La metodología de trabajo a la hora de plantear un ensayo con una plataforma de biochips está dividida en varios pasos, y la realización de algunos de ellos está condicionada por el tipo de Biochip que se desee emplear durante el experimento. Aún así, a grandes rasgos, la metodología a seguir es la misma y sería la siguiente:

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Entre las matrices de material genético se debe hacer una primera y muy clara diferenciación entre las micromatrices y las macromatrices. Como el nombre indica, la diferencia entre estos dos tipos de dispositivos radica en el tamaño, pero más que por el tamaño físico de los dispositivos es por el tamaño de los puntos en los que el material genético es depositado. En las micromatrices la densidad de integración es mucho más alta, debido a que los dispositivos de generación de los puntos están mucho más avanzados tecnológicamente. Por el contrario,  las macromatrices son más sencillas de conseguir. Las diferencias en la capacidad de integración entre ambos dispositivos son enormes y esto determina las posibles aplicaciones de unas y otras, por ejemplo en una micromatriz se pueden llegar a generar hasta más de 10.000 posiciones reactivas esta cifra se aleja mucho del millar que podría llegar a conseguirse mediante una macromatriz.

El material sobre el que se va a generar la matriz es un componente muy importante del proceso ya que según su resistencia se podrán llevar a cabo determinados procesos de lavado y eliminación de uniones inespecíficas, podrán o no ser reutilizados, existirán diferentes mecanismos de revelado y un aspecto muy importante es también el coste que conlleva la fabricación de la matriz.

Se han buscado diferentes soluciones que permitan la inmovilización del material genético a la superficie, de esta forma se pueden distinguir dos procesos claramente diferenciados en la fabricación de las matrices:

• En el primero de ellos el material genético de las sondas es sintetizado en un lugar ajeno a la matriz y posteriormente se deposita sobre la superficie. Ha impulsado el desarrollo de robots que son capaces de generar las matrices tomando para ello las diferentes muestras del material genético y depositándolas sobre una superficie en forma de una matriz con puntos. Estos robots tienen un brazo que porta unos cabezales encargados de recoger la muestra cuando se introducen en ella para depositarla posteriormente sobre la superficie. La aplicación de esta técnica ha supuesto un aumento en la capacidad de producción de matrices, pero no es la única que emplea un material ya sintetizado.
• La segunda posibilidad alternativa para la generación de las matrices consiste en la unión química de la muestra sobre la superficie de la matriz. En algunos casos el material genético es sintetizado "in situ" sobre un substrato para generar de esta manera sobre la superficie un conjunto de diferentes productos separados espacialmente.

Algunos ejemplos de las técnicas empleadas para la fabricación de estos dispositivos   descritos brevemente son:

El revelado es uno de los proceso clave durante el trabajo con los sistemas basados en biochips. Durante este paso se produce la localización de los puntos en los que la reacción ha sido positiva, para ello se pueden emplear diferentes aproximaciones.

Uno de los puntos clave en el proceso de revelado se produce durante la selección del marcador que se va a detectar. La selección y desarrollo de las técnicas de revelado basadas en la detección de fluorescencia proveniente de marcadores fluorescentes frente a la utilización de otras técnicas como la radioactividad, surge como una consecuencia de la necesidad de automatizar y acelerar los procesos de revelado.

Los sistemas de revelado más comúnmente empleados son los que se basan en la utilización de escáneres láser o la detección mediante cámaras CCD. El fundamento de estos dispositivos es la emisión de un haz de luz de una determinada longitud de onda (excitación) capaz de estimular la liberación de un fotón en una longitud de onda distinta por parte del marcador fluorescente y la posterior detección de estos fotones mediante un dispositivo de recolector.

Los dispositivos de revelado presentan una gran carga bioinformática dirigida al almacenamiento y tratamiento de los datos recogidos por los detectores. En este proceso se generan las imágenes correspondientes al patrón de reacciones positivas y negativas que se han producido en la superficie del chip. Los datos son adquiridos como una imagen con puntos de diferente intensidad que deben ser interpretados y transformados. A este proceso se le puede denominar como procesamiento de las imágenes y en el se procede a la interpretación de las intensidades detectadas en cada uno de los puntos en los que la reacción de afinidad ha sido positiva por el hardware de detección.

En el proceso de visualización se pueden distinguir diferentes etapas a medida que se va realizando el proceso.

•  La primera etapa consiste en el establecimiento de la malla conformada por los puntos inmovilizados y el tratamiento de la imagen para constituir la matriz de puntos que se representa posteriormente. Para ello se localizan los puntos en los que la detección de la hibridación ha sido positiva y muy intensa, se buscan sus centros y a partir de estos centros se extraen las coordenadas.
•  El siguiente paso en el tratamiento de los datos proporcionados por las unidades detectoras consiste en la detección y eliminación del ruido de fondo que acompaña a las señales. Este paso es importante y la cantidad de ruido que acompaña a la señal es muy variable en función del tipo de biochip con el que se esté trabajando y del tipo de marcaje al que se han sometido las muestras. En general se encuentra más ruido de fondo en los biochips que emplean como soporte de inmovilización membranas, viéndose reducido en aquellos desarrollados sobre vidrio. El tratamiento para discernir el ruido de la señal se puede hacer mediante una modelización Gaussiana o bien considerando los pixel más externos de la imagen como ruido de fondo.
•  El siguiente paso en el tratamiento de la imagen consiste en la limitación del tamaño de los puntos detectados.
•  La cuarta etapa del proceso de tratamiento de la imagen es la asignación de las intensidades de cada punto. En el caso de la utilización de más de dos fluorocromos para la detección este paso se repite tantas veces como fluorocromos diferentes existen en la muestra, mediante la excitación sucesiva con diferentes longitudes de onda y posterior detección de la excitación. En este punto se establece también la relación (ratio) entre las intensidades de cada uno de los fluorocromos detectados, que va a ser proporcionada finalmente al investigador como resultado del ensayo.

Existen diferentes programas de tratamiento de imágenes, algunos de los cuales permiten analizar las entradas de múltiples biochips simultáneamente.

Posteriormente a la detección de la imagen y a esta primera interpretación de los resultados los datos pueden ser almacenados y presentados en diferentes formatos. La posibilidad de utilizar diferentes formatos permite que los datos sean posteriormente importados por el software de análisis. En la mayoría de los casos los datos son presentados al investigador en forma de una imagen en formato TIFF de 16 bits.

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Los labchips, también conocidos como dispositivos microfuídicos, son sistemas miniaturizados capaces de realizar ensayos de laboratorio en una red de canales miniaturizados generalmente grabados mediante láseres o reacciones químicas sobre polímeros, plásticos cristal o silicio. Por lo tanto los Labchips pueden considerarse como "microchips analíticos".

La finalidad de esta tecnología es la de suministrar un método rápido, portátil, desechable y económico para la realización de ensayos.

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labchip desarrollado por la empresa Agilent en colaboración con Caliper (fuente www.Agilent.com)

La principal característica de estos dispositivos es su pequeño tamaño, como consecuencia de ello, logran que los volúmenes que se emplean sean mínimos. Esto redunda en un menor coste en reactivos en la necesidad de menores cantidades de muestra, y por último en un gran aumento de las velocidades a las que se pueden realizar los ensayos.

Estos dispositivos están siendo empleados para la realización entre otras de las siguientes reacciones:

• Cromatografías
• PCR
• Detección de antígenos
• Citometrías
• Purificación de nuestras de ADN y ARN

Bioinformática Asociada 

En la actualidad se han desarrollado herramientas bioinformáticas que permiten monitorizar el conjunto del proceso de trabajo en el laboratorio con los sistemas LIMS (sistemas de gestión de la información de laboratorio). Gracias a estos sistemas se puede seguir y gestionar todo el proceso de trabajo de laboratorio con detalle desde el diseño de los biochips hasta el análisis, la información que se almacena en estos sistemas incluye la descripción del material  de las sondas inmovilizadas en la superficie del chip, información del proceso de fabricación del chip proveniente de la gestión del robot, la descripción del material de la muestra, la descripción de los reactivos empleados así como de los investigadores encargados del proceso.

Las principales etapas en las que participa la bioinformática en el proceso de trabajo con estos dispositivos son los siguientes:

•  Diseño del Chip, la bioinformática participa muy activamente a la hora de seleccionar las sondas de análisis que se  van a inmovilizar a la superficie del chip. El tipo de sonda que se desee inmovilizar variará según el tipo de experimento que se desee realizar. La bioinformática participa en los estudios previos necesarios para la determinación de las secuencias que proporcionarán una hibridación más específica, que son seleccionadas como sondas para su inmovilización.
•  Fabricación: Los procesos de gestión de los equipos en cargados de la fabricación de los biochips están regulados mediante herramientas informáticas.
•  Revelado: En este proceso la participación bioinformática es clave para la obtención de los datos procedentes de los dispositivos de detección de señales positivas procedentes de los dispositivos de detección.
•  Almacenamiento de los datos, los datos son ofrecidos en soporte electrónico por lo que se debe recurrir a herramientas de las tecnologías de la información y las comunicaciones que gestionen y almacenen estos datos.
•  Análisis, debido a la gran cantidad de datos que generan este tipo de ensayos se hace imprescindible la participación bioinformática para realizar los análisis de datos.

En el mundo del software desarrollado para su aplicación en entornos bioinformáticos de trabajo con biochips volvemos a encontrar una tendencia bipolar. En un polo podemos encontrar aquellos programas que se ofrecen de forma gratuita y que pueden ser descargados a través de Internet, por los investigadores para su utilización en el laboratorio. En muchos casos este tipo de software se puede encontrar en las páginas de grupos que trabajan en universidades y otros centros públicos de investigación y que han desarrollado ellos mismos estas aplicaciones.

El otro polo que existe es el dedicado al diseño y comercialización de software por parte de compañías privadas. Este tipo de software ha sido desarrollado mayoritariamente por las empresas dedicadas a al bioinformática pero también se puede observar la presencia de empresas que originalmente se dedicaban a la fabricación y diseño de biochips que también desarrollan y comercializan sus propios entornos bioinformáticos que permiten  la gestión y/o análisis de los chips por ellos desarrollados.

Una de las grandes consecuencias que ha tenido la enorme capacidad de generar datos por parte de los biochips está en el desarrollo de grandes bases de datos de expresión génica. La creación de estas bases de datos está polarizada en dos grupos:

•  Uno que serían las bases de datos públicas
•  En el otro estarían englobadas las iniciativas privadas de creación de bases de datos comerciales.
• En el campo de las bases de datos de biochips el otro foco de atención se encuentra centrado en la estructura que deben tomar estas bases de datos. Como de costumbre la opinión se encuentra dividida entre dos opciones:
•  La primera de ellas aboga por el almacenamiento de los datos numéricos de las imágenes y las imágenes.
•  La segunda opción propone una solución completa en la que la base de datos almacenaría los datos completos del experimento, incluyendo los datos de los clones empleados para la generación del chips.

La situación actual pasa por la acumulación de los datos de los resultados de los experimentos basados en biochips en las bases de datos privadas de los investigadores. El importante auge que estas técnicas están teniendo en el ámbito de la investigación biomédica así como la extensión de su uso está sirviendo como un motor importante para el desarrollo de bases de datos públicas, impulsando la aparición de proyectos destinados a la generación de estos repositorios públicos con datos de estos experimentos en los que estos datos puedan ser almacenados para su posterior comparación y análisis. Una de las consecuencias de la gran capacidad de los biochips es que han permitido el desarrollo de grandes bases de datos de expresión génica, pudiendo ser estas bases de datos de expresión génica privadas y comercializadas, como por ejemplo Gene Express de Gene Logic, que es una base de datos generada empleando los GeneChips de Affymetrix.

Los proyectos de creación de bases de datos públicas tienen que ir necesariamente de la mano con los procesos de estandarización del trabajo con biochips, en este sentido es muy importante la estandarización de elementos tales como los controles internos empleados en los experimentos, los formatos en los que son presentadas las imágenes para ser almacenadas y la anotación de la información del material que se ha inmovilizado en cada punto del biochip.

En estos momentos existen diversas bases de datos capaces de recibir los datos de los resultados de los biochips, pero en muchos casos son bases de datos de expresión génica en general, es decir estas bases de datos lo que reciben es exclusivamente los resultados del proceso. Por el contrario se está desarrollando una nueva línea de trabajo que está dirigiendo sus pasos hacia la creación de bases de datos exclusivas de biochips con los datos de este tipo de experimentos.

La expansión del uso de estas tecnologías ha traído consigo la proliferación y diversificación de plataformas sobre las cuales realizar los ensayos. Esta situación ha terminado por desembocar en una ausencia casi absoluta de unos estándares que permitan la interoperabilidad de los sistemas.

El terreno de la gestión y análisis de los datos la situación es muy similar a la que se da en el terreno tecnológico, propiciando una situación que dificulta la comparabilidad de los resultados obtenidos.

En este sentido se han venido desarrollando en los últimos años diversas iniciativas que tratan de proponer unos mínimos comunes que permitan un punto de encuentro tanto entre los resultados obtenidos por las diversas técnicas como la posibilidad de emplear las mismas herramientas en diferentes plataformas.

Las iniciativas de estandarización han estado por tanto siempre enfocadas a tres ámbitos:

• Estandarización del Hardware, es decir una normalización de los propios biochips en términos de dimensiones, superficies, etc...
• Estandarización del material inmovilizado, en este caso la necesidad de establecer unos criterios para la determinación de los controles internos resulta muy importante
• Estandarización de los procedimientos de análisis y almacenamiento de la información proveniente de estos estudios. De esta manera se pretenden encontrar unas normas comunes que se puedan aplicar a las herramientas bioinformáticas que se emplean en este entorno

Las primeras iniciativas de estandarización datan de 1998 y aún no han tenido éxito, ya que no se puede considerar aún un estándar. Los primeros abordajes de estandarización surgieron como iniciativas más o menos aisladas en la que se podían distinguir muy claramente las tres áreas de estandarización anteriormente propuestas. Estas iniciativas estaban fueron el GATConsortium, que fue la iniciativa liderada por Affymetrix y encaminada a establecer unos parámetros que permitiesen la interoperabilidad de las plataformas. Otra iniciativa fue la liderada por el NCGRI encaminada a la determinación de unos estándares sobre los clones humanos a inmovilizar sobre la superficie de los chips y que se denominó como proyecto 15K. Por último en la estandarización de las herramientas bioinformáticas estuvo trabajando el Life Sciences Research Domain Task Force del Object Management Group (OMG) .

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El MGED está organizado en cinco grupos de trabajo que comprenden:

Como fruto del trabajo desarrollado hasta ahora se presentó en Noviembre de 2000 MIAME (Minimum Information About a Microarray Experiment) que es la información mínima que se debe almacenarse en una base de datos orientada a ser un repositorio público. El objetivo es aportar la información mínima de un experimento de microarray de expresión génica que asegure a otros grupos de trabajo la interpretación y verificación de los resultados.

Otros proyectos en los que se está trabajando desde esta misma iniciativa son:

MAML (Microarray markup language) es el primer borrador en lenguaje XML que ya ha sido enviado a OMG en el año 2000. Este lenguaje tiene como características:

• los datos se dan como un conjunto de matrices en dos dimensiones: anotaciones + datos.
• el formato de los datos es independiente del escáner y del software de análisis.
• la muestra y el tratamiento pueden representarse como un DAG.
• incluye el concepto de "composite images" y "composite spots".
• el sistema LIMS de microarrays NOMAD exportará los datos en formato MAML y ArrayExpress y GEO importara los datos en formato NAML.

Las Ontologías en bases de datos de expresión génica deben:

• Tener un vocabulario controlado.
• Tener un esquema con los conceptos y objetos o tablas de relaciones.
• Ser una representación del conocimiento que poseemos uniendo con otros dominios (secuencia genéticas, rutas proteínicas…) y facilitando el intercambio de datos mapeando los conceptos más generales.

Deberían establecerse dos tipos de controles: controles de normalización y controles de calidad para poder así comparar entre diferentes procedimientos utilizados.

Disponer de bases de datos de expresión génica análogas a DDBJ, EMBL o GenBank para secuencias supondría:

• disponer de los perfiles de expresión génica para diferentes organismos, tejidos y células
• mediante uniones a otras bases de datos genómicas se podrían ampliar conocimientos sobre las funciones de cada gen.
• podrían repetirse los experimentos (control de calidad de los resultados obtenidos).

Ya hay varios proyectos de repositorios de datos de expresión:

GEO-NCBI

GeneX-NCGR

Array Express-EBI

Stanford-Microarray Database

MIT -CHIPDB

University of Pennsylvania-RAD

Mouse in Jackson-GXD

Gene Logic

NCI.

International Life Science Institute (ILSI) que engloba 25 empresas farmacéuticas y alimentarias está recopilando información sobre la expresión de genes relacionados con la toxicidad bajo unas condiciones experimentales definidas.

Las dificultades que se presentan para la realización de estos repositorios son debidas a que los datos obtenidos son imágenes y además faltan unidades para la expresión génica y para la anotación del tipo de muestra. Se necesita desarrollar un sistema estándar de medidas para cuantificar la expresión génica, preparar controles estándar para los experimentos (en los chips y en las muestras), así como un sistema de nomenclatura para describir la muestra (especies, tipos de células, nomenclatura de los compuestos, tratamientos…).

 Monitorización de expresión génica: posibilita la cuantificación simultánea de la expresión de un número elevado de genes. También permite una aproximación cualitativa comprobando cuál es el patrón de expresión. Se puede estudiar la función de los genes al facilitar la identificación de qué genes están activados de forma diferencial cuando se comparan tejido sano y enfermo.

 Detección de mutaciones y polimorfismos: Permite el estudio de todos los posibles polimorfismos y la detección de mutaciones en genes complejos. El significado de la variación genética humana se analiza observando las mutaciones de secuencias de genes normales y correlacionándolas con enfermedades específicas.

 Secuenciación: existen aún reservas sobre la aplicación de los biochips en la secuenciación de novo de largas secuencias de DNA, aunque se pueden utilizar como controles de calidad – resecuenciación.

 Diagnóstico clínico - detección de microorganismos, permiten la identificación rápida empleando unos marcadores genéticos de los patógenos, así como de los posibles mecanismos asociados a la patogenicidad. Su finalidad es la de permitir la comprensión de la biología de los microorganismos, estudiar los mecanismos de resistencia frente a antibióticos, identificación de las cepas, identificar nuevas dianas génicas con valor terapéutico, desarrollo de medidas preventivas frente a las enfermedades infecciosas.

 Screening y toxicología de fármacos: el empleo de los biochips permite el analizar los cambios de expresión génica que se dan durante la administración de un fármaco de forma rápida así como la localización de nuevas posibles dianas terapéuticas y los efectos toxicológicos asociados.

 Seguimiento de terapia: permite valorar rasgos genéticos que pueden tener incidencia en la respuesta a una terapia, que invitasen a una variación en la misma o a su supresión en determinados casos.

 Medicina preventiva: el conocimiento de los rasgos genéticos de las poblaciones permitiría conocer la predisposición a sufrir algunas enfermedades, antes de que aparezcan síntomas, permitiendo así la realización de una mejor y auténtica medicina preventiva. Se pueden realizar estudios de epidemiología genética.

Las ventajas más características de las tecnologías basadas en biochips se pueden enumerar en los siguientes epígrafes:

• Alto rendimiento y capacidad
• Baja relación coste/eficiencia
• Alta especificidad y sensibilidad
• Permiten realizar ensayos con enfoques cuantitativos
• Ensayos reproducibles y transportables
• Paralelismo, es decir, realizar ensayos simultáneos utilizando muestras diferentes
• Multiplexación, es decir, realizar varios ensayos utilizando una única muestra
• No se precisa el manejo de radioactividad
• No se precisa disponer de un plan especial para la gestión de los residuos
• No se precisa un elevado coste en reactivos
• Se pueden conservar por más tiempo entidades biológicas raras, al emplearse cantidades microscópicas.

A pesar de las enormes potencialidades aportadas por el empleo de las tecnologías basadas en biochips, éstas presentan, en la actualidad, limitaciones que pueden ser enumeradas en los siguientes epígrafes:

• Reciente desarrollo y puesta a punto de las técnicas
• Escasa difusión de la tecnología
• Elevado coste de inversión en la adquisición del equipamiento necesario para el acceso a la tecnología
• Incompatibilidades entre los equipamientos
• Kits comerciales difícilmente personalizables para las necesidades del investigador

Algunas cuestiones que han de ser tenidas en cuenta antes de llevar a cabo la compra de un equipo pueden ser las siguientes:    

• Velocidad y eficiencia en la limpieza del "pin"
• Velocidad y precisión del "pin"
• Precisión de impresión
• Facilidad operativa de todo el equipo
• Sensores para detectar las operaciones defectuosas
• Mantenimiento del equipo (cuánto tiempo se puede dejar sin ser atendido sin que se deteriore de algún modo)
• Enfriamiento de las placas (uno de los gastos mayores)
• Control de la humedad y la temperatura en el equipo (factores críticos para la morfología del "spot")
• Número de "slides" que se pueden procesar de una vez
• Fiabilidad

En esta sección se ofrece una perspectiva de los principales acuerdos de colaboración entre las compañías del sector.

En este esquema se ofrece un mapa que resume cuál era la situación en Octubre de 1998,

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en la actualidad,  los principales acuerdos suscritos por las empresas que lideran el sector son:

My Gene, compañía coreana de tipo joint venture, prepara una solicitud de patente para un tratamiento de la diabetes utilizando un biochip que ella misma ha desarrollado.

BATALLAS DE PATENTES.- Se han originado diversos pleitos legales entre diferentes compañías por considerar que se  infringen derechos relativos a patentes y de propiedad industrial. Las demandas más notables que en la actualidad se han presentado ante los tribunales de justicia corresponden a:

• HySeq contra Affymetrix
• Incyte contra Affymetrix
• ACLARA Biosciences contra Caliper
• Caliper contra ACLARA Biosciences por apropiación indebida de secretos comerciales
• La revista norteamericana, Scientific American, publicó en su número correspondiente a Febrero de 2001 el siguiente cuadro que muestra gráficamente el cruce de litigios legales entre las diferentes empresas del sector:

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En Noviembre de 2000 fue publicado el informe "The State of the Art of Microarray Analysis: A profile of Microarray Laboratories" por el Association of Biomolecular Resource Facilities (ABRF) Microarray Research Group. Este estudio tiene por objeto reunir información procedente de laboratorios del ámbito académico, farmacéutico y comercial que ofrecen la tecnología de microarrays como un recurso compartido, así como de laboratorios individuales que utilizan estas tecnologías. En este informe se ofrecen los resultados de los datos recogidos desde Diciembre de 1999 hasta Febrero de 2000. Este estudio tiene vocación de continuidad, por lo que en Septiembre de 2000 se ha iniciado un nuevo período de obtención de datos, cuyas conclusiones se espera que sean hechas públicas en 2001. Entre sus conclusiones destacan:        

• La mayoría de los laboratorios comenzaron a utilizar las tecnologías de microarrays hace menos de dos años.
• La mayoría de los laboratorios planean su expansión tanto en lo que se refiere al número de su plantilla laboral como en lo relativo a su equipamiento instrumental.
• Los planes de expansión tanto de los usuarios de Arrayers como de la tecnología GeneChip, propiedad de la compañía Affymetrix, muestran una tendencia a crear laboratorios de recursos compartidos en los que ambas tecnologías coexisten y se complementan mutuamente.

Según el informe "A Strategic Business Analysis", publicado por Front Line Strategic Management Consulting, Inc., grupo especializado en biotecnología farmacéutica e industrias de dispositivos médicos localizado en Foster City, California, EE.UU:

• Se espera que las ventas de biochips alcancen los 184 millones en el año 2000 frente a los 12 millones de dólares que supusieron en el año 1997, llegando a los 632 millones de dólares para el año 2005.
• En comparación con la tecnología convencional en la que el coste por diana en el cribado de fármacos es de 1-2 dólares, se calcula que la tecnología basada en biochips puede reducir dicho coste hasta diez mil veces (0,0001 dólares).
• Los ADN chips suponen el 94% de la cuota de mercado actual, mientras que los Protein chips representan el resto. Los Labchips ya podrán ser adquiridos en el año 2000 siendo su previsión de cuota de mercado del 18% para el año 2005. Para esta fecha los Protein chips representarán el 10% del mercado, mientras que los ADN chips supondrán el 72% de las ventas.