- Objetivos
- Normas COVENIN para toma de
muestras - Determinación de la
Calidad Sanitaria (según Michael
Pelczar) - Investigaciones
sanitarias - Pruebas Bacteriológicas
de Contaminación - Cuenta estándar en
placa - Pruebas para determinar la
presencia de bacterias coliforme - Técnica de
filtración por membranas - Microorganismos deferentes de las
bacterias coliformes - Recuento por
dilución - Características
sanitarias del agua potable - Bacterias que indican
contaminación - Análisis sanitario del
agua - Purificación de Agua,
Protección de las Fuentes
Hídricas - Parámetros
Microbiológicos para Determinar la Calidad del
Agua - Estimación del
Número mas Probable (NMP) - Agar MacConkey
- Resultados
- Discusión de
resultados
Objetivo General:
- Determinar si hay presencia de microorganismos
aeróbios o
coliformes fecales en el agua para
el consumo
humano en la UNELLEZ.
Objetivos Específicos:
- Aprender la correcta realización de análisis para el estudio de las
aguas - Determinar si el agua de la
UNELLEZ está apta para el consumo
humano.
Según las
Normas COVENIN
para toma de muestras:
- Cuando se capta agua del
grifo o válvula, esta se deja fluir libremente por 5
minutos como mínimo, a fin de remover todo sedimento
adherido a las tuberías. Finalmente se capta la muestra, se
coloca la tapa y se cierra firmemente a fin de evitar contaminación
atmosférica. - Para la captación de muestras en
depósitos, estanques y otras aguas confinadas sin
corriente apreciable, se sumerge el recipiente invertido y se
desplaza en sentido horizontal creando una corriente
artificial. Se extrae la muestra y se
cierra rápidamente el recipiente. - Para muestreo de
agua confinada en depósitos, estanques u otras a
profundidades específicas se debe emplear un dispositivo
de muestreo (de
diseñado de manera tal, que el agua
fluya a través de tubos en el fondo del envase de
recepción. Cuando se requiera determinar los gases
disueltos; se podrá utilizar cualquier dispositivo menos
complicado, que permita las toma de muestra a la profundidad
requerida.
Determinación
de la Calidad Sanitaria
(según Michael Pelczar):
El agua puede ser perfectamente clara, libre de olores y
sabores pero estar aun contaminada. Obviamente, se necesitan
procedimientos
especiales para determinar su calidad
sanitaria.
La investigación de los sistemas
productores de agua por sanitarios e ingenieros calificados se
llaman investigaciones sanitarias. Estas incluyen la
inspección de
- La fuente sin tratar y las condiciones que influyen
en su calidad - Las operaciones de
la planta purificadoras o la construcción del pozo, y - El mecanismo para la distribución del líquido a los
consumidores.
Las investigaciones
sanitarias revelan si el agua se está produciendo en las
condiciones estipuladas.
Pruebas
Bacteriológicas de Contaminación:
Se presupone que el objetivo de
los análisis rutinarios son para determinar la
existencia de microorganismos patógenos en el agua. Sin
embargo, esto no es verdad, por las siguientes
razones:
- Los organismos patógenos llegan al agua en
forma esporádica y no sobreviven mucho tiempo, por lo
tanto, pueden no estar en una muestra que se envíe al
laboratorio. - Si se encuentran en pequeñas cantidades,
pueden pasar desapercibidos a los procedimientos
empleados. - Se necesitan 24 horas o mas para obtener resultados
de los exámenes y si se encuentran microorganismos
patógenos, muchas personas pueden haber tomado agua
antes de que se conozcan los resultados, y así haberse
expuestos a la infección.
Puestos que los exámenes de laboratorio
para encontrar microorganismos patógenos en el agua tienen
las desventajas enumeradas, se han desarrollado técnicas
para detectarlas en las excretas, particularmente las del
grupo
coliforme.
Este propósito ha probado ser satisfactorio en la
práctica y tiene las siguientes ventajas:
- Los microorganismos coliformes, sobre todo E. Coli,
habitan constantemente en el intestino humano en grandes
cantidades. - Estos microorganismos viven mas tiempo en el
agua que los patógenos. - Obviamente, una persona sana en
general, no elimina microorganismos patógenos, pero
puede desarrollársele una infección intestinal y
esos microorganismos aparecerán en las materias
fecales.
Las especies clásicas de este grupo son
Escherichia coli y Enterobacter aerogenes. La relación de
estos microorganismos con otros del grupo entérico –
Salmonella, Shigella, Proteus, Pseudomonas y alcaligenes, todos
los cuales son bacilos gramnegativos no esporulados.
Como estas especies tienen gran semejanza en su aspecto
morfológicos y características de cultivo, es necesario
recurrir a pruebas
bioquímicas para diferenciarlas. Reacciones que tengan las
siguientes cuatro características son muy importantes para
lograr este propósito:
- Capacidad para producir Indol. E. Coli lo produce, y
Ent. Aerogenes no. - Cantidad de ácido producida en un medio
especial de caldo glucosado, adicionado del indicador rojo de
metilo. Los dos microorganismos producen ácido de la
glucosa. Sin embargo, E. Coli produce pH mas bajo,
lo que hace que vire al rojo de metilo mientras que Ent.
Aerogenes no cambia el color. - Capacidad para producir acetilmetilcarbinol en un
medio de peptona glucosado. Este compuesto químico se
detecta por medio de la reacción de Voges –
Proskauer. E. Coli no produce acetilmetilcarbinol mientras que
Ent. Aerogenes sí lo hace. - Utilización de citrato de sodio. Ent.
Aerogenes es capaz de utilizar el citrato de sodio como su
única fuente de carbono,
esto es, se desarrollará en un medio de cultivo
químicamente definido en el cual el citrato de sodio es
el único compuesto de carbono. E.
Coli no se desarrolla en estas circunstancias.
Por conveniencia, a estas pruebas se las
ha designado en forma colectiva reacciones IMViC (I = Indol, M =
rojo de metilo, Vi = reacción Voges – Proskauer y C
= citrato).
Es necesario cuidar los siguientes detalles cuando se
sometan muestras de agua a análisis
bacteriológicos:
- La muestra se tomará en frasco
estéril. - La muestra ha de ser representativa de la fuente
original. - Se evitará la
contaminación de la muestra durante y después
de obtenerla. - La muestra se analizará lo mas pronto
posible. - Si no es posible examinar la muestra enseguida,
deberá guardarse en refrigeración entre 0 y 10
ºC.
Los procedimientos bacteriológicos de rutina
son:
- Cuenta en placas para determinar el número de
bacterias. - Pruebas que revelen la presencia de bacterias
coliformes
Se efectúan cuentas de
colonias después de haber sembrado en la placa cantidades
alícuotas de la muestra. La cuenta estándar en
placa no se recomienda en el caso del agua porque la que contiene
pocas bacterias patógenas obviamente es mas peligrosa que
las que contiene muchas saprofitas. Sin embargo, lo cual el agua
es de buena calidad tenga cuentas bajas,
menos de 100 por mililitro.
Pruebas
para determinar la presencia de bacterias
coliforme:
Varios medios
selectivos diferenciales facilitan mucho el proceso para
examinar muestras de agua en busca de microorganismos coliformes,
el examen supone tres pasos sucesivos:
- Prueba de presunción
- Prueba de confirmación
- Prueba de consumación.
Técnica
de filtración por membranas:
Consiste en los siguientes pasos; un disco filtrante
estéril se pone en la unidad de
filtración.
Se hace pasar un volumen de agua
por el disco filtrante, las bacterias serán detenidas en
la superficie de la membrana.
Se quita el disco filtrante y se pone sobre una
almohadilla absorbente que previamente se ha saturado con el
medio de cultivo apropiado. Las almohadillas absorbentes con los
discos filtrantes se acomodan en cajas de Petri de tamaño
especial, las cuales se incuban.
Después de la incubación se
desarrollarán colonias sobre el disco filtrante en
cualquier lugar donde hayan quedado bacterias atrapadas durante
el proceso de
filtración.
Esta técnica tiene muchas aplicaciones
útiles, unas de las cuales son:
- Se pueden examinar grandes volúmenes de agua;
teóricamente casi cualquier volumen de agua
se puede filtrar a través del disco y los
microorganismos de cualquier volumen quedarán en el
disco. - La membrana se puede pasar de un medio a otro con el
propósito de seleccionar y diferenciar los
microorganismos. - Se obtienen resultados mas rápidos que con los
métodos
convencionales. - Se logran estimaciones cuantitativas de ciertos tipos
de bacterias, como coliformes, cuando se usan los medios
apropiados.
Microorganismos
deferentes de las bacterias coliformes:
Muchas bacterias de los sistemas de aguas
son denominadas bacterias indeseables porque crean problemas de
olor, color, sabor y la
precipitación de compuestos insolubles en las
tuberías los cuales reducen u obstruyen el paso del
líquido.
Estreptococos fecales:
Los estreptococos fecales son bacterias entéricas
que viven en el intestino de los animales de
sangre
caliente y del hombre.
Streptococcus faecalis es representante de este grupo; otras
especies son S. Faecium, S bovis y S. Equinus. Debido a que S.
Faecalis, abunda en el intestino grueso del hombre, su
presencia en el agua significa contaminación fecal.
Con esta técnica se logra una estimación
del número de bacterias en la población, que pueden multiplicarse en un
medio líquido. Cualquier medio puede emplearse, siempre
que fomente el crecimiento de los microorganismos por
estudiar.
El recuento por dilución es mas exacto si se
inoculan varios tubos de medios de cultivos en porciones de 1 ml
de cada dilución. Varias porciones de las diluciones
críticas, en estas circunstancias, contienen un
microorganismos viable y otras no lo contienen. Se han calculado
tablas para saber en un momento dado el número más
probable de bacterias en la muestra.
Características sanitarias del agua
potable:
Para ser potable, es necesario que el agua sea limpia,
fresca, sin sabores u olores desagradables o que causen rechazo
de quien las consumen, y sin sustancias químicas y
microorganismos nocivos. De estas características deseadas
la mas difícil de lograr es la falta de microorganismos
nocivos. No es imposible, pero entraña vigilancia
constante y valoración o análisis
repetidos.
El problema se intensifica dado que la
eliminación de aguas negras suele ser completada el
eliminar el líquido sobrenadante en grandes cantidades de
agua, y la necesidad suele hacer que las mismas aguas en que se
eliminaron las otras, se empleen como fuentes de
agua potable por otras comunidades.
Bacterias que
indican contaminación:
El método
ideal de analizar el agua respecto a la seguridad o
sanidad bacteriológica incluye la búsqueda de
patógenos transmitidos por el agua.
El agua que contenga pocos patógenos por litro
puede estar lo suficientemente contaminada para causar algunos
casos de enfermedad. Si la excreta de una persona enferma
de fiebre tifoidea se eliminan y llegan a un depósito
empleado para contener agua potable, pueden aparecer casos de
fiebre tifoidea. Los patógenos son bastante pocos y
están dispersos, y es necesario examinar grandes muestras
para observar un microorganismo patógeno.
Se han empleado varios grupos de
bacterias que aparecen normalmente en el intestino del hombre o
los animales para
indicar la contaminación del agua potable por aguas
negras: los denominados estreptococos fecales, algunos anaerobios
esporógenos y las bacterias coliformes. Las bacterias
coliformes son los indicadores de
contaminación más empleados, especialmente en los
Estados unidos
de Norteamérica.
Bacterias coliformes:
Las bacterias coliformes incluyen la Escherichia coli y
otras bacterias que se asemejan morfológica y
fisiológicamente. Estos microorganismos con frecuencia
difieren entre sí en características
pequeñas; se diferenciaron docenas de especies, pero en la
actualidad solamente se reconocen seis. Se sabe que dos aparecen
con frecuencia suficiente como para mencionarse : E. Coli y
Aerobacter aerogenes.
Las bacterias coliformes son bacilos cortos,
gramnegativos, que fermentan la lactosa y forman ácido y
gas. Son
anaerobios facultativos y se multiplican a mayor rapidez a
temperaturas entre 30 y 37 ºC.
Las colonias de E. Coli en agar E.M.B. (eosina y azul de
metileno) tienen 2 a 4 mm de diámetro, un centro grande de
color oscuro e incluso negro, y tienen brillo verde
metálico cuando se observan con luz refleja. Las
colonias de A. Aerogenes en el mismo medio son mayores, muy
mucoides, y de color Rosado; con frecuencia tienen un centro
parduzco pequeño.
El diagnostico o determinación de las bacterias
coliformes en las muestras de agua se basa en la capacidad de
dichos microorganismos para producir gas a partir de
lactosa. Se inocula parte de la muestra (cinco partes de 10 ml
cada una) en tubos de fermentación de lactosa y se incuban a 37
ºC durante 48 horas. Se observan los tubos después de
24 y 48 horas, y la aparición de gas en ambos periodos
constituye una prueba positiva de presunción.
Bacterias distintas de las coliformes pueden producir
gas en lactosa; en consecuencia se necesita aislar las especies
que fermentan la lactosa, cosa que suele hacerse al inocular la
superficie de placa de agar E.M.B. con muestras de uno o mas
tubos de fermentación que contengan gas. El aspecto
de las colonias coliformes típicas es una prueba positiva
confirmada. Después de ello se hace el paso de una o mas
colonias (típicas, si las hay; de lo contrario cualquier
colonia sospechosa) a tubos de concentración de lactosa, y
placas inclinadas de agar y se incuban durante 24 horas. Gas en
el tubo de lactosa y la coloración de gram en la placa
inclinada de agar que, indique bacilos gramnegativos sin esporas,
harán que el resultado se designe como prueba positiva
completa con respecto a bacterias coliformes.
Purificación de
Agua, Protección de las Fuentes
Hídricas:
El primer paso para lograr la obtención de agua
pura, sea para una casa aislada, para toda una ciudad, es
proteger las fuentes de agua contra la
contaminación por aguas negras o desechos. Es
necesario que las fuentes o pozos estén situados a
distancias importantes de los estanques sépticos, establos
y otras fuentes de contaminación; es necesario que estas
construcciones de abasto hídrico estén hechas con
cuidado para impedir filtraciones del agua superficial y conviene
cubrirlas con una capa de concreto.
Filtración
La filtración es un medio eficaz para eliminar
microorganismos y otras sustancias de suspensión del agua.
Se emplean en la filtración de agua a gran escala dos tipos
de filtro de arena.
Los filtros lentos de arena, están hechos de
capas de arena fina, arena gruesa, grava y roca. El agua pasa
lentamente por el filtro, y bacterias, algas, protozoos son
captados en las capas superficiales de la arena fina. Estos
microorganismos se multiplican y producen una masa gelatinosa en
la que se absorben otros microorganismos y partículas de
suspensión.
Parámetros
Microbiológicos para Determinar la Calidad del
Agua.
Ya KOLKWITZ y MARSSON (1908) utilizaron bacterias,
además de otros seres vivos vegetales y animales, como
organismos indicadores de
la calidad de las aguas y mencionan también diversas
especies que toman parte en las distintas etapas de la
descomposición -por ejemplo, Zoogloea ramigera y
Sphaerotilus natans.
Es preciso hallar el número de gérmenes
saprofitos o de colonias y de bacterias procedentes del intestino
humano como indicadores de contaminación fecal (BONDE,
1977; DAUBNER y PETER, 1974; COL, 1975). A este respecto,
conviene destacar la importancia que tienen las cifras de coli y
coliformes, así como el título colimétrico.
Son bacterias coliformes las pertenecientes al las
enterobacteráceas que fermentan la lactosa con producción de gas y ácido
(H2, CO2). Pertenecen a los géneros
Escherichia, Citrobacter, Enterobacter y Klebsiella.
Para determinar el número de estas bacterias, se
suele emplear el medio selectivo de Endo
(agar-fucsina-sulfito-lactosa). Después de 24 – 48
horas de incubación a 37 ºC, se halla el
número total de coliformes y a 44 ºC el de coliformes
fecales. La declaración obligatoria de estos
gérmenes requiere su diferenciación por medio de
las pruebas bioquímicas correspondiente (serie
colorimétrica, prueba IMViC; DAUBNER, Y PETER, 1974;
REICHARDT 1978).
En la mayoría de los países se han
admitido los límites
máximos admisibles para el agua potable, la de uso
doméstico y la de baño. La primera no debe contener
ningún agente patógeno, así se considera
cuando en 10 ml de agua no se encuentran gérmenes
coliformes y, por tanto, no estén presente tampoco la
especie Escherichia coli. Para las aguas de baños tienen
validez los siguientes requisitos de calidad en varios
países (Comunidad
Económica Europea): el número total de coliforme
debe ser, en lo posible, inferior a 500 y en todo caso no
llegará a 10.000 por 100 ml – el de coliforme
fecales, menor de 100 y 2.000, respectivamente, por 100 ml de
agua. El primer número tiene valor
indicativo, el segundo es de cumplimiento obligatorio. Si se
llega a este en mas del 20 % en los análisis de las
muestras tomadas durante 14 días por lo menos, es
necesario prohibir el baño en las aguas
afectadas.
Como complemento de la cantidad de gérmenes
coliformes, a veces se determina el número de
estreptococos fecales (enterococos) (RITTER, 1974), que es
generalmente mas bajo que el de aquellos. Si el número de
esto estreptococos es elevado, hay que pensar en una
contaminación fecal reciente.
Estimación
del Número mas Probable (NMP):
Se basan estos métodos en
la presunción de que las bacterias se hallan normalmente
distribuidas en un medio líquido, esto es, en las muestras
repetidas del mismo tamaño de un mismo producto, debe
esperarse contengan el mismo número de gérmenes
como promedio; naturalmente, algunas de las muestras pueden
contener algunos gérmenes mas o menos. La cifra media es
el número más probable (Most Probable Number o
MPN).
Esta técnica se usa principalmente para la
estimación de bacilos coliformes, empleando caldo de
MacConkey, pero puede utilizarse casi para toda clase de
gérmenes en muestras líquidas si puede observarse
fácilmente el crecimiento, por ejemplo, si hay turbidez y
producción de ácido. Ejemplos de
ellos son las levaduras y hongos en jugos y
bebidas de frutas, clostridios en emulsiones de alimentos,
cadenas de esporos en suspensiones de harina.
Es el medio primario selectivo y diferencial que se
emplea mas a menudo; contiene violeta cristal para inhibir el
crecimiento de cocos grampositivos y rojo neutro como indicador
de pH, que le
otorga propiedades diferenciales. Los bacilos gramnegativos
desarrollan fácilmente ; los fermentadores de lactosa
producen metabolismo
ácidos
que disminuyen el pH de medio próximo a la colonia. En esa
zona el rojo neutro vira al rojo. Los no fermentadores de lactosa
permanecen incoloros y translúcidos.
Experimento # 1:
"Contaje de aeróbios totales
(aeróbios mesófilos)"
en este experimento se observó la
formación de colonias pequeñas. Se realizó
el contaje de colonias en las placas de 10-2 y el
contaje total dio: 27 y se procedió a realizar la
ecuación;
27×100 Þ 2700
2,7×103 UFC / ml
Experimento # 2:
"Contaje de coliformes"
en esta prueba se pudo observar que no hubo
formación de colonias en las placas de agar violeta rojo
billis, en ninguna de las diluciones preparadas.
Experimento # 3:
"Número mas probable de coliforme
(N.M.P)"
en esta prueba se utilizaron nueve tubos con L.S.T.
laurilsulfatotriptona y se observó que en ninguno de los
nueve tubos hubo crecimiento
Experimento # 4
"Número mas probable (N.M.P) de estreptococos
fecales"
en esta prueba se utilizaron 9 tubos de diferentes
diluciones: 10-1, 10-2, 10-3 de
color morado (Púrpura bromocresol) o color glucosa
ácido (C.G.A.) y ninguna dio positivo porque no
había turbidez en el agua.
Experimento # 5
"Análisis del agua con el filtro mil
poros"
en este análisis se observó que hubo
formación de colonias rosadas o sea hay presencia de
coliformes.
Experimento # 1:
En esta prueba la cual se hizo con seis placas en las
cuales se agregó 1 ml de las diluciones preparadas
(10-1, 10-2, 10-3) luego se le
agregó agar con otro diluyente realizándose
así la siembra por profundidad a las 21 horas se
observó y no había crecimiento y se incubó
hasta el día siguiente. Luego a las 45 horas se
notó que hubo formación de colonias en las placas y
se procedió al contaje el cual dio:
27×100 Þ 2700
2,7×103 UFC / ml
Experimento # 2:
En esta prueba se utilizaron seis placas, dos para cada
dilución (10-1, 10-2,
10-3)a las cuales se les agregó 1 ml de las
disoluciones, luego se le agregó el agar violeta rojo
billis se diluyó con el ml de soluciones
previamente preparadas y se le terminó de agregar lo que
queda de agar como una sobrecapa, se incubó a 32 ºC
por 21 horas y al observar no hubo formación de colonias
se volvió a incubar a las 45 horas se observó de
nuevo que no había formación de colonias por lo
tanto se llegó a la conclusión que nuestra muestra
no tenía "coliformes".
Experimento # 3:
En esta prueba se utilizó nueve tubos de L.S.T.
Lauril sulfato triptona. Se le agregó un ml de las
disoluciones (10-1, 10-2, 10-3)
a los tubos. Y se incubó por 21 horas. Al observarse
notamos que no hubo crecimiento de microorganismos en ninguno de
los tubos. Por lo tanto concluimos que en la muestra no
habían coliformes presentes ni enterobacterias.
Experimento # 4:
En este experimento se utilizaron nueve tubos que
contenían caldo glucosado ácido (C.G.A) a lo que se
le agregó 1 ml de las diluciones (10-1,
10-2, 10-3) se incubó a 21 horas a
35 ºC y se observó que no hubo crecimiento de
microorganismos en ninguno de los tubos de caldo glucosa
ácido y concluimos que no hay presencia de estreptococos
fecales en la muestra tomada del grifo.
Experimento # 5:
El análisis del agua con el filtro mil poros se
realizó con la muestra de agua del grupo número 6.
este grupo tomó las muestras de agua de un tanque o pipote
y se observó que hubo formación de colonias rosadas
o sea hay presencia de coliformes. Para el experimento se
utilizó una placa con agar MacKonkey, un disco filtrante,
un soporte para embudo, una bomba de vacío,
etc.
Autor:
Libro: Métodos Microbiológicos
Editorial: Aribia S.A. Zaragoza (España).