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Actividades bioquímicas de las bacterias



    Práctica de Laboratorio

    1. Objetivos
    2. Metodología
    3. Resultados
    4. Bibliografía

    INTRODUCCIÓN

    La identificación de un aislamiento bacteriano
    puede realizarse utilizando diferentes combinaciones de características y diferentes criterios en
    la evaluación
    de similitudes.

    Los ensayos
    bioquímicos tradicionalmente utilizados, llamadas pruebas
    bioquímicas convencionales, generalmente determinan la
    actividad de una vía metabólica (conjunto de
    reacciones
    químicas) a partir de un sustrato que se incorpora en
    un medio de cultivo y que la bacteria al crecer transforma o
    no.

    Existen diferentes sistemas que
    facilitan la realización de tales ensayos, porque proponen
    el mejor conjunto de pruebas bioquímicas para la
    identificación de un grupo
    bacteriano, porque simplifican la interpretación de un
    resultado utilizando un valor
    numérico, porque proveen los reactivos prontos para su uso
    o porque son totalmente automatizables.

     Las pruebas o ensayos bioquímicos, son
    pruebas simples que se han desarrollado para demostrar en forma
    clara una determinada característica bioquímica
    como presencia o ausencia de una determinada actividad
    enzimática, grupo de enzimas o
    determinada vía metabólica, crecimiento a una
    determinada temperatura,
    crecimiento en presencia de inhibidores, etc. No significan de
    ninguna manera un estudio profundo del metabolismo
    bacteriano.

    OBJETIVOS

    GENERAL

    Determinar la producción de enzimas en las bacterias.

    ESPECÍFICOS

    • Determinar la producción de catalasa de
      algunos géneros y especies de bacterias.
    • Determinar la producción de ureasa de algunos
      géneros y especies de bacterias.
    • Determinar la producción de indol de algunos
      géneros y especies de bacterias.
    • Determinar la lucuación de la gelatina de
      algunos géneros y especies de bacterias.
    • Determinar la hidrólisis del almidón de
      algunos géneros y especies de bacterias.
    • Determinar la capacidad oxidativa y/o fermentativa de
      algunos géneros y especies de bacterias.

    METODOLOGÍA

    MATERIALES:

    • Géneros y especies
    • Cultivos puros de:
    1. Peptona
    2. SSR
    3. Hugh y Leifson
    4. Gelatina
    5. Triptona
    • Cajas de petri
    • peróxido de hidrógeno
      (H2O2)
    • reactivo de Kovac’s
    • lugol
    • parafina
    • tira de papel de
      acetato de plomo
    • Tubos de ensayo
    • portaobjeto
    • Agujas de asa
    • Mecheros de alcohol
    • Nevera

    PROCEDIMIENTO

    Producción de Catalasa:

    1. Coloque una azada de crecimiento (célula) de cada uno de los cultivos sobre
      portaobjetos.
    2. Agregue 2 ó 3 gotas de peróxido de
      hidrógeno (H2O2)
    3. observe la formación o no de
      burbujas.

    Producción de ureasa:

    1. incube en los tubos con medio SSR, que contiene
      urea.
    2. Incube a temperatura ambiente y
      observe los cambios de color durante 7
      dias.

    Licuación de la gelatina:

    1. inocule los cultivos en tubos con gelatina
      nutritiva.
    2. incube a 37°C. Mantenga la incubación de 2
      a 7 días o hasta que se obtenga una reacción
      positiva.
    3. Para observar la hidrólisis, enfríe los
      tubos en hielo. La gelatina hidrolizada permanecerá
      liquida.

    Producción de indol:

    1. inocule los cultivos en tubos con caldo
      nutritivo.
    2. incube a 37°C por 48 horas.
    3. Al cabo de este tiempo,
      añada en los tubos 0.5 ml del reactivo de
      Kovac’s.
    4. Mezcle bien por rotación del tubo entre las
      manos y examine después de un minuto.

    Hidrólisis del almidón:

    1. inocule los cultivos en caja de petri con
      agar-almidón e incube a 30°C durante 5
      días.
    2. Al cabo de este tiempo, cubra las cajas con
      solución de lugol.
    3. Observe el color que toma el medio.

    Prueba O/F (oxido-fermentación):

    1. Medio de cultivo Hugh y Leifson con glucosa al
      1%.
    2. indicador de acidez o alcalinidad: Bromotimol azul,
      coloración amarilla indica pH 6 o
      menos; coloración azul indica pH de 7 a 8.
    3. De cada cultivo inoculese por el método
      de punción dos tubos con el medio indicado, uno de ellos
      sin sellar (condiciones aeróbicas) y el otro sellado con
      parafina (condiciones anaeróbicas).
    4. incubese a temperatura adecuada por 2 o 3
      días.
    5. obsérvese el crecimiento y el cambio de
      coloración del medio.

    Producción de ácido
    sulfhídrico:

    1. Inocule los cultivo d los microorganismos en caldo
      nutritivo.
    2. incube los tubos a 37°C durante 7
      días.
    3. Inserta una tira de papel de acetato de plomo en el
      tubo y examine el ennegrecimiento del papel.

    RESULTADOS

    PRODUCCIÓN DE CATALASA.

    La catalasa es una enzima que protege a las células
    frente al peróxido de hidrógeno producido en el
    metabolismo del oxígeno.

    Químicamente, la catalasa es una
    hemoproteína de estructura
    similar a la de la hemoglobina, excepto que los 4 átomos
    de hierro de la
    molécula están en estado oxidado
    (Fe+++) en lugar de reducido (Fe++). Excluyendo los
    estreptococos, la mayoría de las bacterias aerobias y
    anaerobias facultativas poseen actividad catalasa. La actividad
    catalasa se detecta añadiendo unas gotas de
    peróxido de hidrógeno (3%) sobre colonias en medio
    que no sea de agar sangre
    (daría falsos positivos).

    El peróxido de hidrógeno se forma como uno
    de los productos
    finales del metabolismo oxidativo aeróbico de los hidratos
    de carbono. Si se
    deja acumular, el peróxido de hidrógeno es letal
    para las células bacterianas. La catalasa transforma el
    peróxido de hidrógeno en agua y
    oxígeno de acuerdo a la siguiente
    reacción:

    H2O2 ® H2O +
    O2 (burbujas de gas

    1. la rápida aparición y
      producción sostenida de burbujas de gas o
      efervescencia, indica una prueba positiva.

    2. Cual es la reacción activada por la
      catalasa?

      El gas que se forma en la reacción es
      oxígeno.

    3. Cual es el gas presente en las burbujas que se forman
      en la reacción positiva?
    4. Como interpreta usted la formación de burbujas
      en la prueba de la catalasa?

    Las bacterias catalizan la rotura del agua oxigenada
    liberando oxígeno libre. Y la producción de
    burbujas indica la presencia del enzima.

    PRODUCCIÓN DE UREASA

    La urea es un compuesto orgánico nitrogenado que
    se transforma por algunos microorganismos del suelo, los cuales
    producen la enzima ureasa. Como resultado de esta actividad
    microbiana el nitrógeno es liberado al suelo en forma
    inorgánica. Cuando esta reacción ocurre en medio de
    cultivo se alcaliniza y el indicador permite percibir visualmente
    el cambio en acidez del medio.

    1. Cual es la fórmula química de la
      urea?

    H2N-CO-NH2

    LICUACIÓN DE LA GELATINA

    La gelatina es una proteína que se obtiene por
    hidrólisis parcial del colágeno y proporciona un
    sustrato útil para determinar la acción de las
    enzimas proteolíticas de los microorganismos.

    1. Proteína + H2O ® polipéptidos +
      H2O ® aminoácidos

    2. Cuales son los productos intermedios y finales que se
      obtienen de la hidrólisis de las proteínas?
    3. Qué importancia tiene la hidrólisis de
      las proteínas cuando ocurre en los suelos?

    La hidrólisis de la proteína es
    importante porque se obtienen aminoácidos y producen
    amoníaco, fosfatos útiles para el
    suelo.

    PRODUCCIÓN DE INDOL

    El indol es uno de los productos de degradación
    metabólica del aminoácido triptofano.Las bacterias
    que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar
    el triptofano con producción de indol, ácido
    pirúvico y amoníaco. La producción de indol
    es una característica importante para la
    identificación de muchas especies de microorganismos. La
    prueba de indol está basada en la formación de un
    complejo rojo cuando el indol reacciona con el grupo
    aldehído del p-dimetilaminobenzaldehído. Este es el
    principio activo de los reactivos de Kovacs y Ehrlich descriptos
    más adelante. El medio de cultivo utilizado debe ser rico
    en triptofano.

    1. El indol, ácido piuvico y amoniaco son uno de
      los productos de degradación metabólica del
      aminoácido triptofano.

    2. Qué compuestos se obtienen mediante la
      degradación del triptófano ocasionada por la
      acción bacterial?
    3. El enrojecimiento de la capa superficial del cultivo
      en tubo de ensayo
      ¿Qué le indica?

    El desarrollo
    de un vivo color rojo fucsia en la interfase del reactivo y el
    caldo, segundos después de añadir el reactivo
    indica la presencia de indol y una prueba positiva.

    HIDRÓLISIS DE ALMIDÓN

    Los polisacaridos, como el almidón son demasiado
    largos para ser transportados al interior de la célula.
    Los microorganismos excretan amilasas que hidrolizan esos
    polímeros hasta oligosacáridos o
    monosacáridos que pueden usarse como sustratos para
    crecer.
    La hidrólisis de almidón es analizada en medios
    conteniendo almidón en placa. Después de incubar se
    inundan las placas con lugol que al unirse con el almidón
    intacto forma un complejo púrpura.

    1. Porque la bacteria no hidroliza el almidón,
      osea que no hay reacción.

    2. Como explica que el medio tome una coloración
      azul uniforme?

      La presencia de zonas claras advierte la bacteria
      productora de amilasa, osea que si hubo
      reacción.

    3. Como explica la presencia de zonas claras en el
      medio?
    4. Señale algún uso industrial de las
      amilasas producidas por microorganismos.

    Las amilasas hidrolizan el almidón a dextrinas
    y azúcares, y se emplea en color y adhesivos,
    clarificación de jugos de frutas, preparaciones
    farmaceuticas entre otras aplicaciones.

    PRUEBA O/F (Oxido-fermentación)

    El medio más comúnmente utilizado es el de
    Hugh-Leifson que a diferencia de otros medios de cultivo contiene
    una baja concentración de peptonas (0.2 %). A las
    concentraciones de peptona habitualmente usadas en otros medios
    (1 al 2%), no es posible detectar la baja concentración de
    ácidos
    que se produce por metabolismo oxidativo de azúcares, ya
    que las aminas generadas por el uso aerobio de las peptonas
    alcalinizan el medio. La baja concentración de peptona del
    medio Hugh-Leifson permite diferenciar los microorganismos
    oxidativos de los inactivos frente a la glucosa. En ausencia de
    otros aceptores externos de electrones (ej. NO3-), la
    oxidación de carbohidratos
    es un proceso
    estrictamente aerobio, en tanto que la fermentación es un
    proceso que no requiere oxígeno. El medio de cultivo es
    semisólido. 

    Cuando se habla de esta prueba sin especificar nada, hay
    que suponer que el test se ha hecho
    con glucosa, así, cuando se dice que un microorganismo es
    oxidante o fermentador se sobreentiende que lo es con respecto al
    metabolismo de la glucosa.
    La prueba se realiza en dos tubos con medio semisólido y
    rectos, que inicialmente son de color verde. Se inoculan por
    picadura en el centro del tubo y uno de ellos se recubre con
    parafina líquida estéril (que impide el contacto
    del medio con el oxígeno atmosférico).

    1. el metabolismo de los azúcares produce
      ácidos, tanto en presencia como en ausencia de
      oxígeno.

    2. Qué puede usted concluir si como consecuencia
      del crecimiento bacterial los dos tubos inoculados aparecen
      amarillos?

      Si el microorganismo es únicamente oxidante ,
      después de la incubación sólo
      estará amarillo el medio sin cubrir con
      parafina.

    3. Si el tubo anaeróbico permanece azul y el
      aeróbico amarillo ¿qué puede usted anotar
      con relación a los requerimientos de oxígeno de
      la especie?
    4. Si ambos tubos permanecen azules ¡qué ha
      ocurrido?

    La bacteria no crece en glucosa por lo que no hay
    cambios en ninguno de los tubos.

    PRODUCCIÓN DE ÁCIDO
    SULFHÍDRICO

    Muchas bacterias producen sulfuro de hidrógeno
    (sulfhídrico) a partir de aminoácidos azufrados
    (cisteína o metionina) o tiosulfato.

    1. Que si hubo reacción de
      oxidación.

    2. Qué indica el oscurecimiento de papel
      impregnado en acetato de plomo?
    3. De algunos ejemplos de alimentos que
      durante su descomposición presentan una reacción
      de este tipo.

    Manzanas, caña de azúcar, papa, banano, plátano,
    etc.

    Consigne los resultados de las pruebas en el cuadro
    adjunto.

    PRUEBA

    REACCIÓN (+) (-)

    CAMBIOS SEGÚN LA
    REACCIÓN

    CATALASA

    +

    Presencia de burbujas

    UREASA

    No tuvo cambio de color

    LUCUEFACIÓN DE LA
    GELATINA

    +

    La gelatina se hidrolizó y
    permaneció líquida.

     

    INDOL

    Al agregar el reactivo de Kovac’s no cambio
    de color.

    HIDRÓLISIS DEL
    ALMIDÓN

    +

    Presencia de zonas claras, desaparece el color del
    lugol

    PRUEBA O/F

    +

    La bacteria solo es oxidantes, asi que
    no

    Hubo reacción en el tubo
    anaerobio.

    PRODUCCIÓN DE
    H2S

    +

    El papel de acetato de plomo se oxido.

     BIBLIOGRAFÍA

    Margarita Rodríguez

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