Indice
1.
Introducción.
2. Revisión
Bibliográfica.
3. Impacto ambiental de la
aplicación de fertilizantes
nitrogenados.
4. Importancia del
cultivo.
6. Azotobacter sp. diazótrofo no
simbiótico.
7. Producción de
sustancias fisiológicamente activas y aplicación
práctica de Azotobacter sp.
8. Fijación simbiótica de
N2 atmosférico.
9. Características de Rhizobium
sp.
10. Factores que afectan la
nodulación y la fijación de N2 en las
leguminosas.
11. Aplicación práctica de
Rhizobium sp. en cultivos de frijol común (Phaseolus
vulgaris L.).
12. Aplicación de la
inoculación combinada de bacterias fijadoras de N2
atmosférico.
13. Componentes del
rendimiento.
14. Impacto
económico-ambiental.
15.
Conclusiones.
16.
Bibliografía.
1. Introducción.
Un puñado de tierra
contiene billones de microorganismos, son tantos tipos diferentes
que se desconocen las cantidades exactas. Actualmente conocemos
algunos de ellos; sólo se han descrito formalmente
alrededor de 500 microorganismos no-eucariontes, lo que contrasta
con las 500 000 especies de insectos ya descritas. Se conoce muy
poco de la Microbiología, a pesar de que es la parte
de la Biología que se proyecta más
ampliamente hacia el mantenimiento
de la vida en el planeta (Anónimo, 2001 b).
De los elementos del suelo el
nitrógeno es el más necesario para el desarrollo y
sobre vivencia de las plantas, este es
el que presenta más transformaciones
microbiológicas y por consiguiente el que más
comúnmente se encuentra deficiente en el suelo,
contribuyendo a la reducción de los rendimientos
agrícolas en todo el mundo (Anónimo, 2001
a).
Las principales formas de mantener suficiente
nitrógeno en el suelo es mediante la aplicación de
fertilizantes nitrogenados y las formas de fijación
biológicas, pero debido al alto costo de los
fertilizantes nitrogenados, la gran cantidad de energía
requerida para su producción y las capacidades
subóptimas para su transportación limita su uso en
países subdesarrollados, especialmente en comunidades
agrícolas pequeñas (Anónimo, 2001
a).
En el mundo desarrollado la agricultura
depende en gran medida del uso de fertilizantes químicos y
pesticidas para mantener sus altas producciones agrícolas,
sin tener en cuenta los terribles daños que estos pueden
ocasionar ya sea afectando el ciclo global del nitrógeno,
contaminando las aguas subterránea y superficiales,
incrementando los riesgos de
intoxicaciones químicas y aumentando los niveles de
óxido nitroso (N2O) atmosférico; el cual
es un potente gas invernadero.
El uso de nitrógeno sintético en los últimos
40 años ha aumentado de 3.5 millones a 80 millones de
toneladas, tanto en países desarrollados como en
vías de desarrollo, incrementándose sus costos de
producción a más de $ 20 billones USD
anualmente. Para el año 2050 la población mundial se espera crezca el doble
de la cifra actual de habitantes, de esta proyección el
90% debe residir en las regiones tropicales o subtropicales de
los países en desarrollo de Asia,
África y América
Latina. Según estos datos, es
razonable esperar que la necesidad de fijación de
N2 para la producción de alimentos
agrícolas para esta fecha también duplique la cifra
fijada actualmente. Si esta es suministrada por fuentes
industriales, su uso se incrementará en 160 millones de
toneladas de nitrógeno por año; lo que
requerirá quemar más de 270 millones de toneladas
de energía para su producción, sin tener en cuenta
la duplicación de las fatales consecuencias que pudieran
ocasionar (Anónimo, 2001 a).
Los procesos
naturales de fijación biológica del N2
(FBN) juegan un importante rol en la activación de los
sistemas
agrícolas sustentables por su beneficio ambiental. El
incremento de su aplicación puede mitigar la necesidad del
uso de fertilizantes nitrogenados sintéticos con su
consiguiente efecto benéfico al ciclo del
nitrógeno, el calentamiento global y el saneamiento de las
aguas subterráneas y superficiales. Este proceso
depende básicamente de la acción de los
microorganismos en conjunto con las plantas (Anónimo, 2001
a).
Existen algunas especies de microorganismos que poseen
la habilidad de convertir el dinitrógeno
atmosférico (N2) a amonio
(NH4+) mediante la acción de la
enzima nitrogenasa. Estas especies son denominados
diazótrofos y requieren de energía para realizar su
metabolismo.
Dentro de los diazótrofos capaces de realizar este proceso
se encuentran los denominados fijadores de vida libre, los cuales
fijan N2 atmosférico sin la cooperación
de otras formas vivas, siendo la familia
Azotobacteriaceae la que agrupa uno de los géneros
más importantes utilizados en la biofertilización a
diferentes cultivos. El género
Azotobacter es uno de los microorganismos utilizados como
biofertilizantes que más se aplica e investiga en Cuba. Sus
propiedades beneficiosas se ponen de manifiesto en una gran
variedad de hortalizas, granos y viandas (Mayea et al., 1998).
FAO (1995) reporta que este se considera de menor importancia
agrícola por incorporar modestas cantidades de
nitrógeno al suelo, Bhattacharya y Chaudhuri (1993)
reportan que es capaz de fijar de 20 a 30 kg. de N
ha-1 año, pero tanto Azotobacter como
Azospirillum en determinadas condiciones su efecto beneficioso no
se debe solamente a la cantidad de N2
atmosférico fijado, sino a la capacidad de producir
vitaminas y
sustancias estimuladoras del crecimiento (ácido
indolacético, ácido giberélico, citoquininas
y vitaminas) que influyen directamente en el desarrollo vegetal
(Rodelas, 2001).
Otro grupo de
microorganismos que se convierten en fijadores de N2
cuando viven en asociaciones simbióticas con organismos
superiores de vida son las bacterias pertenecientes al
género Rhizobium, las cuales establecen relaciones
simbióticas con plantas leguminosas (Bauer,
2001).
Entre los diferentes sistemas biológicos capaces
de fijar N2 atmosférico, la simbiosis
Rhizobium-leguminosa constituye con la mayor cantidad aportada al
ecosistema y a
la producción de alimentos (Burdman et al., 1998). Aunque
hay diversas asociaciones que contribuyen a la fijación
biológica del N2, en la mayoría de
lugares agrícolas la fuente primaria (80%) del
nitrógeno fijado biológicamente ocurre a
través de dicha simbiosis (Anónimo, 2001 b). Se
estima que esta puede oscilar entre 200 y 250 kg. N
ha-1 año (FAO, 1995), calculándose que
puede alcanzar el 20 % de la cantidad fijada anualmente sobre el
planeta, constituyendo la asociación más elaborada
y eficiente entre plantas y microorganismos (Burdman et
al.,1998).
Dentro de las especies que establecen relaciones
simbióticas con esta bacteria se encuentra el frijol
común (Phaseolus vulgaris L.), la cual es la legumbre
más importante para el consumo humano
en los países del tercer mundo, pero a su vez es la
especie de más baja capacidad de nodulación y
fijación de N2. Este cultivo en nuestro
país ha sido durante muchos años una
práctica común del campesinado, cuya
producción cumplimentó en determinado grado las
necesidades del país. Actualmente la producción es
insuficiente, aproximadamente 0.63 t ha-1, como
resultado del nivel de vida de la población y su poca
intensificación. Durante varios años la
producción de este grano ha estado
limitada a las pequeñas producciones del agricultor
privado, por lo que el Estado ha
tenido que invertir $ 400 (USD) para adquirir una tonelada de
frijol mediante la importación de este alimento para el
consumo de la población. Resulta obvio que aumentar el uso
y mejorar el manejo del N2 fijado
biológicamente por esta leguminosa es una meta importante
para la agricultura tanto por razones humanitarias como por
razones económicas (FAO, 1995; Burdman et al., 2000;
Quintero, 2000).
En los últimos 20 años se han realizado
ingentes esfuerzos por parte de científicos e
investigadores en todo el mundo con el fin de llevar a cabo una
mayor eficiencia en la
fijación de N2 por parte de la simbiosis
Rhizobium-leguminosa en el cultivo del frijol, basados en las
herramientas y
perspectivas moleculares de las secuencias génicas y la
trangénesis de plantas, alternativas que atentan contra la
biodiversidad,
sin tener en cuenta los estudios sobre la bioquímica
de las asociaciones microbianas, los que han abierto un nuevo
horizonte que está cambiando la percepción
de la diversidad microbiológica. Los efectos
agronómicos de los experimentos de
microorganismos asociados a la rizosfera de las plantas
conjuntamente con los simbióticos han promovido un
sistema de
estudios para la mayor comprensión de las comunicaciones
entre plantas y microorganismos Estos constituyen una fuente
básica para la utilización de la fijación
biológica del N2 con el fin de mejorar la
productividad
de los cultivos incluyendo los microorganismos fijadores de
nitrógeno asociados a la rizosfera, como Azotobacter y
Azospirillum; y aquellos que viven en estrechas relaciones
simbióticas con las plantas, tales como: Rhizobium sp.,
Azolla sp. y endo / ectomicorrizas (Fisher y Long 1992, citado en
Anónimo, 2001 a).
Objetivos.
- Analizar los efectos de la inoculación
combinada de Rhizobium leguminosarum biovar. phaseoli y
Azotobacter chroococcum en la fijación de N2
y el rendimiento del frijol común (Phaseolus
vulgaris). - Comparar dos dosis de inoculación del
biopreparado comercial de Rhizobium.
Ciertos microorganismos del suelo pueden incrementar la
disponibilidad de nutrientes para las plantas, otros producen
compuestos como vitaminas, hormonas y
antibióticos que contribuyen a la salud vegetal y a la
obtención de altos rendimientos. El hombre con
el desarrollo tecnológico aplicó métodos
microbiológicos para estudiar estos microorganismos y
utilizarlos posteriormente, bajo el nombre genérico de
biofertilizantes, en las prácticas agrícolas
contemporáneas. (Compagnoni, 1997; Guet, 1997).
A partir de la década del 40, millones de
toneladas de nitrógeno sintético era suministrado a
las producciones agrícolas anualmente, con el fin de
aumentar sus rendimientos potenciales. La alta demanda de
alimentos fue otro factor determinante de la sustitución
de los fertilizantes nitrogenados por los procesos de
fijación biológica del N2. La "revolución
verde" se convirtió en el punto sublime de la
producción y aplicación de los mencionados
fertilizantes nitrogenados, trayendo consigo el gasto
incalculable de fuentes de energía natural para su
producción y los nefastos problemas que
ha ocasionado en la ecología y el
equilibrio
biológico. Desde 1972, con la fundación de la IFOAM
(Internacional Federation of Organic Agriculture Movements) se
estableció que la agricultura orgánica debía
aumentar la fertilidad de los suelos y su
actividad microbiana e incrementar el reciclaje de los
nutrientes. En la década de los 90, los biofertilizantes
se convirtieron en un punto común de investigación teniendo en cuenta los serios
problemas
ambientales causados con la aplicación irracional de
los fertilizantes químicos (IFOAM, 2001).
3. Impacto ambiental
de la aplicación de fertilizantes
nitrogenados.
El uso de nitrógeno sintético en los
últimos 40 años ha aumentado de 3.5 millones a 80
millones de toneladas, tanto en países desarrollados como
en vías de desarrollo, incrementándose sus costos de
producción a más de $ 20 billones USD anualmente
(Hardy, 1993, citado en Anónimo, 2001 a). En este periodo,
el ciclo global del N2 se ha visto afectado por el
incremento irracional de la fijación de N2
mediante procesos industriales, es decir, mediante la
aplicación de fertilizantes nitrogenados; pero su impacto
ambiental aun está por calcularse.
La contribución de la fijación de
N2 al ciclo global de este elemento no ha cambiado en
los últimos años, teniendo un balance aproximado
con el proceso de desnitrificación, el cual convierte el
nitrógeno combinado en N2 atmosférico.
En la actualidad la fijación no ocurre eficientemente
debido a que es inhibida por la presencia de nitrógeno
mineral en el medio (Vitouseck y Matson, 1993, citado en
Anónimo, 2001 a). Según estos autores, alrededor
del 50 % de los fertilizantes nitrogenados aplicados a los
cultivos es absorbido por las plantas, el otro 50 % o más
es almacenado en el suelo para la nutrición de los
cultivos subsiguientes; pero una gran parte de este es
transformado en N2 atmosférico mediante los
procesos de desnitrificación de los microorganismos y otra
gran parte es lixiviado a capas inferiores donde contaminan las
aguas subterráneas y el manto freático en forma de
nitratos (NO3). En Iowa el incremento del contenido de
NO3 en aguas subterráneas desde 1950 a 1980 ha
sido paralelo al incremento del uso de fertilizantes
nitrogenados.
El óxido nitroso (N2O) es otro gran
factor contaminante producto al
excesivo uso de fertilizantes nitrogenados, este conjuntamente
con el CO2, metano (CH4) y los
clorofluorcarbonos es un gas invernadero causante en gran medida
del calentamiento global. La energía reflectiva por mole
del N2O es alrededor de 180 veces la de
CO2, lo que lo convierte en un potente gas
invernáculo. El N2O troposférico ha
aumentado potencialmente en la década del 80,
conjuntamente con el incremento sustancial de la
aplicación de fertilizantes sintéticos. Por otro
lado la desnitrificación del NO3 produce cerca
del 90 % de N2 y 10 % de N2O, al aumentar
la cantidad de nitrógeno en el suelo producto de su uso
indiscriminado, aumenta este proceso de desnitrificación y
por consiguiente los niveles de toxicidad en la atmósfera. Hoy
día la cantidad global de este compuesto se encuentra
fuera de balance, excediendo de un 30–40 %, su
concentración en la atmósfera también se
incrementa 0.25 % por año (Vitouseck y Matson, 1993,
citado en Anónimo, 2001 a). Esto demuestra que la
producción de fertilizantes nitrogenados no solamente
interviene en el agotamiento de la energía natural y el
combustible fósil, sino también genera grandes
cantidades de CO2 en su producción y contribuye
sustancialmente al calentamiento global potencial.
En los próximos 50 años será
necesario un incremento sin precedentes en la producción
agrícola para satisfacer los niveles de insumos
calóricos y proteicos para el abastecimiento a la gran
población mundial; pero también es imperativo la
búsqueda de nuevos métodos de producción
agronómicamente y ecológicamente sustentables para
proteger el entorno que soportará tal explosión
demográfica (Anónimo, 2001 a).
Los hechos concernientes al cultivo de leguminosas
varían tanto como lo hacen las especies. Con respecto a la
alimentación humana, el cultivo de unas
pocas especies jugó un importante rol en la historia de la raza humana.
En las regiones del actual México en
el 4000 A.C. ya se consumía el frijol común como
importante fuente de alimento. Arvejas (Vicia sativa) y habas
(Vicia faba) se han encontrado en fosas arqueológicas en
el Medio Oriente, que datan del año 6000 A.C. Las
migraciones, guerras y el
comercio
permitieron a algunas especies como el maní (Arachis
hipogea) soja (Glycine
max), frijol (Phaseolus vulgaris) y haba (Vicia faba) diseminarse
a numerosas regiones a lo largo del mundo. Sin embargo, excepto
para las semillas oleaginosas (soja y maní), las
leguminosas han sufrido una recesión muy aguda,
particularmente debido a la competencia de
los cereales (FAO, 1995).
A escala mundial,
las leguminosas aportan, en términos de nutrición
humana 22% de proteínas,
32% de grasas y aceites y 7% de carbohidratos.
En términos de nutrición animal aportan 38% de
proteínas, 16% de lípidos y
5% de carbohidratos. Su producción mundial, con respecto a
las leguminosas de grano, exceptuando la soja, sobre un total de
72 millones de hectáreas producen 47 millones de
toneladas, con rendimientos de 650 kg. ha-1 (FAO, 1995). De todas
las especies de leguminosas, el frijol común (Phaseolus
vulgaris L.) es la que mayor importancia tiene por su nivel de
producción y de consumo que presenta en el mundo. Esta
constituye una fuente de alimentación proteica importante
y habitual para nuestra población. Este grano contiene
alrededor de 20% de proteínas de alta digestibilidad,
constituidas por varios aminoácidos esenciales para el
metabolismo humano, entre ellos isoleusina, leusina,
fenilalanina, metionina y triptófano. Además, puede
considerarse también como un alimento de alto valor
energético, ya que contiene de 45 a 70 % de carbohidratos
totales. Por otra parte, aporta cantidades importantes de
minerales
(Quintero, 2000).
Según este autor, el frijol se ha cultivado
tradicionalmente en Cuba en pequeñas explotaciones
campesinas, lo que se mantiene hasta nuestros días, aunque
con la estructura
actual de tenencia de la tierra su
cultivo se ha extendido a áreas de autoconsumo de
organismos estatales de todo tipo. La siembra a escala comercial
en granjas especializadas, para venta a la
población a través de la red comercial del Estado, es
prácticamente nula. El rendimiento promedio en nuestro
país es relativamente bajo (0.63 t ha-1), comparado con
Chile,
Perú y Argentina, aunque
similar o superior a otros países de la región.
Según Rehm y Spig (1991), citado por Quintero (2000) esta
especie es una de las más susceptible de las leguminosas a
las enfermedades y
plagas, siendo atacada fuertemente en los climas húmedos y
calientes por varios hongos del
complejo suelo-raíz y por varios hongos, bacterias y
virus de la
parte aérea de la planta.
Este grano, dentro del grupo de las leguminosas,
además de ser la más importante para la
alimentación humana a nivel mundial, es la de más
baja capacidad de nodulación y fijación de
N2 atmosférico, por lo que en varias regiones
se recurre a su fertilización nitrogenada (Burdman et
al.,2000). Está claro que aumentar la fijación de
N2 por esta leguminosa traería consigo una
considerable reducción de insumos en su producción,
así como el aumento en sus rendimientos
potenciales.
5. Procesos de
fijación de N2
atmosférico.
Los proceso de fijación del N2
atmosférico, es decir, obligarlo a reaccionar con otros
elementos para formar un compuesto químico que lo contenga
puede lograrse mediante métodos químicos y
métodos biológicos. Mayea et al. (1998)
señala que los métodos químicos se basan en
descargas eléctricas, donde se forma óxido
nítrico el cual al reaccionar con el agua de
lluvia origina ácido nítrico. Este ácido
reacciona con el amoniaco (NH3) del aire para
producir nitrato de amonio (NO3NH4) y de
esta forma mediante las precipitaciones llega al suelo una
modesta cantidad de nitrógeno. Se estima que este proceso
puede fijar alrededor de 10 millones de toneladas métricas
de N2 por año (Hardy, 1993, citado en
Anónimo, 2001 a).
Los métodos biológicos de fijación
de N2, dependen básicamente de la capacidad de
algunos microorganismos de convertir el N2
atmosférico en formas asimilables para las plantas
(NH4+) mediante la acción del complejo
enzimático nitrogenasa (Mayea et al., 1998). Según
estos autores, ciertas bacterias y algunas especies de algas
verdeazules (Cianobacterias) que se desarrollan
independientemente tienen la habilidad de fijar el N2
atmosférico en sus células,
dando como producto final de la fijación proteínas.
Estos sistemas, ya sean de vida libre, como en simbiosis con
formas superiores de vida incorporan aproximadamente 170 millones
de toneladas de nitrógeno anualmente al ecosistema
(González y Lluch, 1992), y es probable que esta cantidad
no haya cambiado sustancialmente en los últimos
años.
6. Azotobacter sp.
diazótrofo no simbiótico.
Las bacterias aerobias de vida libre fijadoras de
N2 más conocidas se encuentran formando parte
de las familias Azotobacteriaceae, Spirillaceae y Bacillaceae.
Del género Azotobacter se han descrito varias especies:
Azotobacter chroococcum (Beijerinck 1901), A. vinelandii (Lipman
1903), A. agilis (Beijerinck; Winograsky 1938) y A. paspali
(Döbereiner 1966); sin embargo no todas tienen características perfectamente definidas
(Martínez, 1986; Mayea et al., 1998; Itzigsohn et al.,
2000).
Según González y Lluch (1992) los
microorganismos del género Azotobacter se describieron por
primera vez por Beijerinck en 1901, desde este momento hasta
nuestros días, estas bacterias han llamado la atención de numerosos investigadores por su
importancia tanto teórica como práctica. La
morfología de Azotobacter ha sido y es, uno
de los apartados de estudio más atractivo de este
género bacteriano. Así, la citología de
estas bacterias no solo se altera por las condiciones
ambientales, sino que más bien varía de una forma
extrema. Winogradski en 1938 observó que la presencia en
el medio de cultivo de compuestos carbonados como el n-butanol
daba lugar a la formación de células vegetativas
normales, pero en función
del periodo de incubación se originaban células
cocoides denominadas quistes. Pochon y Tchan en 1948,
consideraron a estos quistes como formas de reposo. Más
tarde Socolofsky y Wyss en 1962, demostraron la
característica de resistencia de
estas formas quísticas.
Este género comprende bacterias grandes,
levadurifórmes, aerobias estrictas, no esporógenas
y Gram negativos; son mesófilas y su temperatura
óptima de desarrollo es de 30 oC. La eficacia media en
relación con el N2 fijado por unidad de
azúcar
descompuesto es de 5 – 10 g, lo cual se cataloga como bajo.
El pH
óptimo de crecimiento es de 6 y a niveles inferiores
disminuyen las cantidades de N2 fijado y hasta puede
inhibirse su actividad metabólica (Martínez-Viera,
1986; Mayea et al., 1998). La capacidad de fijación de
N2 por estas bacterias varía considerablemente
en dependencia de la composición del medio, su acidez,
temperatura y aireación, de la presencia de N combinado,
de la naturaleza de las
fuentes de carbono,
microelementos y de la acción de organismos
antagónicos en el medio.
El efecto de diferentes fuentes de carbono sobre la
fijación de N2 por esta especie depende de la
estructura de las sustancias orgánicas y de las reservas
de energía química utilizable
que contiene, siendo también importantes los procesos de
oxidación de la materia
orgánica durante la respiración (Martínez-Viera, 1986).
Según este autor, la propagación de estas bacterias
está relacionada estrechamente con la presencia en el
medio de suficientes cantidades de fósforo (P) y potasio
(K), siendo mayor el efecto del P, cuya escasez o ausencia puede
hasta inhibir el desarrollo del cultivo. Este elemento estimula
el metabolismo del carbono, la multiplicación y la
fijación de N2. Las cantidades necesarias de K
son menores, cuando existen altas concentraciones de este en el
suelo se inhibe el desarrollo de las bacterias fijadoras,
dependiendo del grado de toxicidad de la fracción
aniónica de sal. Los requerimientos de microelementos son
notables, el molibdeno (Mo) es esencial para la mayoría de
las cepas de este género, tanto cuando crecen sobre
medios libre
de nitrógeno como cuando se desarrollan sobre nitratos,
aunque las necesidades son mayores en ausencia de
nitrógeno combinado.
Según Rodelas (2001), dentro del grupo de los
fijadores de vida libre el género Azotobacter presenta la
capacidad de fijar N2 atmosférico cuando en el
suelo existen suficientes cantidades de materia orgánica,
ya que en suelos poco fértiles con escaso contenido de
materia orgánica no se obtiene efecto agronómico
positivo.
González y Lluch (1992) reportan que el
género Azotobacter presenta alta capacidad de
biodegradación, muy especialmente para la oxidación
de compuestos fenólicos sustituidos. Este hecho resulta de
especial interés,
basándose en recientes observaciones que muestran como
estas bacterias aumentan su actividad biológica
(incluyendo la capacidad fijadora de N2) en suelos
agrícolas adicionados de residuos que poseen un alto
contenido en sustancias fenólicas, pudiéndose
sugerir que estos microorganismos pueden contribuir a la
biotransformación de este tipo de residuos cuando se usen
como fertilizantes. En este contexto estos diazótrofos
están considerados por algunos investigadores como
bacterias ciertamente ideales para los procesos de
descontaminación de suelos agrícolas con sustancias
xenobióticas.
7. Producción de
sustancias fisiológicamente activas y aplicación
práctica de Azotobacter sp.
Desde el punto de vista histórico, es Azotobacter
el microorganismo que de una forma más amplia ha sido
utilizado en la agricultura. Las primeras aplicaciones de estas
bacterias datan de 1902, alcanzando una amplia utilización
durante las décadas del 40, 50 y 60, particularmente en
los países de Europa del Este
(González y Lluch, 1992).
La aplicación práctica de la
inoculación de este diazotrófo ha sido positiva,
observándose notables incrementos en los rendimientos en
diferentes cultivos, principalmente en cereales. Estos resultados
obtenidos, especialmente con la inoculación de Azotobacter
chroococcum y Azospirillum brasilense, no deben atribuirse
exclusivamente a la ganancia de N2 por las plantas, ya
que estos microorganismos en determinadas condiciones su efecto
beneficioso se debe fundamentalmente a la capacidad de
solubilizar fosfatos y sintetizar sustancias estimuladoras del
crecimiento vegetal, tales como, vitaminas y hormonas vegetales
que intervienen directamente sobre el desarrollo de las plantas
(González y Lluch, 1992; De Troch, 1993; Pozzon, Giogetti
y Martínez, 1993; Baldani, 1997; Mayea et
al., 1998; Velazco y Castro, 1999; Burdman, 2000;
Itzigsohn, 2000; Rodelas, 2001). De este modo A. chroococcum
sintetiza tiamina de 50–100 mg g-1 de sustancia celular
seca; ácido nicotínico de 200–600 mg g-1 de
sustancia celular seca y ácido pantoténico y
biotina; ácido indolacético (AIA); ácido
giberélico y citoquininas (Rodelas, 2001).
Según González y Lluch (1992) la
producción de estas sustancias por Azotobacter, se ve
influenciada por el estado fisiológico de la bacteria y
por la edad de los cultivos, habiéndose demostrado que la
presencia de nitrógeno combinado modifica la
producción de auxinas y giberelinas. Concretamente la
presencia de nitrato inhibe la liberación de auxinas,
mientras que en sentido contrario incrementa la producción
de giberelinas. La adición de exudados radicales de
ciertos cereales colonizados por Azotobacter, determinan aumentos
significativos en la producción de auxinas, giberelinas y
citoquininas, siendo este efecto más evidente cuando los
exudados se obtienen de plantas de más de 30 días
de crecimiento.
Además de los compuestos mencionados, estos
diazótrofos son capaces de sintetizar sustancias
fungistáticas que, al inhibir el crecimiento de los hongos
fitopatógenos del suelo, promueven indirectamente el
desarrollo de las plantas, especialmente en las etapas tempranas
del cultivo. Estos compuestos tienen acción sobre hongos
pertenecientes a los géneros Fusarium, Alternaria,
Penicillium y Rhizoctonia, variando su acción
antagónica con la cepa bacteriana utilizada (Mayea et al.,
1998; Rodelas, 2001). Mediante su acción conjunta, estas
sustancia son capaces de estimular la germinación de las
semillas y acelerar el crecimiento de las plantas siempre y
cuando sea adecuada la concentración de organismos en la
rizosfera de las plantas.
Martínez et al. (1997) plantean que el efecto de
la inoculación con Azotobacter chroococcum sobre la
germinación y crecimiento de plántulas de tomate
(Lycopersicon esculentum) en suelos Ferralíticos Rojos
resulta coincidente para todas las variedades analizadas. La
población de plántulas por m2 aumentó entre
36% (Cambell-28) y 78% (CI-289-RA) respectivamente, así
como la altura se incrementó en 34% (C-28-V) y 96%
(Nova-2) y el diámetro del tallo entre 37% (C-28-V) y 100%
(Tropical-3). El número de hojas aumentó entre 22%
(Tropical-1) y 42% (Línea-94) y el peso seco de 50
plántulas entre 38% (Nova-2) y 27.6% (Tropical-3). Estos
resultados indican la posibilidad de acortar el periodo que
transcurre entre la siembra del semillero y el momento en que las
plántulas están aptas para el transplante. Estos
resultados coinciden con los analizados por Puertas y
González (1999), donde al estudiar la efectividad de cepas
de Azotobacter chroococcum aisladas de la rizosfera de
plántulas de tomate en suelos Pardos y Vertisoles, se
apreció que todas estimularon en mayor o menor
cuantía, al menos uno de los indicadores
del crecimiento evaluados, lo que sugiere que la
producción de sustancias fisiológicamente activas,
constituye un factor común a dichas cepas. Lo
anteriormente planteado coincide con lo citado por Dibut et
al.(1990); Rodríguez y Blanco (1994); Salazar y
González (1994); Acosta et al. (1995); Dibut et al.
(1995); Soria et al.(1998); Rodelas (2001). En el agrupamiento de
las cepas de acuerdo con su efectividad estimuladora, no
influyó su procedencia, al quedar incluidas cepas aisladas
de un mismo tipo de suelo en grupos
diferentes; esto unido a que la cepa aislada del Vertisol
Pélico fue una de las menos efectiva sugiere que debe
prestarse atención a la capacidad de adaptación de
las cepas de distintos tipos de suelos, así como su
poder de
multiplicación en determinadas condiciones, que a su lugar
de origen (Dibut et al.,1990). En este sentido Abbass y Okon
(1993) encontraron similares resultados, pero con diferentes
cepas de Azotobacter paspali y señalaron que la diversidad
de origen no tiene que estar siempre asociada a la diversidad
genética.
Hammad (1998), en estudios realizados sobre la
eficiencia de la fijación de N2 y la
susceptibilidad a bacteriófagos de Azotobacter chroococcum
libre y encapsulado con alginato, en condiciones controladas (in
vitro) y bajo condiciones de campo (in vivo), en la
Estación Experimental de la Facultad Agrícola de la
Universidad de
Minia, Egipto,
demostró que en condiciones in vitro, las células
encapsuladas exhibieron mayor actividad del sistema nitrogenasa
que en la forma libre. El sistema de encapsulación
ofreció una mayor protección a las bacterias contra
sus fagos. Bajo condiciones de campo, la inoculación de
plantas de maíz (Zea
mays, cv Giza-2) con células encapsuladas,
incrementó marcadamente la población de Azotobacter
chroococcum en la rizosfera y en el rizoplano, así como
incrementó significativamente el porcentaje de
nitrógeno y el peso seco de las plantas en
comparación con los tratamientos inoculados con
células libres. En plantas inoculadas con células
libres, los bacteriófagos tuvieron un marcado efecto
depresivo sobre la población de Azotobacter en la
rizosfera y el rizoplano, reduciendo significativamente el
porcentaje de nitrógeno y el peso seco de las plantas, en
comparación con plantas inoculadas con células
libres en ausencia de fagos.
Varios son los cultivos en los cuales la
aplicación de Azotobacter chroococcum como biofertilizante
ha resultado satisfactoriamente positiva. Rodríguez y
Blanco (1994) realizaron un trabajo experimental en condiciones
semicontroladas en viveros de café
(Coffeea arabica), demostrando que con el uso de Azotobacter
chroococcum hay una mejor uniformidad en las posturas de este
cultivo, así como un mayor vigor de las mismas, las cuales
en el momento de la extracción del vivero hacia el campo
presentaban un color uniforme en
su sistema radicular, características de posturas sanas,
vigorosas y con alto valor ecológico. En este sentido
González et al. (1994) al analizar los resultados de la
inoculación de 8 cepas de Azotobacter sobre los
parámetros de crecimiento y desarrollo de vitroplantas de
piña (Anana comosa), cv Cayena lisa, durante la fase de
adaptación demostraron que en sentido general todas las
cepas estudiadas estimularon el crecimiento de las vitroplantas,
con valores
significativamente superiores al testigo, lo que permite acortar
el periodo de adaptación de las mismas. En el cultivo de
la yuca (Manihot esculenta) Roque et al. (1994) al analizar la
respuesta a la fertilización nitrogenada y su
combinación con biofertilizantes en el clon CMC-40 en
suelo Ferralítico Rojo hidratado, demostraron que los
mejores resultados se obtuvieron con la combinación
biofertilizante-fertilización mineral, destacándose
Azotobacter como biofertilizante. Los máximos rendimientos
en la primera cosecha oscilaron entre 43 y 46 t ha-1, se
alcanzaron al aplicar 100 kg. ha-1 de N con Azotobacter y
fosforina individualmente o combinados.
En papa (Solanum tuberosum) Del Castillo y Montes de Oca
(1994) estudiaron el efecto del uso de bacterias solubilizadoras
de fósforo (P) y fijadores de N2 sobre el
rendimiento de este cultivo en las variedades Atlantic y Desiree
de producción nacional sobre suelos Ferralítico
Púrpura seleccionado con diferentes valores de pH y P
soluble, donde se analizaron diferentes dosis de fertilizantes
minerales a 50 y 100% con aplicación de fosforina (Fb) y
Azotobacter (AZ), solos y combinados en diferentes dosis y
momentos de aplicación. Los resultados obtenidos muestran
que la mejor respuesta a los fertilizantes minerales se
encontró con el 50%, similar a los obtenidos con solo
aplicar AZ; sin embargo los mejores rendimientos se obtuvieron al
combinar el 100% del fertilizante mineral con ambos
biopreparados, con incrementos entre 4 y 5 t ha-1. El pH del
suelo influyó en la cosecha, tanto para AZ como la Fb, con
incrementos del rendimiento donde el mismo era neutro a
ligeramente ácido contra el ácido entre 0.84 a 1.35
t ha-1 respectivamente; mientras cuando se combina el pH neutro
con un contenido de P soluble bajo hay incrementos de 1.10
t.
Otros estudios son los efectuados con combinaciones
microbianas, donde se ha podido comprobar la potenciación
de la estimulación en el crecimiento y demás
parámetros en las plantas con la aplicación de
Azotobacter conjuntamente con hongos micorrizógenos. Un
trabajo realizado a partir de vitroplantas de ñame
(Dioscorea alata L.) var. Criollo Blanco, las cuales durante la
fase de preadaptación fueron sometidas a tratamientos con
2 cepas de MVA (IES–12 e IES–14) inoculadas a
razón de 10 g / planta e inmersión de las
raíces en un biopreparado de Azotobacter sp. al 20%
durante 10 minutos, obtuvieron que la aplicación de
biopreparados favorecieron los parámetros
morfológicos evaluados (número de hojas, longitud
del tallo y el limbo mayor, longitud del peciolo mayor y
número de ramas por plantas) al compararlos con el testigo
sin aplicación, comportándose como mejor
tratamiento la combinación Azotobacter al 20% más
la inoculación de la cepa IES-12 (Glomus caledonicum)
(Andresson et al., 1994). Así mismo Sánchez et al.
(1994) , con el objetivo de
determinar el efecto de 4 cepas de hongos Micorrizógenos
combinados con niveles de Azotobacter sp y 2 proporciones de
humus de lombriz sobre el crecimiento de posturas de café
(Coffeea arabica) producidas por el sistema de moteo con poda de
raíz, determinaron que la combinación Glomus
fasciculatum y Glomus pelú con Azotobacter en la
proporción 5/1 mostró los mayores incrementos con
respecto a la altura, el diámetro del tallo y el
área foliar de las posturas, resultando superiores a los
tratamientos testigos .
En este mismo cultivo Rivera et al. (1997) al analizar
el efecto de la aplicación de Biostin (Azotobacter
chroococcum), simple o coinoculado con MVA en suelos
Ferralítico Rojo de montaña, Fersialítico
Pardo Rojizo y Pardo, obtuvieron que en la mayoría de los
casos la aplicación simple presentó ligeros efectos
positivos cuando se comparó con la conducta del
tratamiento testigo, presentando por tanto un menor efecto que
los encontrados con este bioestimulador en otros cultivos, pero
en ninguno de los casos logra superar los mejores efectos
encontrados con la aplicación de micorrizas VA, lo cual
debe ser consecuencia del tipo de asociación que se
establece en cada caso. Cuando se aplicó el Biostin con
MVA en condiciones de suelo de media-alta fertilidad se
logró incrementar el efecto positivo de las MVA, indicando
que se potencia la
acción de estas y posiblemente como resultante de una
interacción mutualista y complementaria entre estos
microorganismos. El manejo de la coinoculación MVA-Biostin
no varió los criterios obtenidos sobre la relación
óptima suelo/humus, ratificándose la
relación 5/1 para suelos de media-alta fertilidad. En este
caso, la relación 7/1 no resultó adecuada. Sin
embargo, la combinación MVA-Biostin no resultó
apropiada para condiciones de baja fertilidad, donde aun con
sustratos 3/1 produjo efectos depresivos en comparación
con la aplicación simple de MVA.
Días et al. (2000) realizaron un estudio en
suelos Ferralítico Rojo lixiviado típico de
montaña y suelos Fersialítico Pardo rojizo en la
zona del Escambray, con el objetivo de determinar el efecto de
varias cepas de micorrizas y la inoculación de Azotobacter
chroococcum en el cultivo del cafeto. Los resultados arrojaron
que la inoculación simple y combinada de micorrizas y
Azotobacter chroococcum, aunque por lo general resulto positiva,
estuvo determinada por la riqueza del sustrato utilizada,
obteniéndose en todas las variantes los mejores resultados
con la relación 5:1 de suelo-materia orgánica. Con
estas alternativas se logra reducir el costo de producción
de las posturas de cafeto en viveros.
Según lo planteado por estos autores, la
coinoculación de microorganismos en la producción
de posturas de cafeto es perfectamente complementaria y
eficiente; pero necesita de condiciones adecuadas para la
efectividad de la simbiosis micorrízica y que esta
garantice una absorción de nutrientes suficientes para
satisfacer las exigencias de la estimulación. La información obtenida es explicable por
interacciones que se establecen en la micorrizosfera
(Höflich, Wieke y Küah, 1994) y se amplían al
cafeto estos efectos obtenidos en soya (Glycine max), maíz
(Zea mays), tomate (Lycopersicon esculentum) y arroz (Oryza
sativa) (Rivera, 1993; Medina, 1994; Gómez, 1996; Corbera
y Hernández, 1997; Corbera y Nápoles,
2000).
Según Terry et al. (2000), al analizar el efecto
de la aplicación de Azotobacter chroococcum y Hongos
Formadores de Micorrizas Vesículo Albusculares (HFMVA) en
condiciones de organopónico en los cultivos de tomate,
acelga, lechuga, habichuela y rabanito, encontraron una respuesta
positiva de los cultivos a la inoculación, siendo la
coinoculación (Glomus sp.-Azotobacter) la que
brindó los resultados más efectivos; lo que
demuestra que ambos microorganismos funcionaron de forma
sinergística cuando se añadieron
simultáneamente.
8. Fijación
simbiótica de N2
atmosférico.
Dentro de los métodos biológicos de
fijación del N2 atmosférico
también se encuentran las bacterias capaces de realizar
este proceso en simbiosis con formas superiores de vida,
específicamente el género Rhizobium, las cuales
establecen relaciones simbióticas con plantas
pertenecientes a la familia Fabaceae
(Bauer, 2001).
Burdman et al.(1998), plantean que entre los distintos
sistemas biológicos que son capaces de fijar N2
atmosférico, la simbiosis Rhizobium-leguminosa contribuye
con la mayor cantidad de nitrógeno al ecosistema y a la
producción de alimentos. Aunque hay diversas asociaciones
que realizan el proceso de fijación biológica del
N2, en la mayoría de lugares agrícolas
la fuente primaria (80%) del N2 fijado
biológicamente ocurre a través de dicha simbiosis
(Anónimo, 2001 b). Se estima que esta puede oscilar entre
200 y 250 kg. N ha-1 año (FAO, 1995), dependiendo del
nivel de fijación de la especie, del cultivo, suplemento
de agua,
inoculación, condiciones del suelo y la fertilidad. Se
calcula que la fijación de este por las plantas
leguminosas alcanza el 20% de la cantidad total fijada anualmente
sobre el planeta. Esta a su vez constituye la asociación
más elaborada y eficiente entre plantas y microorganismos,
por esta razón ha sido la más estudiada hasta el
momento.
9. Características de
Rhizobium sp.
Según Mayea et al. (1998) y Martínez-Viera
(1986), las especies del género Rhizobium son
quimiorganotróficas y crecen mejor sobre medios complejos
de 25 a 30 oC, todas las cepas utilizan glucosa, galactosa,
fructosa, tiamina y pentatenato de calcio. El hierro (Fe) es
necesario para la síntesis
de hemoproteína, este elemento es un constituyente de la
leghemoglobina, se encuentra presente en la Fe-proteína y
en la Mo-Fe proteína, componentes de la nitrogenasa,
así como en la ferridoxina bacteriana. A pesar de que las
cantidades de este elemento necesarias para el funcionamiento
eficiente de los nódulos son altas, constituye
normalmente, en cantidades absolutas, una pequeña
fracción del total asimilable por las plantas, por ello,
cuando en las leguminosas se observan síntomas de
deficiencias de Fe, podemos estar seguros de que la
simbiosis no se está efectuando y se debe agregar
rápidamente el elemento. La escasez de cationes divalentes
(Ca y Mg) conduce a pérdidas marcadas de viabilidad. La
necesidad de trazas de Co en la síntesis y funcionamiento
de la vitamina B12 se ha considerado como una
interacción que proviene de la toxicidad del Ni o Cu. La
deficiencia de cinc (Zn) tiene un efecto adverso sobre la
nodulación y se observa, sobre todo, cuando hay altos
niveles de fósforo.
Citado por estos autores, cuando falta molibdeno (Mo) se
forman más nódulos, pero son menos eficientes y su
estructura se asemeja a la de los nódulos inactivos, la
dificultad para la asimilación de Mo parece ser una de las
principales limitaciones en la fijación del N2
por el frijol, especialmente en los suelos ácidos se
ha demostrado que, cuando se suministra a estos Mo y Ca, el
frijol es capaz de obtener todo el nitrógeno necesario
para producir 3000 kg. ha-1 de grano.
Uno de los factores más importantes en el
éxito
ecológico de las plantas de la familia Fabaceae es su
capacidad para interaccionar con bacterias del suelo
pertenecientes a los géneros Rhizobium y Bradyrhizobium.
En esta asociación, la bacteria induce en la planta el
desarrollo de un nuevo órgano, el nódulo. Dentro de
este se crea el ambiente
necesario para la fijación de N2
atmosférico por la bacteria que hace a la planta
independiente del nitrógeno del suelo. La formación
del nódulo implica un reconocimiento específico
entre los componentes procarióticos y eucarióticos
de la asociación, la invasión de la célula
de la planta por las bacterias y otros muchos cambios en la
estructura bioquímica de ambos organismos. El análisis genético de la bacteria ha
permitido identificar más de 30 genes, cuya función
es necesaria para el desarrollo de un nódulo fijador de
N2 y que no se necesitan para el crecimiento
vegetativo de la bacteria (González y Lluch,
1992).
Según Aranda et al. (2000 b), la selección
de cepas bacterianas con efecto aditivo se encuentra entre las
tendencias actuales de la biotecnología agrícola. En respuesta
a las bajas concentraciones de ión férrico en el
medio, muchos microorganismos producen y secretan
sideróforos. Aranda et al. (2000 c) plantean que los
producidos por rizobios constituyen una opción factible
para el control de
agentes patógenos de los cultivos hospederos. Estos
compuestos no son más que metabolitos secundarios que
aparecen en la fase estacionaria del crecimiento bacteriano, los
cuales desempeñan un papel
determinante en el biocontrol de patógenos fungosos de la
rizosfera. Estos sideróforos suprimen enfermedades
fungosas por acoplamiento del hierro, convirtiéndose en
factor limitante para el crecimiento del patógeno. Aranda
et al. (2000 a) realizaron un estudio en la provincia de
Holguín con el objetivo de aislar y caracterizar cepas de
rizobios de diferentes agroecosistemas y seleccionar aquellas con
mejores potencialidades en cuanto a la producción de
sideróforos. Los resultados demostraron que todas las
cepas seleccionadas y caracterizadas tenían capacidad para
la biosíntesis de este metabolito. Se
seleccionó la mejor cepa por especie de cultivo para la
evaluación del efecto antagónico
ante la cepa de Rhizoctonia solani, comprobándose la
actividad antagónica de las cepas estudiadas ante el
crecimiento e infección del hongo
fitopatógeno.
10. Factores que afectan
la nodulación y la fijación de N2 en las
leguminosas.
Caba et al. (2001) señalan que los nódulos
radicales de las leguminosas son estructuras
complejas, como ponen de manifiesto los estudios
histológicos y fisiológicos, cuyo desarrollo y
funcionamiento están regulados principalmente por la
planta, la cual controla el número de nódulos
mediante un mecanismo endógeno de retroinhibición o
inhibición "feedback" y que se ha llamado de
autorregulación. Básicamente consiste en que,
iniciado un número crítico de primordios nodulares
se bloquea la división celular en el córtex radical
inhibiéndose el desarrollo de nuevos nódulos. La
nodulación también está controlada por
factores externos entre los que el nitrato del suelo resulta de
especial significación. La inhibición de la
nodulación por el nitrato, una vieja cuestión en el
campo de la simbiosis Rhizobium-leguminosa, no es un efecto
nutricional como en un tiempo se
pensó, sino más complejo, implicando estadios
tempranos en la ontogenia del nódulo de forma similar a la
respuesta de autorregulación pero al contrario que
ésta, se trata de un efecto localizado y no
sistémico. Mediante injertos entre plantas de diferentes
genotipos, mutantes y parentales, se ha demostrado que la
señal autorreguladora procede de la parte aérea
(SDI, shoot derived inhibitor). No obstante, los experimentos de
escisión de nódulos han revelado un mecanismo de
control adicional más tardío en el que los
nódulos maduros suprimen el desarrollo de los estadios
tempranos. Aunque se ha especulado con el ácido
abscísico, como molécula candidata a la
señal autorreguladora, lo cierto es que ésta
permanece aún por identificar. Recientes revisiones sobre
nodulación dan esquemas e hipótesis para conectar las fitohormonas
con la morfogénesis de los nódulos. En los
nódulos radicales de diversas leguminosas se pueden
detectar cuatro tipos de hormonas vegetales, auxinas,
citoquininas, giberelinas y ácido abscísico todas
ellas a concentraciones superiores a las existentes en las
raíces vecinas. Los rizobios producen auxinas ,
citoquininas y giberelinas si bien no se conoce la medida en la
que éstas contribuyen al balance hormonal del
nódulo y por otra parte no parece que su papel en la
nodulación sea muy significativo ya que mutaciones en la
producción de auxinas, por ejemplo, no afectan la
nodulación. Suministradas exógenamente, las
fitohormonas pueden inhibir la formación de los
nódulos, por lo que un posible papel inhibidor para estos
reguladores podría estar en la autorregulación de
la nodulación.
Otra evidencia en favor de la implicación de las
fitohormonas en la organogénesis de los nódulos es
el hecho de que determinadas fitohormonas o bien compuestos que
bloquean el transporte,
inducen la formación de estructuras parecidas a
nódulos (nódulos vacíos o
pseudonódulos). Inhibidores del transporte polar de las
auxinas, como el ácido naftil-ftalámico (NPA),
inducen la formación de pseudonódulos en las
raíces de diferentes leguminosas y estas estructuras
expresan diferentes nodulinas tempranas, ENOD2, ENOD12, ENOD40,
etc. También se ha observado que la aplicación de
citoquininas a la raíz activa la división celular
en el córtex radical en varias especies y que mutantes de
Rhizobium meliloti portadores de gen tzs de Agrobacterium
tumefaciens, que excretan citoquininas, inducen la
formación de nódulos vacíos que expresan
ENOD2 en raíces de alfalfa. No obstante, la
expresión de nodulinas tempranas puede no requerir la
formación de estructuras nodulares como sugieren la
inducción de ENOD2, en raíces de
Sesbania, y de ENOD12 y ENOD40, en alfalfa por aplicación
de bencil adenina (Cooper y Long, 1994, citado por Caba et al.,
2001).
El funcionamiento de la planta hospedadora y el
endófito puede describirse, en términos generales,
como un intercambio de carbono, suministrado por la planta y el
nitrógeno, suministrado por los bacteriodes formados en el
tejido nodular. Adicionalmente, la estructura nodular que se
forma en las raíces, provee una adecuada regulación
del flujo de oxígeno. El proceso de fijación
simbiótica de N2 resulta particularmente
sensible a circunstancias ambientales adversas (Arrese et al.,
1999). Según estos autores, el descenso de la
fijación se relaciona originalmente con una
limitación de aporte de fotoasimilados a los
nódulos. Sin embargo, se ha demostrado que el descenso de
la actividad fijadora precede a efectos detectables sobre la
fotosíntesis. Durante los últimos 15
años, la limitación de la actividad fijadora se ha
relacionado con variaciones en la resistencia de la
difusión de oxígeno en los nódulos; una
menor disponibilidad de este elemento tendría como
consecuencia una limitación en la capacidad de generar ATP
por parte de los bacteroides, que serían incapaces de
mantener la actividad nitrogenasa. La existencia de una
capacidad, por parte de los nódulos, de regular el
intercambio gaseoso, a través de la llamada barrera de
difusión de oxígeno, ha contribuido al
fortalecimiento de dicha hipótesis. Sin
embargo se ha demostrado recientemente que el incremento del
oxígeno en la rizosfera no es capaz de restaurar
completamente la actividad fijadora inhibida por causas
ambientales. La capacidad metabólica de los nódulos
puede ser modificada debido a descensos en la actividad sacarosa
sintasa, lo que conduce a una acumulación de sacarosa y
una falta de sustratos respirables para los bacteroides. Como
consecuencia de esta situación, los nódulos
restringirían el flujo de oxígeno para evitar la
inhibición irreversible de la nitrogenasa.
Luque et al. (1999) plantean que la nodulación de
las leguminosas es un proceso regulado por factores internos
(autorregulación) y externos (fundamentalmente nitratos) y
se ha sugerido la existencia de algún componente
común compartido por ambos tipos de regulación de
la nodulación. Experimentos realizados por estos autores,
apoyan al etileno endógeno como posible candidato mediador
en el control de la formación de nódulos y en la
inhibición por nitratos. En este trabajo se estudió
la distribución de la nodulación en
raíces de soja (Glycine max) cv Bragg y su posible
relación con la biosíntesis de etileno
(producción de etileno y contenido de ACC, precursor
inmediato de la fitohormona en tejidos
vegetales) en distintas zonas de las raíces de las
plantas. Los resultados obtenidos demuestran la hipótesis
anteriormente planteada. Las tasas de producción de
etileno de las distintas fracciones fueron sin embargo superiores
a las encontradas en raíces intactas y no se
correlacionaron con los nódulos que se formaron en cada
caso. En cuanto al contenido de ACC, las diferencias entre
fracciones y raíces intactas fueron menores que para las
tasas de producción de etileno. Además, el
contenido de ACC se correlacionó mejor con la
nodulación en cada fracción y fue
significativamente mayor en las fracciones de raíces
inoculadas, especialmente a 48 h tras la inoculación.
Estos resultados coinciden con los apuntados por Caba et al.
(2001), los que señalan que el etileno exógeno es
un potente inhibidor de la nodulación pero la raíz
inoculada y sobre todo los nódulos, producen
significativamente más etileno que la raíz no
inoculada, siendo ese etileno de origen vegetal. El nitrato del
suelo, por un mecanismo aún desconocido, es un efectivo
inhibidor de la nodulación de las leguminosas.
Paradójicamente el nitrato, un nutriente y no un estrés,
incrementó significativamente la producción de
etileno en raíces de alfalfa (Medicago sativa) inoculadas
encontrándose una relación inversa entre las tasas
de liberación de etileno y la nodulación que se
desarrolló sobre esas raíces sugiriendo que el
efecto inhibidor del nitrato podría estar mediado por el
etileno. Esta hipótesis resultó fuertemente apoyada
cuando al tratar plantas de alfalfa, inoculadas en presencia de
nitrato, con aminoetoxivinilglicina (AVG), inhibidor
específico de la biosíntesis de etileno, la
liberación de etileno descendió en un 80-90% y la
inhibición de la nodulación fue revertida.
Adicionalmente, en este estudio, se puso de manifiesto que en
condiciones de no inhibición, el tratamiento con AVG
también incrementó el número de
nódulos confirmando anteriores resultados para la misma y
otras especies e indicando un papel inhibidor del etileno
endógeno en la nodulación. Finalmente, la
incapacidad de ciertos mutantes Exo de Rhizobium leguminosarum
para nodular Vicia sativa ssp nigra, ha sido atribuida al etileno
producido por la raíz en respuesta a la inoculación
(Caba et al., 2001).
Así mismo, Caba et al. (1999) plantean que la
producción de etileno se incrementa significativamente en
las raíces de leguminosas inoculadas, así como
también la aplicación de etileno exógeno
inhibe la nodulación, y el tratamiento con inhibidores de
la formación o la percepción del etileno favorece
la formación de nódulos radicales. Según
estos autores un estudio sobre el efecto del etileno
exógeno aplicado en diferentes situaciones sobre la
nodulación del mutante de soja nts 382 y el parental Bragg
en condiciones controladas, tratadas con etileno en forma de ACC,
demostraron que el efecto inhibidor del etileno se ejerce en un
estadio temprano del desarrollo del nódulo y que los
meristemos que progresan crecen y se desarrollan más
rápidamente, dando nódulos con una mayor masa. La
inhibición de la nodulación en las diferentes
situaciones estudiadas fue siempre considerablemente mayor en el
parental Bragg respecto al mutante nts, sugiriendo una mayor
sensibilidad al etileno en este último. A nivel de planta
entera, sin embargo, no se encontraron diferencias significativas
apreciables en la capacidad para responder al etileno entre ambos
genotipos.
11. Aplicación
práctica de Rhizobium sp. en cultivos de frijol
común (Phaseolus vulgaris L.).
Martínez-Viera (1986), reporta que la respuesta a
la inoculación del frijol en condiciones de campo es
variable, y son frecuentes las respuestas negativas. En trabajos
realizados se han obtenido aumento en los rendimientos hasta de
98.6 % con tres cepas de seis probadas. El crecimiento de las
plantas fue similar al de lotes que recibieron 50 t de N ha-1,
mientras los lotes no inoculados mostraron síntomas claros
de deficiencia. En lo que respecta a la fijación, se han
reportado cantidades de reducción del acetileno en las
plantas hasta de 30 mol C2 H4 h-1
considerándose comunes en las simbiosis efectivas
cantidades superiores a 20 mole. A pesar de estos resultados que
indican una elevada efectividad de la simbiosis se han reportado
notables porcentajes de plantas noduladas sin inoculación
en distintas regiones, tales como en el Medio Oeste de Estados Unidos,
al igual que en Río Grande do Sul y Sao Paulo (Brasil),
principalmente en cultivos comerciales de frijol (Phaseolus
vulgaris). En Cuba el porcentaje de plantas no inoculadas con
nódulos ha oscilado entre 15 y 25 %. Esta
nodulación natural no significa efectividad en la
fijación, como lo indica el hecho de que en una
evaluación de 85 cepas aisladas de nódulos formados
naturalmente en plantas de frijol, solo 14 % fueron eficientes,
69 % moderadamente eficientes y 17 % ineficientes.
Según González y Lluch (1992), con la
aplicación de Rhizobium en suelos con bajo contenido de
nitrógeno se puede aumentar los rendimientos de plantas
leguminosas. Sin embargo los inoculantes para leguminosas no se
ha demostrado que sean efectivos en suelos con razas
autóctonas, una limitación de este sistema es la
competición. Inóculos preparados con razas muy
efectivas en la fijación de N2 se ha visto que
son incapaces de formar una proporción significativa de
nódulos en situación de campo por la
competición con las cepas autóctonas.
Arcocha et al. (1994) señala que la respuesta del
cultivo del frijol a la inoculación con cepas comerciales
de Rhizobium ha sido inconsistente, por lo cual se hace necesaria
la evaluación de nuevas cepas, además de evaluar el
efecto de la fertilización inorgánica con
fósforo (P) sobre estas. En estudios realizados sobre la
inoculación de cepas de Rhizobium contra
fertilización química en frijol ejotero,
demostraron que al evaluar 7 cepas experimentales de
biofertilizantes Mexicanos y una comercial (Nitrobiol) bajo una
dosis constante de P (40 kg. ha-1), incluyendo 3 tratamientos
adicionales resultantes de la combinación de 60 kg. ha-1
de N y 40 kg. ha-1 de P, más un testigo, obtuvieron una
respuesta positiva con el uso de este biofertilizante. Las
variables
medidas fueron: rendimiento de ejotes, peso de nódulos,
número de nódulos, peso del follaje y peso de la
raíz. Los rendimientos obtenidos con la cepa más
sobresaliente (FM 110 + P) fueron similares a los obtenidos con
el tratamiento de fertilizante químico (60-40-00). Sin
embargo las utilidades fueron ligeramente mayores con las cepas
de Rhizobium. El efecto de las cepas analizadas se reflejó
en un incremento de 2460 kg. ha-1 de ejotes en relación
con los tratamientos de fertilizantes 00-40-00 y 00-00-00, y un
incremento de 4478 kg. ha-1 de ejotes en relación al
tratamiento 60-00-00.
Producto de la baja capacidad de formación de
nódulos radicales y la escasa fijación de
N2 del frijol común, es que se recurre
normalmente en países desarrollados y otros a la
fertilización mineral de este. Montes (1999) señala
que los fallos en la nodulación de este cultivo se deben
con cierta frecuencia al alto nivel de nitrógeno residual
procedente de cultivos anteriores, lo que actúa inhibiendo
la formación de los nódulos. Sin embargo, los
efectos resultantes de la absorción de nitratos sobre la
disponibilidad de otros nutrientes no han sido valorados,
habiéndose detectado deficiencias foliares de algunos
nutrientes (P, B, Zn, etc.), en particular, en cultivos
fertilizados con nitrógeno mineral. La absorción de
nitratos lleva aparejado un aumento del pH rizosférico que
puede reducir la disponibilidad de algunos nutrientes como el P.
Las condiciones de baja disponibilidad de este último
reducen la fijación de N2 por efectos
específicos en la iniciación y crecimiento del
nódulo y la actividad nitrogenasa, así como
también reduce la absorción y transporte de
nitratos desde las raíces a la parte aérea de la
planta. Este autor llevó a cabo un trabajo con el objetivo
de evaluar la respuesta del frijol común cv. Canellini a
la inoculación con Rhizobium spp. en condiciones de
distinta disponibilidad de P y N, además de dilucidar
algunos aspectos de la compleja interacción entre P y N, y
algunos de los posibles factores limitantes a la fijación
simbiótica de N2 en este cultivo. El efecto
sobre la fijación simbiótica se estudió
considerando número y tamaño de nódulos y el
transporte de ureidos en savia. También se evaluó
la capacidad de asimilación de NO3 del sistema
radical a través de los cambios en la concentración
de aminoácidos y NO3 en savia. Los resultados
arrojaron una respuesta poco significativa de la biomasa
aérea y radical al incremento de P en solución, a
pesar de determinarse concentraciones indicativas de deficiencia
foliar de P. Con baja concentración de NO3 (1
mM), el incremento de P (de 0.01 a 2 mM) mejoró la
nodulación y se produjo un aumento de la
concentración de ureidos y aminoácidos en savia. Es
de destacar la elevada concentración de NO3
detectada en savia de plantas cultivadas con 0.01 mM de P y 1 mM
de N, debida posiblemente, a una menor capacidad de
asimilación de NO3 en las raíces. Cuando
la concentración de NO3 era elevada (10 mM),
los mismos incrementos de P no mejoraron la nodulación del
frijol. En plantas bien noduladas (en presencia de 1 mM de
NO3) el principal aminoácido exportado por el
xilema era glutamina, y en menor cuantía aspartato y
asparagina. El aumento del P incrementó de modo notable la
concentración de glutamina, que junto con los ureidos,
constituyen la principales formas de nitrógeno
orgánico transportadas en condiciones de activa
fijación simbiótica de N2. En plantas
escasamente noduladas (en presencia de 10 mM de NO3),
el aumento del P incrementó la concentración de
asparagina en savia del xilema, al tiempo que reducía la
concentración de NO3.
Resultados similares son los obtenidos por Huerta et al.
(2001), los cuales al comparar el efecto de la inoculación
con Rhizobium leguminosarum biovar. phaseoli y la
fertilización nitrogenada, en la producción de
biomasa, rendimiento y sus componentes en 38 genotipos de frijol
común (Phaseolus vulgaris L.), encontraron que en la
mayoría de los genotipos se observó mayor peso
individual de semilla y número de granos por vaina con la
inoculación; en contraste, la fertilización
nitrogenada favoreció una mayor producción de
vainas por planta y número de granos por planta, y por
ende mayor rendimiento de grano y biomasa. No obstante, hubo
algunos genotipos que rindieron igual al ser inoculados que al
ser fertilizados.
Hernández et al. (2000) al evaluar 200 cepas de
Rhizobium, 2000 genotipos de frijol común y 4
fertilizantes fosfóricos preparados a partir de roca
fosfórica nacional, en diferentes periodos y
diseños experimentales según correspondiera la
etapa de trabajo, obtuvieron dos cepas de Rhizobium (6bIII y
12bIII), dos genotipos de frijol común contrastantes en
términos de eficiencia a la fijación
simbiótica del nitrógeno y a la tolerancia al
virus del Mosaico Dorado del frijol (BAT 477 y DOR 364) y un
fertilizante fosfórico (PSP-50). Los tres insumos, cepas,
genotipos y fertilizantes, forman parte de una tecnología integral
para la producción de frijol común, la cual permite
ahorrar como promedio 118 kg. N ha-1, genotipos de frijol
común tolerantes al virus del Mosaico Dorado del frijol e
incrementos en los rendimientos en un 15% respecto a los
rendimientos promedio tradicionales y un fertilizante
fosfórico que aumenta la eficiencia de uso entre un 3 y
7%.
La aplicación de inoculantes en suelos salinos ha
sido objeto de estudio de varios investigadores. López y
González (2000) reportan que del total de suelos de
nuestro país más de 1 millón
hectáreas están afectadas por la salinidad, siendo
el Valle del Cauto el área más significativamente
afectada por esta problemática. Estos autores realizaron
un trabajo en esta zona, con el objetivo de aislar y determinar
la tolerancia a la salinidad de cepas de Rhizobium en 12
leguminosas. Los resultados demostraron una fuente importante de
genes en lo referente a la tolerancia a la salinidad en cepas de
Rhizobium, además de construir un paso de avance en la
conservación de la biodiversidad de cepas de Rhizobium
nativas de un área bajo stress
salino.
Abdelkhalek et al. (1999), señalan que la
disponibilidad de mutantes de Rhizobium tolerantes a la salinidad
son importante para dilucidar los mecanismos de tolerancia y su
relación con la eficiencia de la fijación de
nitrógeno. Estos autores realizaron un trabajo donde
obtuvieron cepas tolerantes a la sal, isogénicas de la
cepa de R. etli CFN42, cepa muy sensible a concentraciones bajas
de cloruro sódico, y se comparó su eficiencia
fijadora de N2 en simbiosis con Phaseolus vulgaris. Se
inocularon plantas de frijol común con la cepa silvestre
CFN42 o sus mutantes CFNH1, CFNH5 y CFNH6, y se estudió el
efecto de la aplicación de diversas dosis de NaCl a 0, 25
y 50 mM desde el inicio del cultivo, para evaluar el efecto sobre
el crecimiento de la planta y la fijación
simbiótica de N2. Los parámetros
determinados como peso seco de parte aérea (PSPA), peso
seco de raíz (PSR) peso seco por planta (PSP),
relación raíz parte aérea (RPA), peso seco
de nódulos (PSN), peso normalizado por nódulos
(PNN), actividad reductora de acetileno (ARA) y actividad
reductora de acetileno por planta (ARAP), pusieron en evidencia
una mejora en el crecimiento y en la fijación de
N2 en las plantas inoculadas con las cepas mutantes en
comparación con las inoculadas con la cepa silvestre,
tanto en ausencia de sal como en presencia de concentraciones
intermedias de cloruro sódico. Los resultados globales
indican una relación directa entre la tolerancia a la sal
de la bacteria y la eficiencia fijadora de N2 y el
crecimiento de P. vulgaris en condiciones de salinidad, y ponen
de manifiesto la importancia del microsimbionte en la tolerancia
de la planta al estrés salino.
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