La identificación de un aislamiento bacteriano puede realizarse utilizando diferentes combinaciones de características y diferentes criterios en la evaluación de similitudes.

Los ensayos bioquímicos tradicionalmente utilizados, llamadas pruebas bioquímicas convencionales, generalmente determinan la actividad de una vía metabólica (conjunto de reacciones químicas) a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer transforma o no.

Existen diferentes sistemas que facilitan la realización de tales ensayos, porque proponen el mejor conjunto de pruebas bioquímicas para la identificación de un grupo bacteriano, porque simplifican la interpretación de un resultado utilizando un valor numérico, porque proveen los reactivos prontos para su uso o porque son totalmente automatizables.

 Las pruebas o ensayos bioquímicos, son pruebas simples que se han desarrollado para demostrar en forma clara una determinada característica bioquímica como presencia o ausencia de una determinada actividad enzimática, grupo de enzimas o determinada vía metabólica, crecimiento a una determinada temperatura, crecimiento en presencia de inhibidores, etc. No significan de ninguna manera un estudio profundo del metabolismo bacteriano.

GENERAL

Determinar la producción de enzimas en las bacterias.

ESPECÍFICOS

• Determinar la producción de catalasa de algunos géneros y especies de bacterias.
• Determinar la producción de ureasa de algunos géneros y especies de bacterias.
• Determinar la producción de indol de algunos géneros y especies de bacterias.
• Determinar la lucuación de la gelatina de algunos géneros y especies de bacterias.
• Determinar la hidrólisis del almidón de algunos géneros y especies de bacterias.
• Determinar la capacidad oxidativa y/o fermentativa de algunos géneros y especies de bacterias.

MATERIALES:

• Géneros y especies
• Cultivos puros de:

1. Peptona
2. SSR
3. Hugh y Leifson
4. Gelatina
5. Triptona

• Cajas de petri
• peróxido de hidrógeno (H₂O₂)
• reactivo de Kovac’s
• lugol
• parafina
• tira de papel de acetato de plomo
• Tubos de ensayo
• portaobjeto
• Agujas de asa
• Mecheros de alcohol
• Nevera

PROCEDIMIENTO

1. Coloque una azada de crecimiento (célula) de cada uno de los cultivos sobre portaobjetos.
2. Agregue 2 ó 3 gotas de peróxido de hidrógeno (H₂O₂)
3. observe la formación o no de burbujas.

1. incube en los tubos con medio SSR, que contiene urea.
2. Incube a temperatura ambiente y observe los cambios de color durante 7 dias.

1. inocule los cultivos en tubos con gelatina nutritiva.
2. incube a 37°C. Mantenga la incubación de 2 a 7 días o hasta que se obtenga una reacción positiva.
3. Para observar la hidrólisis, enfríe los tubos en hielo. La gelatina hidrolizada permanecerá liquida.

1. inocule los cultivos en tubos con caldo nutritivo.
2. incube a 37°C por 48 horas.
3. Al cabo de este tiempo, añada en los tubos 0.5 ml del reactivo de Kovac’s.
4. Mezcle bien por rotación del tubo entre las manos y examine después de un minuto.

1. inocule los cultivos en caja de petri con agar-almidón e incube a 30°C durante 5 días.
2. Al cabo de este tiempo, cubra las cajas con solución de lugol.
3. Observe el color que toma el medio.

1. Medio de cultivo Hugh y Leifson con glucosa al 1%.
2. indicador de acidez o alcalinidad: Bromotimol azul, coloración amarilla indica pH 6 o menos; coloración azul indica pH de 7 a 8.
3. De cada cultivo inoculese por el método de punción dos tubos con el medio indicado, uno de ellos sin sellar (condiciones aeróbicas) y el otro sellado con parafina (condiciones anaeróbicas).
4. incubese a temperatura adecuada por 2 o 3 días.
5. obsérvese el crecimiento y el cambio de coloración del medio.

1. Inocule los cultivo d los microorganismos en caldo nutritivo.
2. incube los tubos a 37°C durante 7 días.
3. Inserta una tira de papel de acetato de plomo en el tubo y examine el ennegrecimiento del papel.

PRODUCCIÓN DE CATALASA.

La catalasa es una enzima que protege a las células frente al peróxido de hidrógeno producido en el metabolismo del oxígeno.

Químicamente, la catalasa es una hemoproteína de estructura similar a la de la hemoglobina, excepto que los 4 átomos de hierro de la molécula están en estado oxidado (Fe+++) en lugar de reducido (Fe++). Excluyendo los estreptococos, la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas poseen actividad catalasa. La actividad catalasa se detecta añadiendo unas gotas de peróxido de hidrógeno (3%) sobre colonias en medio que no sea de agar sangre (daría falsos positivos).

El peróxido de hidrógeno se forma como uno de los productos finales del metabolismo oxidativo aeróbico de los hidratos de carbono. Si se deja acumular, el peróxido de hidrógeno es letal para las células bacterianas. La catalasa transforma el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno de acuerdo a la siguiente reacción:

1. Cual es la reacción activada por la catalasa?

la rápida aparición y producción sostenida de burbujas de gas o efervescencia, indica una prueba positiva.

2. Cual es el gas presente en las burbujas que se forman en la reacción positiva?

El gas que se forma en la reacción es oxígeno.

3. Como interpreta usted la formación de burbujas en la prueba de la catalasa?

PRODUCCIÓN DE UREASA

La urea es un compuesto orgánico nitrogenado que se transforma por algunos microorganismos del suelo, los cuales producen la enzima ureasa. Como resultado de esta actividad microbiana el nitrógeno es liberado al suelo en forma inorgánica. Cuando esta reacción ocurre en medio de cultivo se alcaliniza y el indicador permite percibir visualmente el cambio en acidez del medio.

1. Cual es la fórmula química de la urea?

LICUACIÓN DE LA GELATINA

La gelatina es una proteína que se obtiene por hidrólisis parcial del colágeno y proporciona un sustrato útil para determinar la acción de las enzimas proteolíticas de los microorganismos.

PRODUCCIÓN DE INDOL

El indol es uno de los productos de degradación metabólica del aminoácido triptofano.Las bacterias que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptofano con producción de indol, ácido pirúvico y amoníaco. La producción de indol es una característica importante para la identificación de muchas especies de microorganismos. La prueba de indol está basada en la formación de un complejo rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehído del p-dimetilaminobenzaldehído. Este es el principio activo de los reactivos de Kovacs y Ehrlich descriptos más adelante. El medio de cultivo utilizado debe ser rico en triptofano.

1. Qué compuestos se obtienen mediante la degradación del triptófano ocasionada por la acción bacterial?

El indol, ácido piuvico y amoniaco son uno de los productos de degradación metabólica del aminoácido triptofano.

2. El enrojecimiento de la capa superficial del cultivo en tubo de ensayo ¿Qué le indica?

HIDRÓLISIS DE ALMIDÓN

Los polisacaridos, como el almidón son demasiado largos para ser transportados al interior de la célula. Los microorganismos excretan amilasas que hidrolizan esos polímeros hasta oligosacáridos o monosacáridos que pueden usarse como sustratos para crecer.
La hidrólisis de almidón es analizada en medios conteniendo almidón en placa. Después de incubar se inundan las placas con lugol que al unirse con el almidón intacto forma un complejo púrpura.

1. Como explica que el medio tome una coloración azul uniforme?

Porque la bacteria no hidroliza el almidón, osea que no hay reacción.

2. Como explica la presencia de zonas claras en el medio?

La presencia de zonas claras advierte la bacteria productora de amilasa, osea que si hubo reacción.

3. Señale algún uso industrial de las amilasas producidas por microorganismos.

PRUEBA O/F (Oxido-fermentación)

El medio más comúnmente utilizado es el de Hugh-Leifson que a diferencia de otros medios de cultivo contiene una baja concentración de peptonas (0.2 %). A las concentraciones de peptona habitualmente usadas en otros medios (1 al 2%), no es posible detectar la baja concentración de ácidos que se produce por metabolismo oxidativo de azúcares, ya que las aminas generadas por el uso aerobio de las peptonas alcalinizan el medio. La baja concentración de peptona del medio Hugh-Leifson permite diferenciar los microorganismos oxidativos de los inactivos frente a la glucosa. En ausencia de otros aceptores externos de electrones (ej. NO3-), la oxidación de carbohidratos es un proceso estrictamente aerobio, en tanto que la fermentación es un proceso que no requiere oxígeno. El medio de cultivo es semisólido. 

Cuando se habla de esta prueba sin especificar nada, hay que suponer que el test se ha hecho con glucosa, así, cuando se dice que un microorganismo es oxidante o fermentador se sobreentiende que lo es con respecto al metabolismo de la glucosa.
La prueba se realiza en dos tubos con medio semisólido y rectos, que inicialmente son de color verde. Se inoculan por picadura en el centro del tubo y uno de ellos se recubre con parafina líquida estéril (que impide el contacto del medio con el oxígeno atmosférico).

1. Qué puede usted concluir si como consecuencia del crecimiento bacterial los dos tubos inoculados aparecen amarillos?

el metabolismo de los azúcares produce ácidos, tanto en presencia como en ausencia de oxígeno.

2. Si el tubo anaeróbico permanece azul y el aeróbico amarillo ¿qué puede usted anotar con relación a los requerimientos de oxígeno de la especie?

Si el microorganismo es únicamente oxidante , después de la incubación sólo estará amarillo el medio sin cubrir con parafina.

3. Si ambos tubos permanecen azules ¡qué ha ocurrido?

PRODUCCIÓN DE ÁCIDO SULFHÍDRICO

Muchas bacterias producen sulfuro de hidrógeno (sulfhídrico) a partir de aminoácidos azufrados (cisteína o metionina) o tiosulfato.

1. Qué indica el oscurecimiento de papel impregnado en acetato de plomo?

Que si hubo reacción de oxidación.

2. De algunos ejemplos de alimentos que durante su descomposición presentan una reacción de este tipo.

Consigne los resultados de las pruebas en el cuadro adjunto.