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Determinación de microorganismos

Enviado por cibercrazy5000



  1. Objetivos
  2. Normas COVENIN para toma de muestras
  3. Determinación de la Calidad Sanitaria (según Michael Pelczar)
  4. Investigaciones sanitarias
  5. Pruebas Bacteriológicas de Contaminación
  6. Cuenta estándar en placa
  7. Pruebas para determinar la presencia de bacterias coliforme
  8. Técnica de filtración por membranas
  9. Microorganismos deferentes de las bacterias coliformes
  10. Recuento por dilución
  11. Características sanitarias del agua potable
  12. Bacterias que indican contaminación
  13. Análisis sanitario del agua
  14. Purificación de Agua, Protección de las Fuentes Hídricas
  15. Parámetros Microbiológicos para Determinar la Calidad del Agua
  16. Estimación del Número mas Probable (NMP)
  17. Agar MacConkey
  18. Resultados
  19. Discusión de resultados

OBJETIVOS

Objetivo General:

  • Determinar si hay presencia de microorganismos aeróbios o coliformes fecales en el agua para el consumo humano en la UNELLEZ.

Objetivos Específicos:

  • Aprender la correcta realización de análisis para el estudio de las aguas
  • Determinar si el agua de la UNELLEZ está apta para el consumo humano.

Según las Normas COVENIN para toma de muestras:

  • Cuando se capta agua del grifo o válvula, esta se deja fluir libremente por 5 minutos como mínimo, a fin de remover todo sedimento adherido a las tuberías. Finalmente se capta la muestra, se coloca la tapa y se cierra firmemente a fin de evitar contaminación atmosférica.
  • Para la captación de muestras en depósitos, estanques y otras aguas confinadas sin corriente apreciable, se sumerge el recipiente invertido y se desplaza en sentido horizontal creando una corriente artificial. Se extrae la muestra y se cierra rápidamente el recipiente.
  • Para muestreo de agua confinada en depósitos, estanques u otras a profundidades específicas se debe emplear un dispositivo de muestreo (de diseñado de manera tal, que el agua fluya a través de tubos en el fondo del envase de recepción. Cuando se requiera determinar los gases disueltos; se podrá utilizar cualquier dispositivo menos complicado, que permita las toma de muestra a la profundidad requerida.

Determinación de la Calidad Sanitaria (según Michael Pelczar):

El agua puede ser perfectamente clara, libre de olores y sabores pero estar aun contaminada. Obviamente, se necesitan procedimientos especiales para determinar su calidad sanitaria.

Investigaciones sanitarias:

La investigación de los sistemas productores de agua por sanitarios e ingenieros calificados se llaman investigaciones sanitarias. Estas incluyen la inspección de

  1. La fuente sin tratar y las condiciones que influyen en su calidad
  2. Las operaciones de la planta purificadoras o la construcción del pozo, y
  3. El mecanismo para la distribución del líquido a los consumidores.

Las investigaciones sanitarias revelan si el agua se está produciendo en las condiciones estipuladas.

Pruebas Bacteriológicas de Contaminación:

Se presupone que el objetivo de los análisis rutinarios son para determinar la existencia de microorganismos patógenos en el agua. Sin embargo, esto no es verdad, por las siguientes razones:

  1. Los organismos patógenos llegan al agua en forma esporádica y no sobreviven mucho tiempo, por lo tanto, pueden no estar en una muestra que se envíe al laboratorio.
  2. Si se encuentran en pequeñas cantidades, pueden pasar desapercibidos a los procedimientos empleados.
  3. Se necesitan 24 horas o mas para obtener resultados de los exámenes y si se encuentran microorganismos patógenos, muchas personas pueden haber tomado agua antes de que se conozcan los resultados, y así haberse expuestos a la infección.

Puestos que los exámenes de laboratorio para encontrar microorganismos patógenos en el agua tienen las desventajas enumeradas, se han desarrollado técnicas para detectarlas en las excretas, particularmente las del grupo coliforme.

Este propósito ha probado ser satisfactorio en la práctica y tiene las siguientes ventajas:

  1. Los microorganismos coliformes, sobre todo E. Coli, habitan constantemente en el intestino humano en grandes cantidades.
  2. Estos microorganismos viven mas tiempo en el agua que los patógenos.
  3. Obviamente, una persona sana en general, no elimina microorganismos patógenos, pero puede desarrollársele una infección intestinal y esos microorganismos aparecerán en las materias fecales.

Las especies clásicas de este grupo son Escherichia coli y Enterobacter aerogenes. La relación de estos microorganismos con otros del grupo entérico – Salmonella, Shigella, Proteus, Pseudomonas y alcaligenes, todos los cuales son bacilos gramnegativos no esporulados.

Como estas especies tienen gran semejanza en su aspecto morfológicos y características de cultivo, es necesario recurrir a pruebas bioquímicas para diferenciarlas. Reacciones que tengan las siguientes cuatro características son muy importantes para lograr este propósito:

  1. Capacidad para producir Indol. E. Coli lo produce, y Ent. Aerogenes no.
  2. Cantidad de ácido producida en un medio especial de caldo glucosado, adicionado del indicador rojo de metilo. Los dos microorganismos producen ácido de la glucosa. Sin embargo, E. Coli produce pH mas bajo, lo que hace que vire al rojo de metilo mientras que Ent. Aerogenes no cambia el color.
  3. Capacidad para producir acetilmetilcarbinol en un medio de peptona glucosado. Este compuesto químico se detecta por medio de la reacción de Voges – Proskauer. E. Coli no produce acetilmetilcarbinol mientras que Ent. Aerogenes sí lo hace.
  4. Utilización de citrato de sodio. Ent. Aerogenes es capaz de utilizar el citrato de sodio como su única fuente de carbono, esto es, se desarrollará en un medio de cultivo químicamente definido en el cual el citrato de sodio es el único compuesto de carbono. E. Coli no se desarrolla en estas circunstancias.

Por conveniencia, a estas pruebas se las ha designado en forma colectiva reacciones IMViC (I = Indol, M = rojo de metilo, Vi = reacción Voges – Proskauer y C = citrato).

Es necesario cuidar los siguientes detalles cuando se sometan muestras de agua a análisis bacteriológicos:

  1. La muestra se tomará en frasco estéril.
  2. La muestra ha de ser representativa de la fuente original.
  3. Se evitará la contaminación de la muestra durante y después de obtenerla.
  4. La muestra se analizará lo mas pronto posible.
  5. Si no es posible examinar la muestra enseguida, deberá guardarse en refrigeración entre 0 y 10 ºC.

Los procedimientos bacteriológicos de rutina son:

  1. Cuenta en placas para determinar el número de bacterias.
  2. Pruebas que revelen la presencia de bacterias coliformes

Cuenta estándar en placa:

Se efectúan cuentas de colonias después de haber sembrado en la placa cantidades alícuotas de la muestra. La cuenta estándar en placa no se recomienda en el caso del agua porque la que contiene pocas bacterias patógenas obviamente es mas peligrosa que las que contiene muchas saprofitas. Sin embargo, lo cual el agua es de buena calidad tenga cuentas bajas, menos de 100 por mililitro.

Pruebas para determinar la presencia de bacterias coliforme:

Varios medios selectivos diferenciales facilitan mucho el proceso para examinar muestras de agua en busca de microorganismos coliformes, el examen supone tres pasos sucesivos:

  1. Prueba de presunción
  2. Prueba de confirmación
  3. Prueba de consumación.

Técnica de filtración por membranas:

Consiste en los siguientes pasos; un disco filtrante estéril se pone en la unidad de filtración.

Se hace pasar un volumen de agua por el disco filtrante, las bacterias serán detenidas en la superficie de la membrana.

Se quita el disco filtrante y se pone sobre una almohadilla absorbente que previamente se ha saturado con el medio de cultivo apropiado. Las almohadillas absorbentes con los discos filtrantes se acomodan en cajas de Petri de tamaño especial, las cuales se incuban.

Después de la incubación se desarrollarán colonias sobre el disco filtrante en cualquier lugar donde hayan quedado bacterias atrapadas durante el proceso de filtración.

Esta técnica tiene muchas aplicaciones útiles, unas de las cuales son:

  1. Se pueden examinar grandes volúmenes de agua; teóricamente casi cualquier volumen de agua se puede filtrar a través del disco y los microorganismos de cualquier volumen quedarán en el disco.
  2. La membrana se puede pasar de un medio a otro con el propósito de seleccionar y diferenciar los microorganismos.
  3. Se obtienen resultados mas rápidos que con los métodos convencionales.
  4. Se logran estimaciones cuantitativas de ciertos tipos de bacterias, como coliformes, cuando se usan los medios apropiados.

Microorganismos deferentes de las bacterias coliformes:

Muchas bacterias de los sistemas de aguas son denominadas bacterias indeseables porque crean problemas de olor, color, sabor y la precipitación de compuestos insolubles en las tuberías los cuales reducen u obstruyen el paso del líquido.

Estreptococos fecales:

Los estreptococos fecales son bacterias entéricas que viven en el intestino de los animales de sangre caliente y del hombre. Streptococcus faecalis es representante de este grupo; otras especies son S. Faecium, S bovis y S. Equinus. Debido a que S. Faecalis, abunda en el intestino grueso del hombre, su presencia en el agua significa contaminación fecal.

Recuento por dilución:

Con esta técnica se logra una estimación del número de bacterias en la población, que pueden multiplicarse en un medio líquido. Cualquier medio puede emplearse, siempre que fomente el crecimiento de los microorganismos por estudiar.

El recuento por dilución es mas exacto si se inoculan varios tubos de medios de cultivos en porciones de 1 ml de cada dilución. Varias porciones de las diluciones críticas, en estas circunstancias, contienen un microorganismos viable y otras no lo contienen. Se han calculado tablas para saber en un momento dado el número más probable de bacterias en la muestra.

Características sanitarias del agua potable:

Para ser potable, es necesario que el agua sea limpia, fresca, sin sabores u olores desagradables o que causen rechazo de quien las consumen, y sin sustancias químicas y microorganismos nocivos. De estas características deseadas la mas difícil de lograr es la falta de microorganismos nocivos. No es imposible, pero entraña vigilancia constante y valoración o análisis repetidos.

El problema se intensifica dado que la eliminación de aguas negras suele ser completada el eliminar el líquido sobrenadante en grandes cantidades de agua, y la necesidad suele hacer que las mismas aguas en que se eliminaron las otras, se empleen como fuentes de agua potable por otras comunidades.

Bacterias que indican contaminación:

El método ideal de analizar el agua respecto a la seguridad o sanidad bacteriológica incluye la búsqueda de patógenos transmitidos por el agua.

El agua que contenga pocos patógenos por litro puede estar lo suficientemente contaminada para causar algunos casos de enfermedad. Si la excreta de una persona enferma de fiebre tifoidea se eliminan y llegan a un depósito empleado para contener agua potable, pueden aparecer casos de fiebre tifoidea. Los patógenos son bastante pocos y están dispersos, y es necesario examinar grandes muestras para observar un microorganismo patógeno.

Se han empleado varios grupos de bacterias que aparecen normalmente en el intestino del hombre o los animales para indicar la contaminación del agua potable por aguas negras: los denominados estreptococos fecales, algunos anaerobios esporógenos y las bacterias coliformes. Las bacterias coliformes son los indicadores de contaminación más empleados, especialmente en los Estados unidos de Norteamérica.

Bacterias coliformes:

Las bacterias coliformes incluyen la Escherichia coli y otras bacterias que se asemejan morfológica y fisiológicamente. Estos microorganismos con frecuencia difieren entre sí en características pequeñas; se diferenciaron docenas de especies, pero en la actualidad solamente se reconocen seis. Se sabe que dos aparecen con frecuencia suficiente como para mencionarse : E. Coli y Aerobacter aerogenes.

Las bacterias coliformes son bacilos cortos, gramnegativos, que fermentan la lactosa y forman ácido y gas. Son anaerobios facultativos y se multiplican a mayor rapidez a temperaturas entre 30 y 37 ºC.

Las colonias de E. Coli en agar E.M.B. (eosina y azul de metileno) tienen 2 a 4 mm de diámetro, un centro grande de color oscuro e incluso negro, y tienen brillo verde metálico cuando se observan con luz refleja. Las colonias de A. Aerogenes en el mismo medio son mayores, muy mucoides, y de color Rosado; con frecuencia tienen un centro parduzco pequeño.

Análisis sanitario del agua:

El diagnostico o determinación de las bacterias coliformes en las muestras de agua se basa en la capacidad de dichos microorganismos para producir gas a partir de lactosa. Se inocula parte de la muestra (cinco partes de 10 ml cada una) en tubos de fermentación de lactosa y se incuban a 37 ºC durante 48 horas. Se observan los tubos después de 24 y 48 horas, y la aparición de gas en ambos periodos constituye una prueba positiva de presunción.

Bacterias distintas de las coliformes pueden producir gas en lactosa; en consecuencia se necesita aislar las especies que fermentan la lactosa, cosa que suele hacerse al inocular la superficie de placa de agar E.M.B. con muestras de uno o mas tubos de fermentación que contengan gas. El aspecto de las colonias coliformes típicas es una prueba positiva confirmada. Después de ello se hace el paso de una o mas colonias (típicas, si las hay; de lo contrario cualquier colonia sospechosa) a tubos de concentración de lactosa, y placas inclinadas de agar y se incuban durante 24 horas. Gas en el tubo de lactosa y la coloración de gram en la placa inclinada de agar que, indique bacilos gramnegativos sin esporas, harán que el resultado se designe como prueba positiva completa con respecto a bacterias coliformes.

Purificación de Agua, Protección de las Fuentes Hídricas:

El primer paso para lograr la obtención de agua pura, sea para una casa aislada, para toda una ciudad, es proteger las fuentes de agua contra la contaminación por aguas negras o desechos. Es necesario que las fuentes o pozos estén situados a distancias importantes de los estanques sépticos, establos y otras fuentes de contaminación; es necesario que estas construcciones de abasto hídrico estén hechas con cuidado para impedir filtraciones del agua superficial y conviene cubrirlas con una capa de concreto.

Filtración

La filtración es un medio eficaz para eliminar microorganismos y otras sustancias de suspensión del agua. Se emplean en la filtración de agua a gran escala dos tipos de filtro de arena.

Los filtros lentos de arena, están hechos de capas de arena fina, arena gruesa, grava y roca. El agua pasa lentamente por el filtro, y bacterias, algas, protozoos son captados en las capas superficiales de la arena fina. Estos microorganismos se multiplican y producen una masa gelatinosa en la que se absorben otros microorganismos y partículas de suspensión.

Parámetros Microbiológicos para Determinar la Calidad del Agua.

Ya KOLKWITZ y MARSSON (1908) utilizaron bacterias, además de otros seres vivos vegetales y animales, como organismos indicadores de la calidad de las aguas y mencionan también diversas especies que toman parte en las distintas etapas de la descomposición -por ejemplo, Zoogloea ramigera y Sphaerotilus natans.

Es preciso hallar el número de gérmenes saprofitos o de colonias y de bacterias procedentes del intestino humano como indicadores de contaminación fecal (BONDE, 1977; DAUBNER y PETER, 1974; COL, 1975). A este respecto, conviene destacar la importancia que tienen las cifras de coli y coliformes, así como el título colimétrico. Son bacterias coliformes las pertenecientes al las enterobacteráceas que fermentan la lactosa con producción de gas y ácido (H2, CO2). Pertenecen a los géneros Escherichia, Citrobacter, Enterobacter y Klebsiella.

Para determinar el número de estas bacterias, se suele emplear el medio selectivo de Endo (agar-fucsina-sulfito-lactosa). Después de 24 – 48 horas de incubación a 37 ºC, se halla el número total de coliformes y a 44 ºC el de coliformes fecales. La declaración obligatoria de estos gérmenes requiere su diferenciación por medio de las pruebas bioquímicas correspondiente (serie colorimétrica, prueba IMViC; DAUBNER, Y PETER, 1974; REICHARDT 1978).

En la mayoría de los países se han admitido los límites máximos admisibles para el agua potable, la de uso doméstico y la de baño. La primera no debe contener ningún agente patógeno, así se considera cuando en 10 ml de agua no se encuentran gérmenes coliformes y, por tanto, no estén presente tampoco la especie Escherichia coli. Para las aguas de baños tienen validez los siguientes requisitos de calidad en varios países (Comunidad Económica Europea): el número total de coliforme debe ser, en lo posible, inferior a 500 y en todo caso no llegará a 10.000 por 100 ml – el de coliforme fecales, menor de 100 y 2.000, respectivamente, por 100 ml de agua. El primer número tiene valor indicativo, el segundo es de cumplimiento obligatorio. Si se llega a este en mas del 20 % en los análisis de las muestras tomadas durante 14 días por lo menos, es necesario prohibir el baño en las aguas afectadas.

Como complemento de la cantidad de gérmenes coliformes, a veces se determina el número de estreptococos fecales (enterococos) (RITTER, 1974), que es generalmente mas bajo que el de aquellos. Si el número de esto estreptococos es elevado, hay que pensar en una contaminación fecal reciente.

Estimación del Número mas Probable (NMP):

Se basan estos métodos en la presunción de que las bacterias se hallan normalmente distribuidas en un medio líquido, esto es, en las muestras repetidas del mismo tamaño de un mismo producto, debe esperarse contengan el mismo número de gérmenes como promedio; naturalmente, algunas de las muestras pueden contener algunos gérmenes mas o menos. La cifra media es el número más probable (Most Probable Number o MPN).

Esta técnica se usa principalmente para la estimación de bacilos coliformes, empleando caldo de MacConkey, pero puede utilizarse casi para toda clase de gérmenes en muestras líquidas si puede observarse fácilmente el crecimiento, por ejemplo, si hay turbidez y producción de ácido. Ejemplos de ellos son las levaduras y hongos en jugos y bebidas de frutas, clostridios en emulsiones de alimentos, cadenas de esporos en suspensiones de harina.

Agar MacConkey:

Es el medio primario selectivo y diferencial que se emplea mas a menudo; contiene violeta cristal para inhibir el crecimiento de cocos grampositivos y rojo neutro como indicador de pH, que le otorga propiedades diferenciales. Los bacilos gramnegativos desarrollan fácilmente ; los fermentadores de lactosa producen metabolismo ácidos que disminuyen el pH de medio próximo a la colonia. En esa zona el rojo neutro vira al rojo. Los no fermentadores de lactosa permanecen incoloros y translúcidos.

RESULTADOS

Experimento # 1:

"Contaje de aeróbios totales (aeróbios mesófilos)"

en este experimento se observó la formación de colonias pequeñas. Se realizó el contaje de colonias en las placas de 10-2 y el contaje total dio: 27 y se procedió a realizar la ecuación;

27x100 Þ 2700

2,7x103 UFC / ml

Experimento # 2:

"Contaje de coliformes"

en esta prueba se pudo observar que no hubo formación de colonias en las placas de agar violeta rojo billis, en ninguna de las diluciones preparadas.

Experimento # 3:

"Número mas probable de coliforme (N.M.P)"

en esta prueba se utilizaron nueve tubos con L.S.T. laurilsulfatotriptona y se observó que en ninguno de los nueve tubos hubo crecimiento

Experimento # 4

"Número mas probable (N.M.P) de estreptococos fecales"

en esta prueba se utilizaron 9 tubos de diferentes diluciones: 10-1, 10-2, 10-3 de color morado (Púrpura bromocresol) o color glucosa ácido (C.G.A.) y ninguna dio positivo porque no había turbidez en el agua.

Experimento # 5

"Análisis del agua con el filtro mil poros"

en este análisis se observó que hubo formación de colonias rosadas o sea hay presencia de coliformes.

DISCUSIÓN DE RESULTADOS:

Experimento # 1:

En esta prueba la cual se hizo con seis placas en las cuales se agregó 1 ml de las diluciones preparadas (10-1, 10-2, 10-3) luego se le agregó agar con otro diluyente realizándose así la siembra por profundidad a las 21 horas se observó y no había crecimiento y se incubó hasta el día siguiente. Luego a las 45 horas se notó que hubo formación de colonias en las placas y se procedió al contaje el cual dio:

27x100 Þ 2700

2,7x103 UFC / ml

Experimento # 2:

En esta prueba se utilizaron seis placas, dos para cada dilución (10-1, 10-2, 10-3)a las cuales se les agregó 1 ml de las disoluciones, luego se le agregó el agar violeta rojo billis se diluyó con el ml de soluciones previamente preparadas y se le terminó de agregar lo que queda de agar como una sobrecapa, se incubó a 32 ºC por 21 horas y al observar no hubo formación de colonias se volvió a incubar a las 45 horas se observó de nuevo que no había formación de colonias por lo tanto se llegó a la conclusión que nuestra muestra no tenía "coliformes".

Experimento # 3:

En esta prueba se utilizó nueve tubos de L.S.T. Lauril sulfato triptona. Se le agregó un ml de las disoluciones (10-1, 10-2, 10-3) a los tubos. Y se incubó por 21 horas. Al observarse notamos que no hubo crecimiento de microorganismos en ninguno de los tubos. Por lo tanto concluimos que en la muestra no habían coliformes presentes ni enterobacterias.

Experimento # 4:

En este experimento se utilizaron nueve tubos que contenían caldo glucosado ácido (C.G.A) a lo que se le agregó 1 ml de las diluciones (10-1, 10-2, 10-3) se incubó a 21 horas a 35 ºC y se observó que no hubo crecimiento de microorganismos en ninguno de los tubos de caldo glucosa ácido y concluimos que no hay presencia de estreptococos fecales en la muestra tomada del grifo.

Experimento # 5:

El análisis del agua con el filtro mil poros se realizó con la muestra de agua del grupo número 6. este grupo tomó las muestras de agua de un tanque o pipote y se observó que hubo formación de colonias rosadas o sea hay presencia de coliformes. Para el experimento se utilizó una placa con agar MacKonkey, un disco filtrante, un soporte para embudo, una bomba de vacío, etc.

BIBLIOGRAFÍA

 

 

Autor:

Libro: Métodos Microbiológicos

Editorial: Aribia S.A. Zaragoza (España).


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