberculina HCSM ofrece una potencia
adecuada, pero su especificidad es inferior a la de la
tuberculina PPD. Por otra parte, ha quedado demostrado que los
PPDs bovinos preparados a partir de la cepa de producción
AN5 de M. bovis son más específicos que los PPDs
humanos elaborados a partir de M. tuberculosis.
La potencia de las tuberculinas debe ser estimada por métodos
biológicos, basados en su comparación con
tuberculinas estándar. La potencia se expresa en UI. En
varios países, y en lo que concierne al ganado vacuno, se
considera aceptable una tuberculina bovina cuando su potencia
estimada garantiza una dosis mínima por bovino de 2.000 UI
(±25%). En el caso de sujetos con una sensibilidad
alérgica reducida, será necesaria una dosis
superior de tuberculina. Para la práctica de
campañas de erradicación se recomiendan dosis de
hasta 5.000 UI. El volumen de cada dosis inyectada no debe
sobrepasar los 0,2 ml.
Para la prueba intradérmica comparativa, la dosis de
tuberculina inyectada no debe ser inferior a 2.000 UI de
tuberculina bovina ni a 2.000 UI de tuberculina aviar. La
distancia entre ambas inyecciones debe ser de aproximadamente 12
a 15 cm. En animales jóvenes, cuyo cuello tal vez no
ofrezca espacio suficiente para cumplir con este requisito,
deberá administrarse de forma simétrica una
inyección en cada lado, en el centro del tercio medio del
cuello.
La utilización de una técnica de inyección
correcta es de gran importancia. Las zonas de inyección
deben ser afeitadas y limpiadas cuidadosamente. Se mide, con un
calibrador de precisión, el espesor del pliegue de la piel
en cada área afeitada. Debe emplearse una aguja corta con
la punta biselada conectada a una jeringa graduada (que contiene
la tuberculina). La inyección se realiza introduciendo la
aguja oblicuamente en las capas profundas de la piel e inyectando
a continuación la dosis de tuberculina. Después se
comprueba que la inyección ha sido bien realizada, en cuyo
caso podrá detectarse al tacto una pequeña
inflamación en el lugar de la misma. Transcurridas 72
horas, vuelve a medirse el espesor del pliegue de piel en cada
punto de inyección.
La interpretación de los resultados se basa en la
observación de un aumento del espesor del pliegue
cutáneo. En el caso de la prueba intradérmica
simple (que requiere una única inyección de
tuberculina bovina), la respuesta se considera negativa cuando no
se observa más que una leve inflamación, con un
incremento de espesor no superior a 2 mm y sin signos
clínicos como la presencia de un edema difuso o
generalizado, exudación, necrosis, dolor o
inflamación de los conductos linfáticos de esta
zona o de los ganglios linfáticos. El resultado
será considerado dudoso cuando no se observe ninguno de
estos signos clínicos y el aumento de espesor del pliegue
cutáneo esté comprendido entre 2 y 4 mm. La
reacción se considera positiva si se observan los
mencionados signos clínicos o si se produce un
engrosamiento del pliegue cutáneo igual o superior a 4 mm.
Por otra parte, y en el caso de rebaños infectados por M.
bovis, cualquier inflamación palpable o visible
deberá ser considerada como sinónimo de resultado
positivo.
En cuanto a la interpretación de la prueba
intradérmica comparativa, suele definirse el resultado
positivo como una reacción positiva a la tuberculina
bovina y un engrosamiento provocado por ésta superior en 4
mm al que produce la tuberculina aviar. El resultado se considera
dudoso si la reacción a la tuberculina bovina es positiva
pero el aumento de espesor es entre 1 y 4 mm superior al de la
reacción aviar. La prueba será considerada negativa
cuando la reacción a la tuberculina bovina sea negativa o,
aún siendo positiva, el engrosamiento sea igual o menor
que el provocado por una reacción positiva a la
tuberculina aviar. El modelo de
interpretación aquí descrito es utilizado en los
países de la Unión
Europea (UE), y su uso viene recomendado en la Directiva del
Consejo Europeo 64/432/EEC (4). En ocasiones se adopta una
interpretación más restrictiva. En el caso de la
prueba de inyección en el pliegue caudal, todo cambio
palpable o visible será considerado como reacción
positiva.
8. Enfermedades originadas por
hongos que
pueden causar abortos
Hongos:
Aspergilosis: Aspergillus spp (afecta todas las especies).
Mucormicosis: Rhizophus, Absidia, Mucor ( Afectan todas las
especies).
Candidiasis: Candida albicans (equinos).
Causada por el Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus
y otras especies de Aspergillus, es una enfermedad que afecta
principalmente a los tejidos
respiratorios, caracterizada por lesiones inflamatorias
granulomatosas, pudiendo ocurrir diseminación
hematógena a otros órganos; en ocasiones pueden ser
afectados el ojo, la piel, las meninges y el tracto reproductor;
la enfermedad es relativamente rara en animales domésticos
y en los animales de compañía, pero ocurre con
frecuencia en las aves de corral.
Prevalencia
Es generalmente aceptado que el Aspergillus fumigatus es el
miembro patógeno más importante del género,
también es importante el Aspergillus flavus en las aves en
cautiverio. Otras diversas especies de Aspergillus tienen
potencial patogénico y en ocasiones han sido consideradas
como agentes causales de enfermedad. En los últimos
años los informes sobre
Aspergilosis en los animales domésticos y en los animales
de compañía han aparecido sólo en forma
esporádica.
Aunque la Aspergilosis equina fue descubierta por primera vez
hace cerca de 100 años, la enfermedad aparentemente es muy
rara en caballos, la mayoría de los primeros casos
observados se referían a afecciones locales de las
aberturas nasales. El Aspergillus fumigatus ha estado
asociado con diarreas persistentes en los potros y abortos en
bovinos. Los abortos equinos pueden ocasionalmente ser causados
por el Aspergillus spp. La Aspergilosis ovina ocurre con poca
frecuencia lo mismo que en porcinos, en aves es muy
común.
Epidemiologia
El Género Aspergillus es de distribución mundial y tiene un papel muy
importante en procesos de descomposición en el suelo. Su ciclo
normal de vida es saprofito y no depende del parasitismo de los
animales y el hombre para
sobrevivir, prolíficos productores de esporas bajo un
amplio rango de condiciones ambientales, la diseminación
por el aire de sus
esporas contribuye a su ubicuidad y a su papel de contaminantes
comunes de los laboratorios. Aquellas especies que han sido
identificadas como patógenos potenciales con facilidad
pueden ser aisladas de aire, polvo, heno y paja; su patogenicidad
se fortalece al tomar una acción combinada con
antibióticos antibacterianos o esteroides
adrenocorticoides, es decir que la
administración de una de éstas sustancias puede
volver a los animales altamente susceptibles a la Aspergilosis
fatal.
Signos Clínicos Y Patología
Los signos clínicos que han sido descritos en animales
domésticos y mascotas no difieren materialmente de las
neumonías producidas por otras causas. La temperatura
elevada, descargas nasales mucopurulentas, conjuntivitis y tos o
estornudo son más o menos, manifestaciones constantes. Los
abortos micóticos bovinos en general ocurren del tercer al
octavo mes de la gestación, el feto abortado rara vez
está vivo, la placenta es retenida en aproximadamente el
60 % de los casos.
Macroscópicamente, las lesiones placentarias del aborto
micótico bovino debidas a Aspergillus fumigatus, muestran
cotiledones de color amarillo a gris, los que están
notablemente engrosados, en especial en la periferia. En algunos
casos el tejido intercotiledonal aparece con aspecto de cuero y
tiene un color gris que varía a moreno. El número
de los cotiledones afectados es variable. Como
característica se observa una placentitis necrosante con
los cambios más severos en los cotiledones. Puede ocurrir
extensa necrosis con infiltración polimorfo nuclear
alrededor de las áreas necróticas y
distribución difusa alrededor de la placenta; el edema y
la hemorragia son comunes y extensas; la arteritis generalmente
está presente y pueden ser observadas las hifas invadiendo
las paredes de los vasos sanguíneos.
Algunos fetos abortados aparecen normales a la inspección.
Los que aparecen más afectados, generalmente muestran
lesiones circunscritas, elevadas, grisáceas, semejantes a
la "tiña".
Diagnostico De Laboratorio
Los Aspergillus constituyen los hongos contaminantes más
comunes en el laboratorio y rutinariamente pueden ser cultivados
de la piel y del tracto respiratorio superior de los animales
sanos; es evidencia presuntiva de Aspergilosis el aislamiento
repetido de una especie del Aspergillus del material
clínico en ausencia de otros agentes patógenos; la
recuperación del microorganismo de tejidos flameados o no
expuestos ayuda a soportar el diagnóstico. Otra evidencia
se obtiene por la demostración en el tejido de micelio
semejante al del Aspergillus spp y el diagnóstico se
realiza a veces sobre ésta base. Una combinación de
evidencias de cultivo e histológicas es la base más
firme para el diagnóstico.
Examen microscópico directo
Las reparaciones húmedas pueden observarse directamente.
El material para raspados se obtiene con facilidad de las
vías aéreas durante la necropsia de los animales
afectados. Los frotis pueden ser teñidos con Gram. El
micelio mide 4-6 μ de ancho, es tabicado y de un
diámetro regularmente uniforme.
Cultivo
El Aspergillus flavus y Aspergillus fumigatus, así como
otras especies de Aspergillus crecen fácilmente en el agar
glucosa de saboraud. Los antibióticos antibacterianos
pueden ser utilizados en el medio, pero no deberá ser
empleada la cicloheximida ya que la mayor parte de Aspergillus
son sensibles a éste antibiótico.
Las colonias de Aspergillus fumigatus crecen rápidamente y
son planas. Al principio son blancas y ligeramente vellosas, pero
conforme se desarrollan las conidias toman un color verde azulado
oscuro y un aspecto pulverulento. Los cultivos viejos tienen una
apariencia gris "ahumada", muy característica.
Pruebas de patogenicidad
No es necesaria la inoculación animal para la
identificación de agentes de la Aspergilosis.
Inmunología
No se han desarrollado pruebas inmunológicas para el
diagnóstico de la Aspergilosis en los animales.
Diagnostico Diferencial
Clínicamente, la Aspergilosis de las mascotas y de los
grandes animales domésticos necesita ser diferenciada de
otras micosis y de infecciones respiratorias de etiología
viral. El aborto micótico bovino puede ser parecido al de
la brucelosis, Vibriosis y Leptospirosis.
Tratamiento
No existe un tratamiento efectivo contra la Aspergilosis. El
control de la enfermedad requiere de la localización de la
fuente del hongo esporulante (generalmente la cama) y la
eliminación, lo más posible de aquella.
Es una enfermedad granulomatosa que afecta a diversos
animales y al hombre, causada por hongos del género
Phycomycetes. Los miembros de la familia
Mucoraceae pertenecen a ésta clase y la Mucormicosis
comprende la enfermedad, en ocasiones denominada ficomicosis,
causada por Mucor pusillus. Se cono ce de una multitud de casos
de enfermedades mucormicoticas de los bovinos; En 1935, Jungherr
atribuyó a hongos de los géneros Mucor y Rhizopus
ser la causa de abortos y otros desórdenes reproductivos.
Las lesiones micóticas fueron descritas en una gran
variedad de órganos, las más comunes en placentitis
micótica y/o neumonía aguda
micótica.
Signos Clinicos Y Patología
Adecuadas descripciones clínicas de las Mucormicosis
animales sólo han sido registradas para los equinos, en
las otras especies animales el diagnóstico se ha realizado
por lo común en la necropsia, encontrándose las
lesiones en una gran diversidad de órganos.
En los equinos se observa como un área o áreas de
granulación exuberante (frecuentemente en miembros entre
el casco y el corvejón), pueden encontrarse en el abdomen
ventral, cuello, belfos y en la piel que rodea los ollares; la
mayoría se desarrolla más bien con lentitud en
sitios en donde se considera que han sido traumatizados previa
mente por cortaduras o golpes.
Diagnostico De Laboratorio
Los mucormicetos son comunes en la naturaleza y se encuentran en
ocasiones como contaminantes de laboratorio. Varios
micólogos han indicado que éstos microorganismos
pueden ser invasores secundarios y que muy rara vez son
patógenos primarios.
Examen microscópico directo
Mediante el examen de raspados de las superficies de las mucosas
y de las lesiones granulomatosas para determinar la presencia de
micelio ancho, no septado.
Cultivo
El agar glucosa de saboraud constituye un medio satisfactorio
para el aislamiento, restringe la mayoría de los
contaminantes bacterianos y ésta característica
puede ser incrementada por la adición de
antibióticos antibacteriales. La cicloheximida no debe ser
añadida al medio ya que los ficomicetos son sensibles a
ella.
Pruebas de patogenicidad
Las infecciones experimentales en animales no son útiles
en el diagnóstico de laboratorio.
Inmunología
Poco se conoce con respecto a la capacidad del huésped
para defenderse contra la enfermedad mucormicótica, por lo
general se considera que éstos hongos son
apatogénicos, pero que bajo ciertas condiciones son
capaces de establecerse en el tejido causando severos cambios
patológicos y ocasionalmente una enfermedad fatal, un
defecto inmunológico favorece la
infección.
Causada por especies del género Candida
(comúnmente Candida albicans), es una enfermedad
esporádica del tubo alimenticio de las aves de corral, en
ocasiones son afectados los cerdos algunas veces con
alteración de la piel. Puede causar abortos o mastitis en
el ganado. Las infecciones son raras en perros, gatos y
caballos.
Signos Clinicos Y Patología
Los signos clínicos en becerros incluyen diarrea acuosa y
melena, con subsecuente anorexia,
deshidratación y progresión gradual a la
postración y la muerte. Las
infecciones mamarias bovinas causadas por Candida spp en
ocasiones son benignas y transitorias, algunas autolimitantes.
Las infecciones más severas siguen después de los
tratamientos con antibióticos. Candida tropicalis
está asociado en casos de mastitis aguda con grados
variables de
gravedad, las ubres con hinchazón extensa con una
consistencia esponjosa, leche de los cuartos afectados gris y
viscosa, temperaturas entre 40º y 42º C, anorexia,
claudicación y drástica baja en la
producción de leche.
Diagnostico De Laboratorio
Examen microscópico directo
Los raspados de mucosa pueden ser extendidos en un portaobjetos y
teñirse con Gram. o preparaciones directas pueden ser
examinadas con lactofenol azul de algodón. Pueden
demostrarse células redondas u ovales en gemación
de 3-6μ de diámetro y fragmentos de micelio, algunas
veces con células en gemación
insertadas.
Cultivo
Es esencial que se utilicen medios selectivos para el aislamiento
primario; el caldo glucosado y agar saboraud soportan
adecuadamente el crecimiento de Candida spp y restringen el
crecimiento de diversas bacterias.
Pruebas de patogenicidad
Los conejos y ratones sucumben a la inoculación IV de
Candida albicans, pero no existe un empleo práctico de la
prueba ya que otras especies de Candida spp pueden causar
también la muerte de
éstos animales.
Inmunología
No existen pruebas serológicas adecuadas para el
diagnóstico de Candidiasis en animales.
Diagnostico diferencial
Como regla general las lesiones cutáneas y de las mucosas
en la candidiasis en todas las especies animales, deben ser
diferenciadas de las infecciones bacterianas y las
dermatofitosis.
Tratamiento
El sulfato de cobre a la
dilución de 1:2000 en agua potable ha sido considerado
como un tratamiento, algunos veterinarios recomiendan el cambio a
nistatina si el sulfato de cobre no es efectivo.
GALINA, Hidalgo Carlos; Reproducción de los animales
domésticos; editorial Limusa; I edición; México
D.F; 1998; pp 211-219.
JUNGERMAN, Paul F.; Micologia Médica Veterinaria; CECSA; I
edición; México D.F.; 1977; pp 95-107;
BLOOD, D.C; Medicina
Veterinaria; Editorial Interamericana; IV edición;
México D.F; 1974; pp 388-450.
Brucelosis bovina; O.I.E: Office
International des Epizooties; http://www.redvya.com/veterinarios/veterinarios/especialidades/bovino/enfermedades/Enfermedad03.htm
Campylobacteriosis genital bovina; O.I.E: Office International
des Epizooties;
http://www.redvya.com/veterinarios/veterinarios/especialidades/bovino/enfermedades/Enfermedad04.htm
Tuberculosis bovina; O.I.E: Office International des
Epizooties.
http://www.redvya.com/veterinarios/veterinarios/especialidades/bovino/enfermedades/Enfermedad05.htm
DERICAUX J.; Reproducción de los animales
domésticos; Editorial Acribia; II edición; zaragoza
(España); 1976; pp 409-465.
Autor:
José Angel Parada
Estudiante Ingeniería de Producción Animal.
Facultad de Ciencias
Agrarias y del Ambiente.
Universidad
Francisco de Paula Santander.
Cúcuta-Colombia.
 Página anterior | Volver al principio del trabajo | Página siguiente  |