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Determinación de microorganismos




Enviado por cibercrazy5000



    1. Objetivos
    2. Normas COVENIN para toma de
      muestras
    3. Determinación de la
      Calidad Sanitaria (según Michael
      Pelczar)
    4. Investigaciones
      sanitarias
    5. Pruebas Bacteriológicas
      de Contaminación
    6. Cuenta estándar en
      placa
    7. Pruebas para determinar la
      presencia de bacterias coliforme
    8. Técnica de
      filtración por membranas
    9. Microorganismos deferentes de las
      bacterias coliformes
    10. Recuento por
      dilución
    11. Características
      sanitarias del agua potable
    12. Bacterias que indican
      contaminación
    13. Análisis sanitario del
      agua
    14. Purificación de Agua,
      Protección de las Fuentes
      Hídricas
    15. Parámetros
      Microbiológicos para Determinar la Calidad del
      Agua
    16. Estimación del
      Número mas Probable (NMP)
    17. Agar MacConkey
    18. Resultados
    19. Discusión de
      resultados

    OBJETIVOS

    Objetivo General:

    • Determinar si hay presencia de microorganismos
      aeróbios o
      coliformes fecales en el agua para
      el consumo
      humano en la UNELLEZ.

    Objetivos Específicos:

    • Aprender la correcta realización de análisis para el estudio de las
      aguas
    • Determinar si el agua de la
      UNELLEZ está apta para el consumo
      humano.

    Según las
    Normas COVENIN
    para toma de muestras:

    • Cuando se capta agua del
      grifo o válvula, esta se deja fluir libremente por 5
      minutos como mínimo, a fin de remover todo sedimento
      adherido a las tuberías. Finalmente se capta la muestra, se
      coloca la tapa y se cierra firmemente a fin de evitar contaminación
      atmosférica.
    • Para la captación de muestras en
      depósitos, estanques y otras aguas confinadas sin
      corriente apreciable, se sumerge el recipiente invertido y se
      desplaza en sentido horizontal creando una corriente
      artificial. Se extrae la muestra y se
      cierra rápidamente el recipiente.
    • Para muestreo de
      agua confinada en depósitos, estanques u otras a
      profundidades específicas se debe emplear un dispositivo
      de muestreo (de
      diseñado de manera tal, que el agua
      fluya a través de tubos en el fondo del envase de
      recepción. Cuando se requiera determinar los gases
      disueltos; se podrá utilizar cualquier dispositivo menos
      complicado, que permita las toma de muestra a la profundidad
      requerida.

    Determinación
    de la Calidad Sanitaria
    (según Michael Pelczar):

    El agua puede ser perfectamente clara, libre de olores y
    sabores pero estar aun contaminada. Obviamente, se necesitan
    procedimientos
    especiales para determinar su calidad
    sanitaria.

    Investigaciones
    sanitarias:

    La investigación de los sistemas
    productores de agua por sanitarios e ingenieros calificados se
    llaman investigaciones sanitarias. Estas incluyen la
    inspección de

    1. La fuente sin tratar y las condiciones que influyen
      en su calidad
    2. Las operaciones de
      la planta purificadoras o la construcción del pozo, y
    3. El mecanismo para la distribución del líquido a los
      consumidores.

    Las investigaciones
    sanitarias revelan si el agua se está produciendo en las
    condiciones estipuladas.

    Pruebas
    Bacteriológicas de Contaminación:

    Se presupone que el objetivo de
    los análisis rutinarios son para determinar la
    existencia de microorganismos patógenos en el agua. Sin
    embargo, esto no es verdad, por las siguientes
    razones:

    1. Los organismos patógenos llegan al agua en
      forma esporádica y no sobreviven mucho tiempo, por lo
      tanto, pueden no estar en una muestra que se envíe al
      laboratorio.
    2. Si se encuentran en pequeñas cantidades,
      pueden pasar desapercibidos a los procedimientos
      empleados.
    3. Se necesitan 24 horas o mas para obtener resultados
      de los exámenes y si se encuentran microorganismos
      patógenos, muchas personas pueden haber tomado agua
      antes de que se conozcan los resultados, y así haberse
      expuestos a la infección.

    Puestos que los exámenes de laboratorio
    para encontrar microorganismos patógenos en el agua tienen
    las desventajas enumeradas, se han desarrollado técnicas
    para detectarlas en las excretas, particularmente las del
    grupo
    coliforme.

    Este propósito ha probado ser satisfactorio en la
    práctica y tiene las siguientes ventajas:

    1. Los microorganismos coliformes, sobre todo E. Coli,
      habitan constantemente en el intestino humano en grandes
      cantidades.
    2. Estos microorganismos viven mas tiempo en el
      agua que los patógenos.
    3. Obviamente, una persona sana en
      general, no elimina microorganismos patógenos, pero
      puede desarrollársele una infección intestinal y
      esos microorganismos aparecerán en las materias
      fecales.

    Las especies clásicas de este grupo son
    Escherichia coli y Enterobacter aerogenes. La relación de
    estos microorganismos con otros del grupo entérico –
    Salmonella, Shigella, Proteus, Pseudomonas y alcaligenes, todos
    los cuales son bacilos gramnegativos no esporulados.

    Como estas especies tienen gran semejanza en su aspecto
    morfológicos y características de cultivo, es necesario
    recurrir a pruebas
    bioquímicas para diferenciarlas. Reacciones que tengan las
    siguientes cuatro características son muy importantes para
    lograr este propósito:

    1. Capacidad para producir Indol. E. Coli lo produce, y
      Ent. Aerogenes no.
    2. Cantidad de ácido producida en un medio
      especial de caldo glucosado, adicionado del indicador rojo de
      metilo. Los dos microorganismos producen ácido de la
      glucosa. Sin embargo, E. Coli produce pH mas bajo,
      lo que hace que vire al rojo de metilo mientras que Ent.
      Aerogenes no cambia el color.
    3. Capacidad para producir acetilmetilcarbinol en un
      medio de peptona glucosado. Este compuesto químico se
      detecta por medio de la reacción de Voges –
      Proskauer. E. Coli no produce acetilmetilcarbinol mientras que
      Ent. Aerogenes sí lo hace.
    4. Utilización de citrato de sodio. Ent.
      Aerogenes es capaz de utilizar el citrato de sodio como su
      única fuente de carbono,
      esto es, se desarrollará en un medio de cultivo
      químicamente definido en el cual el citrato de sodio es
      el único compuesto de carbono. E.
      Coli no se desarrolla en estas circunstancias.

    Por conveniencia, a estas pruebas se las
    ha designado en forma colectiva reacciones IMViC (I = Indol, M =
    rojo de metilo, Vi = reacción Voges – Proskauer y C
    = citrato).

    Es necesario cuidar los siguientes detalles cuando se
    sometan muestras de agua a análisis
    bacteriológicos:

    1. La muestra se tomará en frasco
      estéril.
    2. La muestra ha de ser representativa de la fuente
      original.
    3. Se evitará la
      contaminación de la muestra durante y después
      de obtenerla.
    4. La muestra se analizará lo mas pronto
      posible.
    5. Si no es posible examinar la muestra enseguida,
      deberá guardarse en refrigeración entre 0 y 10
      ºC.

    Los procedimientos bacteriológicos de rutina
    son:

    1. Cuenta en placas para determinar el número de
      bacterias.
    2. Pruebas que revelen la presencia de bacterias
      coliformes

    Cuenta
    estándar en placa:

    Se efectúan cuentas de
    colonias después de haber sembrado en la placa cantidades
    alícuotas de la muestra. La cuenta estándar en
    placa no se recomienda en el caso del agua porque la que contiene
    pocas bacterias patógenas obviamente es mas peligrosa que
    las que contiene muchas saprofitas. Sin embargo, lo cual el agua
    es de buena calidad tenga cuentas bajas,
    menos de 100 por mililitro.

    Pruebas
    para determinar la presencia de bacterias
    coliforme:

    Varios medios
    selectivos diferenciales facilitan mucho el proceso para
    examinar muestras de agua en busca de microorganismos coliformes,
    el examen supone tres pasos sucesivos:

    1. Prueba de presunción
    2. Prueba de confirmación
    3. Prueba de consumación.

    Técnica
    de filtración por membranas:

    Consiste en los siguientes pasos; un disco filtrante
    estéril se pone en la unidad de
    filtración.

    Se hace pasar un volumen de agua
    por el disco filtrante, las bacterias serán detenidas en
    la superficie de la membrana.

    Se quita el disco filtrante y se pone sobre una
    almohadilla absorbente que previamente se ha saturado con el
    medio de cultivo apropiado. Las almohadillas absorbentes con los
    discos filtrantes se acomodan en cajas de Petri de tamaño
    especial, las cuales se incuban.

    Después de la incubación se
    desarrollarán colonias sobre el disco filtrante en
    cualquier lugar donde hayan quedado bacterias atrapadas durante
    el proceso de
    filtración.

    Esta técnica tiene muchas aplicaciones
    útiles, unas de las cuales son:

    1. Se pueden examinar grandes volúmenes de agua;
      teóricamente casi cualquier volumen de agua
      se puede filtrar a través del disco y los
      microorganismos de cualquier volumen quedarán en el
      disco.
    2. La membrana se puede pasar de un medio a otro con el
      propósito de seleccionar y diferenciar los
      microorganismos.
    3. Se obtienen resultados mas rápidos que con los
      métodos
      convencionales.
    4. Se logran estimaciones cuantitativas de ciertos tipos
      de bacterias, como coliformes, cuando se usan los medios
      apropiados.

    Microorganismos
    deferentes de las bacterias coliformes:

    Muchas bacterias de los sistemas de aguas
    son denominadas bacterias indeseables porque crean problemas de
    olor, color, sabor y la
    precipitación de compuestos insolubles en las
    tuberías los cuales reducen u obstruyen el paso del
    líquido.

    Estreptococos fecales:

    Los estreptococos fecales son bacterias entéricas
    que viven en el intestino de los animales de
    sangre
    caliente y del hombre.
    Streptococcus faecalis es representante de este grupo; otras
    especies son S. Faecium, S bovis y S. Equinus. Debido a que S.
    Faecalis, abunda en el intestino grueso del hombre, su
    presencia en el agua significa contaminación fecal.

    Recuento por
    dilución:

    Con esta técnica se logra una estimación
    del número de bacterias en la población, que pueden multiplicarse en un
    medio líquido. Cualquier medio puede emplearse, siempre
    que fomente el crecimiento de los microorganismos por
    estudiar.

    El recuento por dilución es mas exacto si se
    inoculan varios tubos de medios de cultivos en porciones de 1 ml
    de cada dilución. Varias porciones de las diluciones
    críticas, en estas circunstancias, contienen un
    microorganismos viable y otras no lo contienen. Se han calculado
    tablas para saber en un momento dado el número más
    probable de bacterias en la muestra.

    Características sanitarias del agua
    potable:

    Para ser potable, es necesario que el agua sea limpia,
    fresca, sin sabores u olores desagradables o que causen rechazo
    de quien las consumen, y sin sustancias químicas y
    microorganismos nocivos. De estas características deseadas
    la mas difícil de lograr es la falta de microorganismos
    nocivos. No es imposible, pero entraña vigilancia
    constante y valoración o análisis
    repetidos.

    El problema se intensifica dado que la
    eliminación de aguas negras suele ser completada el
    eliminar el líquido sobrenadante en grandes cantidades de
    agua, y la necesidad suele hacer que las mismas aguas en que se
    eliminaron las otras, se empleen como fuentes de
    agua potable por otras comunidades.

    Bacterias que
    indican contaminación:

    El método
    ideal de analizar el agua respecto a la seguridad o
    sanidad bacteriológica incluye la búsqueda de
    patógenos transmitidos por el agua.

    El agua que contenga pocos patógenos por litro
    puede estar lo suficientemente contaminada para causar algunos
    casos de enfermedad. Si la excreta de una persona enferma
    de fiebre tifoidea se eliminan y llegan a un depósito
    empleado para contener agua potable, pueden aparecer casos de
    fiebre tifoidea. Los patógenos son bastante pocos y
    están dispersos, y es necesario examinar grandes muestras
    para observar un microorganismo patógeno.

    Se han empleado varios grupos de
    bacterias que aparecen normalmente en el intestino del hombre o
    los animales para
    indicar la contaminación del agua potable por aguas
    negras: los denominados estreptococos fecales, algunos anaerobios
    esporógenos y las bacterias coliformes. Las bacterias
    coliformes son los indicadores de
    contaminación más empleados, especialmente en los
    Estados unidos
    de Norteamérica.

    Bacterias coliformes:

    Las bacterias coliformes incluyen la Escherichia coli y
    otras bacterias que se asemejan morfológica y
    fisiológicamente. Estos microorganismos con frecuencia
    difieren entre sí en características
    pequeñas; se diferenciaron docenas de especies, pero en la
    actualidad solamente se reconocen seis. Se sabe que dos aparecen
    con frecuencia suficiente como para mencionarse : E. Coli y
    Aerobacter aerogenes.

    Las bacterias coliformes son bacilos cortos,
    gramnegativos, que fermentan la lactosa y forman ácido y
    gas. Son
    anaerobios facultativos y se multiplican a mayor rapidez a
    temperaturas entre 30 y 37 ºC.

    Las colonias de E. Coli en agar E.M.B. (eosina y azul de
    metileno) tienen 2 a 4 mm de diámetro, un centro grande de
    color oscuro e incluso negro, y tienen brillo verde
    metálico cuando se observan con luz refleja. Las
    colonias de A. Aerogenes en el mismo medio son mayores, muy
    mucoides, y de color Rosado; con frecuencia tienen un centro
    parduzco pequeño.

    Análisis
    sanitario del agua:

    El diagnostico o determinación de las bacterias
    coliformes en las muestras de agua se basa en la capacidad de
    dichos microorganismos para producir gas a partir de
    lactosa. Se inocula parte de la muestra (cinco partes de 10 ml
    cada una) en tubos de fermentación de lactosa y se incuban a 37
    ºC durante 48 horas. Se observan los tubos después de
    24 y 48 horas, y la aparición de gas en ambos periodos
    constituye una prueba positiva de presunción.

    Bacterias distintas de las coliformes pueden producir
    gas en lactosa; en consecuencia se necesita aislar las especies
    que fermentan la lactosa, cosa que suele hacerse al inocular la
    superficie de placa de agar E.M.B. con muestras de uno o mas
    tubos de fermentación que contengan gas. El aspecto
    de las colonias coliformes típicas es una prueba positiva
    confirmada. Después de ello se hace el paso de una o mas
    colonias (típicas, si las hay; de lo contrario cualquier
    colonia sospechosa) a tubos de concentración de lactosa, y
    placas inclinadas de agar y se incuban durante 24 horas. Gas en
    el tubo de lactosa y la coloración de gram en la placa
    inclinada de agar que, indique bacilos gramnegativos sin esporas,
    harán que el resultado se designe como prueba positiva
    completa con respecto a bacterias coliformes.

    Purificación de
    Agua, Protección de las Fuentes
    Hídricas:

    El primer paso para lograr la obtención de agua
    pura, sea para una casa aislada, para toda una ciudad, es
    proteger las fuentes de agua contra la
    contaminación por aguas negras o desechos. Es
    necesario que las fuentes o pozos estén situados a
    distancias importantes de los estanques sépticos, establos
    y otras fuentes de contaminación; es necesario que estas
    construcciones de abasto hídrico estén hechas con
    cuidado para impedir filtraciones del agua superficial y conviene
    cubrirlas con una capa de concreto.

    Filtración

    La filtración es un medio eficaz para eliminar
    microorganismos y otras sustancias de suspensión del agua.
    Se emplean en la filtración de agua a gran escala dos tipos
    de filtro de arena.

    Los filtros lentos de arena, están hechos de
    capas de arena fina, arena gruesa, grava y roca. El agua pasa
    lentamente por el filtro, y bacterias, algas, protozoos son
    captados en las capas superficiales de la arena fina. Estos
    microorganismos se multiplican y producen una masa gelatinosa en
    la que se absorben otros microorganismos y partículas de
    suspensión.

    Parámetros
    Microbiológicos para Determinar la Calidad del
    Agua.

    Ya KOLKWITZ y MARSSON (1908) utilizaron bacterias,
    además de otros seres vivos vegetales y animales, como
    organismos indicadores de
    la calidad de las aguas y mencionan también diversas
    especies que toman parte en las distintas etapas de la
    descomposición -por ejemplo, Zoogloea ramigera y
    Sphaerotilus natans.

    Es preciso hallar el número de gérmenes
    saprofitos o de colonias y de bacterias procedentes del intestino
    humano como indicadores de contaminación fecal (BONDE,
    1977; DAUBNER y PETER, 1974; COL, 1975). A este respecto,
    conviene destacar la importancia que tienen las cifras de coli y
    coliformes, así como el título colimétrico.
    Son bacterias coliformes las pertenecientes al las
    enterobacteráceas que fermentan la lactosa con producción de gas y ácido
    (H2, CO2). Pertenecen a los géneros
    Escherichia, Citrobacter, Enterobacter y Klebsiella.

    Para determinar el número de estas bacterias, se
    suele emplear el medio selectivo de Endo
    (agar-fucsina-sulfito-lactosa). Después de 24 – 48
    horas de incubación a 37 ºC, se halla el
    número total de coliformes y a 44 ºC el de coliformes
    fecales. La declaración obligatoria de estos
    gérmenes requiere su diferenciación por medio de
    las pruebas bioquímicas correspondiente (serie
    colorimétrica, prueba IMViC; DAUBNER, Y PETER, 1974;
    REICHARDT 1978).

    En la mayoría de los países se han
    admitido los límites
    máximos admisibles para el agua potable, la de uso
    doméstico y la de baño. La primera no debe contener
    ningún agente patógeno, así se considera
    cuando en 10 ml de agua no se encuentran gérmenes
    coliformes y, por tanto, no estén presente tampoco la
    especie Escherichia coli. Para las aguas de baños tienen
    validez los siguientes requisitos de calidad en varios
    países (Comunidad
    Económica Europea): el número total de coliforme
    debe ser, en lo posible, inferior a 500 y en todo caso no
    llegará a 10.000 por 100 ml – el de coliforme
    fecales, menor de 100 y 2.000, respectivamente, por 100 ml de
    agua. El primer número tiene valor
    indicativo, el segundo es de cumplimiento obligatorio. Si se
    llega a este en mas del 20 % en los análisis de las
    muestras tomadas durante 14 días por lo menos, es
    necesario prohibir el baño en las aguas
    afectadas.

    Como complemento de la cantidad de gérmenes
    coliformes, a veces se determina el número de
    estreptococos fecales (enterococos) (RITTER, 1974), que es
    generalmente mas bajo que el de aquellos. Si el número de
    esto estreptococos es elevado, hay que pensar en una
    contaminación fecal reciente.

    Estimación
    del Número mas Probable (NMP):

    Se basan estos métodos en
    la presunción de que las bacterias se hallan normalmente
    distribuidas en un medio líquido, esto es, en las muestras
    repetidas del mismo tamaño de un mismo producto, debe
    esperarse contengan el mismo número de gérmenes
    como promedio; naturalmente, algunas de las muestras pueden
    contener algunos gérmenes mas o menos. La cifra media es
    el número más probable (Most Probable Number o
    MPN).

    Esta técnica se usa principalmente para la
    estimación de bacilos coliformes, empleando caldo de
    MacConkey, pero puede utilizarse casi para toda clase de
    gérmenes en muestras líquidas si puede observarse
    fácilmente el crecimiento, por ejemplo, si hay turbidez y
    producción de ácido. Ejemplos de
    ellos son las levaduras y hongos en jugos y
    bebidas de frutas, clostridios en emulsiones de alimentos,
    cadenas de esporos en suspensiones de harina.

    Agar
    MacConkey:

    Es el medio primario selectivo y diferencial que se
    emplea mas a menudo; contiene violeta cristal para inhibir el
    crecimiento de cocos grampositivos y rojo neutro como indicador
    de pH, que le
    otorga propiedades diferenciales. Los bacilos gramnegativos
    desarrollan fácilmente ; los fermentadores de lactosa
    producen metabolismo
    ácidos
    que disminuyen el pH de medio próximo a la colonia. En esa
    zona el rojo neutro vira al rojo. Los no fermentadores de lactosa
    permanecen incoloros y translúcidos.

    RESULTADOS

    Experimento # 1:

    "Contaje de aeróbios totales
    (aeróbios mesófilos)"

    en este experimento se observó la
    formación de colonias pequeñas. Se realizó
    el contaje de colonias en las placas de 10-2 y el
    contaje total dio: 27 y se procedió a realizar la
    ecuación;

    27×100 Þ 2700

    2,7×103 UFC / ml

    Experimento # 2:

    "Contaje de coliformes"

    en esta prueba se pudo observar que no hubo
    formación de colonias en las placas de agar violeta rojo
    billis, en ninguna de las diluciones preparadas.

    Experimento # 3:

    "Número mas probable de coliforme
    (N.M.P)"

    en esta prueba se utilizaron nueve tubos con L.S.T.
    laurilsulfatotriptona y se observó que en ninguno de los
    nueve tubos hubo crecimiento

    Experimento # 4

    "Número mas probable (N.M.P) de estreptococos
    fecales"

    en esta prueba se utilizaron 9 tubos de diferentes
    diluciones: 10-1, 10-2, 10-3 de
    color morado (Púrpura bromocresol) o color glucosa
    ácido (C.G.A.) y ninguna dio positivo porque no
    había turbidez en el agua.

    Experimento # 5

    "Análisis del agua con el filtro mil
    poros"

    en este análisis se observó que hubo
    formación de colonias rosadas o sea hay presencia de
    coliformes.

    DISCUSIÓN DE RESULTADOS:

    Experimento # 1:

    En esta prueba la cual se hizo con seis placas en las
    cuales se agregó 1 ml de las diluciones preparadas
    (10-1, 10-2, 10-3) luego se le
    agregó agar con otro diluyente realizándose
    así la siembra por profundidad a las 21 horas se
    observó y no había crecimiento y se incubó
    hasta el día siguiente. Luego a las 45 horas se
    notó que hubo formación de colonias en las placas y
    se procedió al contaje el cual dio:

    27×100 Þ 2700

    2,7×103 UFC / ml

    Experimento # 2:

    En esta prueba se utilizaron seis placas, dos para cada
    dilución (10-1, 10-2,
    10-3)a las cuales se les agregó 1 ml de las
    disoluciones, luego se le agregó el agar violeta rojo
    billis se diluyó con el ml de soluciones
    previamente preparadas y se le terminó de agregar lo que
    queda de agar como una sobrecapa, se incubó a 32 ºC
    por 21 horas y al observar no hubo formación de colonias
    se volvió a incubar a las 45 horas se observó de
    nuevo que no había formación de colonias por lo
    tanto se llegó a la conclusión que nuestra muestra
    no tenía "coliformes".

    Experimento # 3:

    En esta prueba se utilizó nueve tubos de L.S.T.
    Lauril sulfato triptona. Se le agregó un ml de las
    disoluciones (10-1, 10-2, 10-3)
    a los tubos. Y se incubó por 21 horas. Al observarse
    notamos que no hubo crecimiento de microorganismos en ninguno de
    los tubos. Por lo tanto concluimos que en la muestra no
    habían coliformes presentes ni enterobacterias.

    Experimento # 4:

    En este experimento se utilizaron nueve tubos que
    contenían caldo glucosado ácido (C.G.A) a lo que se
    le agregó 1 ml de las diluciones (10-1,
    10-2, 10-3) se incubó a 21 horas a
    35 ºC y se observó que no hubo crecimiento de
    microorganismos en ninguno de los tubos de caldo glucosa
    ácido y concluimos que no hay presencia de estreptococos
    fecales en la muestra tomada del grifo.

    Experimento # 5:

    El análisis del agua con el filtro mil poros se
    realizó con la muestra de agua del grupo número 6.
    este grupo tomó las muestras de agua de un tanque o pipote
    y se observó que hubo formación de colonias rosadas
    o sea hay presencia de coliformes. Para el experimento se
    utilizó una placa con agar MacKonkey, un disco filtrante,
    un soporte para embudo, una bomba de vacío,
    etc.

    BIBLIOGRAFÍA

     

     

    Autor:

    Libro: Métodos Microbiológicos

    Editorial: Aribia S.A. Zaragoza (España).

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