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Técnicas de separación. aplicaciones

Enviado por teresa1925



Indice
1. Métodos de separación. Introducción
2. Los métodos cromatográficos
3. Electroforesis Convencional
4. Electroforesis Capilar (CE)
5. Bibliografía

1. Métodos de separación. Introducción

Desde el siglo pasado las separaciones analíticas se llevaban a cabo por métodos clásicos como son la precipitación, destilación y extracción. Los crecientes esfuerzos por conocer más sobre la composición y función de las proteínas han obligado a los científicos a buscar técnicas, cada vez, más precisas.
Para elegir una técnica de separarción, además de tener en cuenta los criterios económicos y de accesibilidad, hay que atender a dos tipos de consideraciones: unas tienen que ver con las propiedades físicas y estructurales de las moléculas que se pretende separar, o de las características de la matriz en que se encuentran; otras se derivan de los objetivos del análisis (sensibilidad, resolución, tiempo de análisis, necesidad de una detección específica).
El método de selección incluye los pasos necesarios para la obtención, preparación y posible fraccionamiento de la muestra, la aplicación de la técnica analítica adecuada y el tratamiento de los datos obtenidos.
Las técnicas analíticas más empleadas en la actualidad pueden englobarse en dos grandes grupos: técnicas de separación y técnicas espectroscópicas. Las técnicas espectroscópicas proporcionan, para cada compuesto analizado, una información compleja, relacionada con sus características estructurales específicas, por otro lado las técnicas de separación se utilizan para resolver los componentes de una mezcla y la señal obtenida puede utilizarse con fines analíticos cuantitativos o cualitativos.
Es precisamente en las técnicas de separación en las que basaremos la revisión bibilográfica del presente trabajo, debido a su amplio uso en el campo de la Biotecnología, Biología Molecular y Bioquímica entre otras ramas de la investigación.
Actualmente las separaciones analíticas se realizan fundamentalmente por cromatografía y electroforesis.
La cromatografía comprende un conjunto importante y diverso de métodos que permite a los científicos separar componentes estrechamente relacionados en mezclas complejas, lo que en muchas ocasiones resulta imposible por otros medios. Se pueden separar moléculas en función de sus cargas, tamaños y masas moleculares. También a través de la polaridad de sus enlaces, sus potenciales redox, etc.
La cromatografía no solo permite la separación de los componentes de una mezcla, sino también su identificación y cuantificación. El análisis cualitativo está basado en la medida de parámetros cromatográficos (tiempos y volúmenes de retención) mientras que el análisis cuantitativo está basado en la medida de alturas o áreas de picos cromatográficos que se relacionan con la concentración. La columna cromatográfica y la forma con la que se diseña, constituye el corazón de la separación. El detector, situado al final de la columna es el que garantiza la respuesta de los componentes que se separan.
En todas las separaciones cromatográficas la muestra se desplaza con una fase móvil, que puede ser un gas, un líquido o un fluido supercrítico. La fase móvil puede pasarse a través de una fase estacionaria, con la que es inmiscible y que se fija a una columna o a una superficie sólida. Las dos fases se eligen de forma, que los componentes de la muestra se distribuyen de modo distinto entre la fase móvil y la fase estacionaria. Aquellos componentes que son fuertemente retenidos, por la fase estacionaria se mueven lentamente con el flujo de la fase móvil; por el contrario los componentes que se unen débilmente a la fase estacionaria, se mueven con rapidez. Como consecuencia de la distinta movilidad, los componentes de la muestra se separan en bandas o zonas discretas que pueden analizarse cualitativa y/o cuantitativamente. Estos resultados se recogen en forma de gráficos llamados cromatogramas.
Los métodos cromatográficos se pueden clasificar según la forma en que la fase móvil y la fase estacionaria se pongan en contacto. Así en la cromatografía de columna, un tubo estrecho contiene la fase estacionaria a través de la cual se hace pasar la fase móvil por presión. En la cromatografía en plano, la fase estacionaria se fija sobre una placa plana o a los intersticios de un papel; en este caso la fase móvil se desplaza a través de la fase estacionaria por capilaridad o por gravedad.
Las tres clases de cromatografía desde un ángulo más general son cromatografía de líquidos, cromatografía de gases y cromatografía de fluidos supercríticos. Como su nombre lo indica, la fase móvil en las tres técnicas son líquido, gas y fluido supercrítico respectivamente.
Solo la cromatografía de líquidos es la que puede llevarse acabo en columna o sobre superficies planas, por otra parte tanto la de gas como la de fluidos supercríticos están restringidas a los procedimientos en columna de tal manera que las paredes de la columna contienen la fase móvil.
La técnica más usada es la cromatografía líquida de alta resolución, HPLC por su sensibilidad, fácil adaptación a las determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad para la separación de especies no volátiles o termolábiles y su aplicación a sustancias de primordial interés en la industria, como son los aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos, entre otros. Se ofrece a continuación un esquema relativo a este método de separación:

2. Los métodos cromatográficos

La cromatografía líquida la podemos diferenciar en cuatro grupos:

  • C. de reparto: separa los solutos basándose en la solubilidad
  • C. de adsorción: se basa en la afinidad de adsorción
  • C. de exclusión: separa solutos según el peso molecular
  • C. de intercambio iónico: separa solutos según la carga iónica

Cromatografía de reparto
La cromatografía de reparto está formada por la cromatografía Líquido-Líquido y la cromatografía unida químicamente. Estas técnicas se diferencian en la forma en que se retiene la fase estacionaria sobre las partículas del soporte relleno. En el segundo caso, como su nombre lo indica, la fase estacionaria se une químicamente a la superficie del soporte. Esta técnica actualmente es más usada debido a que la cromatografía líquido-líquido necesita de un recubrimiento periódico de las partículas del soporte debido a la pérdida de la fase estacionaria por disolución en la fase móvil.
En general los soportes para casi todos los rellenos de fases unidas químicamente se preparan con sílice rígida o composiciones donde la sílice es el elemento básico. Estos sólidos están formados por partículas mecánicamente resistentes, porosas y uniformes.
Los rellenos de columna en la cromatografía de fase unida químicamente se clasifican como de fase inversa cuando el recubrimiento enlazado tiene carácter no polar, y de fase normal cuando el recubrimiento contiene grupos funcionales polares.
Esta técnica puede utilizarse en la separación de mezclas edulcorantes artificiales, antioxidantes, aflatoxinas, bebidas refrescantes entre otras.

Cromatografía De Adsorción
La cromatografía de adsorción o Líquido-Sólido es la forma clásica de la cromatografía de líquidos. Ha sufrido algunas transformaciones que la han convertido en un método importante de la HPLC.
Las únicas fases que se utilizan en este tipo de cromatografía son la sílice y la alúmina, siendo la primera la preferida.
Es adecuada para compuestos no polares probablemente con masas moleculares inferiores a 5 000. Los métodos de la cromatografía de adsorción y reparto tienden a ser complementarios, aunque en algunos casos se superponen.
En general la cromatografía Líquido-Sólido es más adecuada para muestras que son solubles en disolventes no polares y por ello tienen solubilidad limitada en disoluciones acuosas que son las que se utilizan en cromatografía de reparto en fase inversa. En este tipo de cromatografía también se pueden separar compuestos con diferentes grupos funcionales. Una característica particular de este método es su capacidad para diferenciar compuestos isómeros en mezclas.

Cromatografía De Exclusión
La cromatografía de exclusión, también llamada de filtración en gel o cromatografía de permeación en gel, se basa en la diferencia de penetración de las moléculas en los poros de la fase estacionaria debido a que la separación obtenida depende del tamaño de la molécula. El tiempo de elución es proporcional al peso molecular de los mismos, por lo que no es muy usada con los compuestos de alto peso molecular. Este tipo de separación por tamaño difiere de las demás técnicas de cromatografía en que no existen interacciones físicas o químicas entre el analito y la fase estacionaria. Es una técnica reproducible, escalable y rápida.
La fase fija está formada por partículas poliméricas o de sílice que contienen una red uniforme de poros por los que pueden penetrar las moléculas de pequeño tamaño. Las moléculas de tamaño grande se excluyen totalmente y son eluidas en primer lugar, mientras que las de pequeño tamaño tienen acceso a todo el volúmen poroso y son las últimas que se eluyen; de esto se deduce que el volúmen disponible para las moléculas pequeñas es mayor que para las grandes. Por lo tanto las moléculas se eluyen por su tamaño decreciente. En resumen los factores que determinan la separación de las moléculas son el tamaño del poro, el tamaño de la partícula y el flujo de elución.
Los diferentes tipos de partículas usadas deben ser estables, mecánica y químicamente, tener bajo contenido en grupos iónicos, uniformidad de poro y tamaño. Los compuestos pueden ser derivados de dextranos (Sephadex), derivados de agarosa (Sepharosa), derivados de acrilamidas (Biogel P) y esferas de vidrio. Hay diferentes tamaños de partícula para un gel: a menor tamaño mayor resolución y menor gasto en la columna.
Este técnica se emplea en la separación de proteínas de alimentos, determinación de glucosa y fructosa en zumos de fruta, etc.

Cromatografía De Intercambio Iónico
La cromatografía de intercambio iónico está basada en la atracción entre iones del soluto y puntos cargados que existen en la fase estacionaria. En el caso de intercambiadores aniónicos, grupos cargados positivamente en la fase estacionaria atraen aniones del soluto. Los intercambiadores catiónicos contienen puntos cargados negativamente que atraen cationes del soluto.
Los intercambiadores iónicos se clasifican en ácidos o básicos, fuertes o débiles. Las resinas ácidas fuertes siguen ionizadas incluso en disoluciones muy ácidas, en cambio las resinas ácidas débiles se protonan a un pH próximo a 4 y pierden su capacidad de intercambio catiónico. Los grupos muy básicos de amonio cuaternario siguen siendo catiónicos a cualquier valor de pH. Los básicos débiles de amonio terciario se desprotonan en disoluciones moderadamente básicas y pierden entonces su capacidad.
Las resinas de intercambio iónico tienen aplicación en estudios donde intervienen moléculas pequeñas (PM=500) que pueden penetrar en los poros pequeños de la resina. Los intercambiadores iónicos de poliestireno son tan grandes que las macromoléculas muy cargadas, como las proteínas, se pueden enlazar irreversiblemente a ellos. Los de celulosa y dextranos sirven para intercambio iónico de macromoléculas. Los geles de intercambio iónico se usan en el caso de moléculas grandes (proteínas y ácidos nucleicos). Cuando las separaciones exigen condiciones químicas fuertes se emplean intercambiadores iónicos inorgánicos.
En resumen la gran variabilidad de los métodos cromatográficos se debe a las diferentes condiciones que pueden utilizarse para separar los componentes de una sustancia.
Todas estas técnicas tienen en común la existencia de una fase estacionaria a través de la cual fluye una fase móvil, así como la presencia de un mecanismo de inyección de la muestra y un mecanismo de detección de los diferentes componentes separados.
La electroforesis fue desarrollada por primera vez por el químico sueco Arne Tiselius, merecedor del Premio Nobel en 1948 por sus trabajos realizados en esta esfera.
La electroforesis es una técnica analítica de separación de fundamento cinético basada en el movimiento o migración de las macromoléculas disueltas en un determinado medio (solución tampón de electroforesis), a través de una matriz o soporte reticulado como resultado de la acción de un campo eléctrico. El comportamiento de la molécula viene dado por su movilidad electroforética y ésta por la carga, tamaño y forma de la misma. Cuanto mayor es la relación carga/tamaño más rápido migra un ión en el seno del campo eléctrico.
Esta técnica tiene como ventaja su capacidad de separar macromoléculas de interés en la industria biotecnológica y química. Ha sido un método muy útil para la separación de proteínas (enzimas, hormonas) y ácidos nucleicos (DNA y RNA) con gran resolución.
En un sistema electroforético pueden originarse distintos fenómenos que afectan la separación de las sustancias:

  • Difusión

Este fenómeno es provocado por la existencia de gradientes de concentación que favorecen el transporte hacia las zonas de menor concentaración de cada especie. Afecta tanto a partículas cargadas como no cargadas. Las moléculas tienden a moverse de una forma aleatoria debido a que poseen energía cinética propia. Esto es lo que se denomina difusión. Con un aumento de la temperatura aumentará la difusión por un incremento de la energía cinética.

  • Migración

Es el movimiento producido por una fuerza externa que es impuesta al medio, en este caso, el campo eléctrico y su intensidad.

  • Flujo térmico

Al pasar una corriente eléctrica a través de un sistema que origina una resistencia dada, se produce calor. Por tanto el sistema electroforético no es isotérmico. En general la fase líquida se mueve hacia las zonas de menor temperatura, lo que origina un transporte de las partículas de interés no debido a la migración.

  • Fricción

La fricción con el solvente dificultará el movimiento (es decir, al moverse los solutos chocarán con las moléculas del solvente que están en su camino), lo que genera una fuerza que se opone al movimiento.
La suma de todos estos factores provoca que las moléculas no migren de una manera uniforme, de modo que, si las moléculas son colocadas en un cierto lugar de la solución, los iones comenzarán a moverse formando un frente cuya anchura aumentará con el tiempo. Para reducir esta anchura podemos reducir el movimiento de las moléculas empleando un medio que oponga más resistencia a dicho movimiento.
Esta situación nos permite diferenciar dos métodos electroforéticos:

  • Electroforesis convencional
  • Electroforesis capilar.

3. Electroforesis Convencional

La electroforesis convencional ha sido utilizada durante muchos años para separar especies complejas de elevado peso molecular de interés biológico y bioquímico. Las separaciones se llevan a cabo sobre una capa delgada y plana o placa de un gel semisólido y poroso que contiene un tampón acuoso en el interior de sus poros. Esta será la sustancia encargada de ofrecer resistencia al movimiento de las moléculas, controlando así su migración uniforme.
Mediante esta técnica se pueden separar varias muestras simultáneamente. Dichas muestras se depositan sobre el gel, se aplica un potencial de corriente continua a través del mismo durante un tiempo fijo. Cuando las separaciones se han completado se interrumpe el paso de corriente y las especies separadas se tiñen para visualizarse.
La electroforesis en gel es muy utilizada en la detección, control de pureza, caracterización, cuantificación (por comparación con controles) así como preparación y purificación (por extracción de bandas desde el gel) de moléculas y fragmentos de DNA y RNA.
Los geles que se emplean son geles tridimensionales de polímeros ramificados que tienen los espacios entre ramificación rellenos de líquido. Las redes de polímeros no solo reprimen la convección sino que también actúan como cribas que pueden retardar y hasta bloquear la migración de los analitos poliméricos más grandes. En cambio los iones pequeños pueden moverse libremente a través de la estructura porosa del gel. De este modo la electroforesis en gel tiene dos mecanismos de separación: electroforesis, que separa por la relación carga/tamaño y tamizado, que separa mayormente por tamaño. Los geles más comunes son agarosa y poliacrilamida.
La agarosa es un polímero derivado de un polisacárido neutro, que gracias a su poder de gelificación y propiedades físico-químicas, lo han convertido en el soporte más común para electroforesis en el área de Biología Molecular. La poiliacrilamida es un polímero formado a partir de acrilamida y N,N´ metilenbisacrilamida. La concentración de ambos reactivos define el grado de reticulación del gel.
Ambos geles tienen en común que adquieren la misma forma y están prácticamente libres de cargas iónicas. Esto es importante para evitar que la disolución tampón se desplace por el gel cuando se active el campo eléctrico.
A continuación se ofrece un esquema con los aditamentos necesarios para realizar esta técnica de separación:
Este tipo de electroforesis es ampliamente utilizado en la esfera biotecnológica, aspecto este que se ha podido comprobar a partir de los numerosos resultados que se encuentran en la literatura más actual.
Existen otros tipos de electroforesis en gel como son la electroforesis en geles desnaturalizantes de agarosa, electroforesis en campo pulsado y la electroforesis preparativa. Estas técnicas no son de aplicación tan general pero no por ello dejan de ser importantes.

4. Electroforesis Capilar (CE)

La electroforesis capilar es una técnica alternativa de la electroforesis convencional y surge debido a que la velocidad de separación y resolución de los compuestos mejora a medida que aumenta el campo eléctrico aplicado. Esta afirmación no nos permite aumentar el potencial, aun sabiendo que existe una dependencia directa de éste con el campo eléctrico. Esto se debe a que el calentamiento de Joule aumenta hasta afectar la calidad de la separación. Para solucionar esta dificultad es que se realiza la electroforesis en un tubo capilar con un diámetro interno inferior a 0,1 mm y una longitud de 50 cm a 1 m. Esta técnica está representada en el siguiente esquema:
El mecanismo de separación está basado en las relaciones carga/masa de los analitos. Su utilidad está en la separación de proteínas y péptidos entre otras sustancias.
Entre las ventajas que ofrece la electroforesis capilar se puede apuntar que da lugar a separaciones con volúmenes de muestra extraordinariamente pequeños (de 0,1 a 10 nL), en contraste con la electroforesis convencional en la cual se emplean volúmenes de muestra en el orden de los µL, con una elevada resolución y rapidez. Ofrece además mayor facilidad y velocidad que la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).
Esta técnica elimina el problema de los solventes de la HPLC, la toxicidad de los mismos y su costo, pues emplea soluciones acuosas en su gran mayoría con muy baja concentración iónica, incorpora los principios de la automatización a través de un hardware creado especialmente con un software altamente optimizado, aunque la reproducibilidad en el análisis cuantitativo es peor.
Como las especies separadas eluyen de uno de los extremos del capilar, se pueden utilizar detectores cuantitativos como los empleados en HPLC. Como resultado se obtiene un electroferograma con picos característicos de cada compuesto separado. En realidad ambas técnicas son complementarias al basarse en mecanismos de separación diferentes.

Podemos diferenciar varios tipos de electroforesis capilar:
La electroforesis capilar en gel combina la técnica de electroforesis con la cromatografía de reparto. Permite la separación en función de la migración electroforética y también en función del peso molecular de las muestras. Se lleva a cabo en una matriz polimérica con estructura de gel poroso, cuyos poros contienen una mezcla tampón donde ocurre la separación. Estos geles están contenidos en un tubo capilar. Los geles utilizados son también de agarosa y poliacrilamida.
Electroforesis capilar de zona: es una de las técnicas más importantes y más utilizada debido, probablemente a su simplicidad y elevado poder de separación. Está basada en la separación de los analitos según la relación carga/tamaño.
En esta técnica la composición del tampón es constante en toda la zona de separación. El potencial aplicado hace que los diferentes componentes iónicos de la mezcla migren cada uno según su propia movilidad y se separen en zonas que puedan estar completamente resueltas o parcialmente solapadas. Entre las zonas completamente resueltas hay huecos ocupados por el tampón. Su principal inconveniente es que no permite separar los compuestos neutros.
Enfoque isoeléctrico: la diferencia de los puntos isoeléctricos de las proteínas se aprovecha para separarlas por el método de isoelectroenfoque. Este método se basa en establecer un gradiente de pH estable en una disolución o gel. Este gradiente se establece por un conjunto de tampones especiales llamados anfolitos que migran por sí mismos hasta que alcanzan sus puntos isoeléctricos. Cuando al gradiente de pH se le introduce una proteína, cada zona intercambia protones con la muestra proteica, generando una separación isoeléctrica conocida como electroenfocado.
La isotacoforesis significa electroforesis a velocidad uniforme. Esto significa que el tiempo de recorrido en el capilar bajo condiciones isotacoforéticas es independiente de la velocidad. Es una técnica de separación por desplazamiento.
Antes de iniciar la corrida, el capilar se debe llenar con un electrolito líder o guía en un extremo. Este debe tener una gran movilidad y debe ser mayor que la de los componentes a separar. Luego se introduce la muestra seguida del electrolito terminal o cola, cuya movilidad debe ser menor que cualquiera de los componentes de la muestra. La selección de los electrolitos guías y terminales depende del conocimiento de los valores de las movilidades y del pKa para todos los componentes de la muestra.
En la isotacoforesis las bandas siempre están en contacto con la zona adyacente. Esta característica es necesaria para mantener la continuidad eléctrica a lo largo del sistema, dado que no hay un electrolito de soporte.
Esta técnica puede ser utilizada para determinar cationes y aniones. Se requiere usualmente corridas separadas para determinar cada forma iónica.
La electrocromatografía capilar es un híbrido entre la HPLC y la CE donde se reúnen algunas de las mejores características de cada técnica por separado, por lo que tiene ventajas sobre ellas. De esta manera la electrocromatografía capilar puede usarse para la separación de especies no cargadas. Proporciona una elevada eficacia en las separaciones de microvolúmenes de disolución de muestra, sin necesidad de aplicar un bombeo de alta presión.
En la electrocromatografía capilar la fase móvil se transporta a través de la fase estacionaria por el bombeo ejercido por el flujo electroosmótico y no por un bombeo mecánico, lo que simplifica significativamente el equipo.
Se diferencian dos tipos de electrocromatografía capilar:

  • Electrocromatografía rellena, en la cual un disolvente polar se conduce por el flujo electroosmótico a través de un capilar que contiene un relleno típico de HPLC en fase inversa. Las separaciones dependen de la distribución de los analitos entre la fase móvil y la fase estacionaria líquida retenida por el relleno.
  • Cromatografía capilar electrocinética micelar. Esta técnica requiere la utilización de un tensoactivo en un nivel de concentración en el cual se formen micelas. Estas micelas son capaces de alojar compuestos no polares en su interior. La interacción de las micelas y los solutos es la que produce la separación.

En resumen la cromatografía y la electroforesis son en la actualidad técnicas ampliamente utilizadas en la resolución de macromoléculas de interés en la industria biotecnológica, biológica y bioquímica. Muestra de ello es el numeroso grupo de estudios realizados que se encuentra en la literatura especializada.
Se destaca en las últimas décadas un mayor uso de la electroforesis capilar. Esta versión instrumental de la electroforesis convencional resulta más ventajosa debido a los pequeñísimos volúmenes que se necesitan para el estudio en cuestión y los resultados se obtienen en un tiempo mínimo. Estos aspectos la hacen preferida entre las técnicas de separación.

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  27. http://www.ecogen.com/agarosa.htm

Palabras clave: métodos de separación, cromatografía, electroforesis

 

 

 

Autor:


Teresa Fernández Aldama
,
Marcelo Marcet Sánchez
,
Carlos Martin Medina
, carlosmartin63[arroba]yahoo.com
Eugenio Carrillo Prieto
eugenio.carrillo[arroba]umcc.cu, eugeniocarrillo2001[arroba]hotmail.com


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