- Descripción de la Familia
Micrococcaceae - Género
Staphylococcus - Características
Bioquímicas de los Micrococos y Estafilococos.
Métodos adicionales de aislamiento - Cocos
aerobios - Prueba de la
coagulasa - Reacciones
- Caracterización
general de la flora fúngica (mohos y
levaduras) - Método de Recuento de
Levaduras y Mohos por Siembra en Placa en Todo el
Medio - Característica
general del Staphylococcus aureus - Caracterización general de
la flora ácido láctica - Discusión de los
Resultados
Descripción de
la Familia
Micrococcaceae:
Familia Micrococcaceae
Género Micrococcus:
Los micrococos son células
esféricas dispuestas en masas irregulares, racimos,
tétradas o paquetes. La mayor parte de las especies que
predominan en los alimentos son
Gram – positivas. Su temperatura
óptima de crecimiento está entre los 25 y los 30
ºC, creciendo bien en los medios de
cultivos ordinarios. Por otra parte, resulta difícil
generalizar acerca de sus características, que varían
considerablemente de especie a especie. Los distintos tipo de
micrococos son interesantes en los limeñitos por las
siguientes características:
- Ciertas especies son capaces de utilizar las sales
amónicas y otros compuestos nitrogenados simples como
única fuente de nitrógeno. - la mayoría de las especies fermentan los
azúcares, produciendo cantidades moderadas de
ácido. - algunos son ácidos
– proteolíticos (M. Freudenreichii). - otros toleran gran cantidad de sal, creciendo por lo
tanto a niveles de humedad bajo; estas especies se desarrollan
en salmueras de curado de carnes, tanques de salmuera,
etc. - muchos son termodúricos, es decir, resisten la
pasteurización comercial de la leche (M.
Varians). - otros son pigmentados y dan una coloración
anormal a las superficies de los alimentos sobre
los que crecen; M. Luteus, por ejemplo, es amarillo y M.
Roseus, rosa. - ciertos micrococos crecen bien a temperaturas
alrededor de 10 ºC o incluso más bajas.
Los micrococos son muy abundantes en la naturaleza,
viéndose aislado mas frecuentemente del polvo y del
agua. A menudo
se encuentra en utensilios y equipos usados en alimentación que no
han sido adecuadamente limpiados e higienizados.
Los estafilococos Gram – positivos, crecen
aislados, en parejas, en tétradas o en masas
irregularmente agrupadas como racimos de uvas. La especie mas
importante, Staphylococcus aureus, generalmente crece ando
color amarillo a
la naranja, aunque en ocasiones puede ser blanco. Necesita una
fuente nitrogenada orgánica y en sus necesidades de
oxígeno
es facultativo. Muchas de las cepas beta-hemolíticas
coagulosa – positivas son patógenas y algunas
producen una enterotoxina que causa intoxicaciones
alimentarias.
Características Bioquímicas de los
Micrococos y Estafilococos. Métodos
Adicionales de Aislamiento:
Los estafilococos y micrococos se aíslan
frecuentemente de materiales
patológicos y de los alimentos. Es importante diferenciar
entre los dos grupos. Se sabe
que algunos estafilococos son patógenos dudosos u
oportunistas; otros y los micrococos parecen ser inofensivos,
aunque son útiles indicadores de
contaminación. Los estafilococos son
fermentadores, pueden producir anaeróbicamente
ácido de la glucosa; los micrococos son oxidantes y
producen ácido de la glucosa solamente en presencia de
oxígeno.
Como con otro grupos de
microorganismos, las reciente modificaciones taxonómicas y
den nomenclatura no
han modificado realmente la identificación de los cocos
Gram – positivos que se aíslan en la rutina de los
laboratorios de los productos
clínicos y de los alimentos. El término
"micrococos" se usa todavía imprecisamente para incluir
muchos organismo que no se identifican
fácilmente.
Aislamiento:
Material Patológico:
Se siembra en placas el pus, sedimentos de orina
centrifugada, hisopos, etc., en agar sangre o en agar
sangre
hidratado de cloral para impedir la difusión de proteus y
se siembra en caldo de carne salado. Se incuba durante la noche a
37 ºC. Se siembra en placas de agar de sangre el caldo de
carne salado.
Productos alimenticios:
Se preparan suspensiones al 10% en agua peptona
al 0,1 % en un Stomacher Lab Blender. Si se sospecha choque
térmico, se añaden cantidades de 0,1 ml a varios
tubos que contengan 10 ml de caldo infusión de cerebro corazón.
Se incuba durante 3 – 4 horas y seguidamente se resiembra.
Se utilizan uno o mas de los medios
siguientes: agar leche salino
(MSA), agar fosfato de fenolftaleína polimixina (PPP),
medio de Baird – Parker (BP) o agar yema de huevo telurito
polimixina (TPEY). Se incuban durante 24 – 48 horas. Se
ensaya con amoniaco en el medio PPP investigando colonias
fosfatasa positivas.
El agar MSA se baja en el alto contenido de en sal para
que crezcan selectivamente los streptococos. En el medio PPP, la
polimixina inhibe muchos otros organismos. El medio BP es muy
selectivo pero puede ser invadido por proteus. Se añaden
50 m g/ml de
sulfametazina.
Para enriquecimiento o para determinar la carga de
estafilococos, se emplea caldo de carne salado o caldo de manitol
salado. Se añaden 0,1 y 1,0 ml de la emulsión a 10
ml de caldo y 10 ml a 50 ml. Se incuba durante la noche y se
resiembra en placas de algunos de los medios sólidos. Si
hay presentes estafilococos en grandes cantidades en el alimento,
se producirá un intenso crecimiento en el inóculo
de 0,1 ml; cantidades muy pequeñas solo pueden dar
crecimiento del tubo sembrado con 10 ml. Si se requieren
recuentos, se emplea el método de
Miles y Misra y uno de los medios sólidos.
Se siembra en placas de agar sangre y agar
infusión de cerebro corazón.
Se incuban cultivos replicados a 25 y 27 ºC.
Identificación:
Las colonias de estafilococos y micrococos en medios
ordinarios son pardo doradas, blancas, amarillas o rosas, opacas,
cupuladas, de 1 – 3 mm de diámetro tras 24 horas en
agar sangre y por lo general se emulsionan fácilmente.
Pueden ser b –
hemolítica en agar sangre. Los aerococos presentan
a –
hemólisis.
En medio de Baird – Parker después de 24
horas, Staphylococcus aureus forma colonias negras, brillantes,
convexas, de 1 – 1,5 mm de diámetro; hay un estrecho
borde blanco y las colonias están rodeadas por una zona
clara de 2 – 5 mm de diámetro. Este aclaramiento
puede hacerse evidente tan solo a las 36 horas.
Otros estafilococos, micrococos, algunos enterococos,
coryneformes y enterobacterias pueden crecer y producir colonias
negras pero no dan lugar a la zona clara. Algunas cepas de S.
Epidermidis presenta una zona clara estrecha. Pueden ignorarse
cualquier colonia gris o blanca. Se inhibe el desarrollo de
la mayoría de los organismos de otros grupos (aunque no
proteus).
En el medio TPEY, las colonias de S. Aureus son negras o
grises y forman una zona de precipitación alrededor y/o
debajo de las colonias.
Se examinan extensiones teñidas por el Gram. se
realizan las pruebas de
coagulasa y DNAsa sobre los cocos Gram – positivos que
crecen en racimos de la siembra de materiales
clínicos. Este es un procedimiento
abreviado: las cepas positivas para ambas pruebas son
probablemente S. Aureus.
La posesión del enzima coagulasa que coagula el
plasma es una propiedad casi
exclusiva del S. Aureus. Hay dos vías de realizar esta
reacción:
Se emulsionan una o dos colonias en una gota de agua
sobre un portaobjetos. Si no se forman grumos en 10 –
20 segundos se hunde un alambre recto en plasma humano o de
conejo (EDTA) y se agita la suspensión bacteriana con
él. S. Aureus aglutina en 10 segundos, formando grumos
visiblesSe utiliza agua en lugar de suero salino porque
algunos estafilococos son sensibles a la sal, especialmente
si se han cultivados en medio salino. Debe evitarse el exceso
de plasma (por ej., un asa), ya que puede producir resultados
positivos falsos. Debe comprobarse el plasma con un
estafilococo coagulasa positivo conocido.- Reacción de coagulasa en portaobjetos:
se hace:
- Para confirmar la reacción en
portaobjetos. - Si la prueba portaobjetos es
negativa.
- Para confirmar la reacción en
- Reacción en tubos:
Se añaden 0,2 ml de plasma a 0,8 ml de caldo
nutritivo (sin glucosa) en un tubo pequeño. Se siembra
con el estafilococo sospechoso y se incuba a 37 ºC en un
baño maría durante 6 horas. Se examina a la hora
y luego a cada media hora. Deben incluirse en la prueba
controles conocidos positivos y negativos. En el tubo de
ensayo, el
plasma citrado puede ser coagulado por cualquier organismo que
sea capaz de utilizar el citrato, por ejemplo, los
estreptococos fecales (pero estos son catalasa negativos),
Pseudomonas y serratia. Por ejemplo, es aconsejable utilizar
plasma con EDTA (se encuentran en el comercio) o
plasma con oxalato o heparina. Se comprueba mediante
extensiones teñidas por el Gram los organismos de todos
los tubos coagulasa positivos.
S. aureus puede formar un coágulo, gelificar todo
el contenido del tubo o producir una trama floja de fibrina. La
prolongación de la incubación puede dar lugar a la
desaparición del coágulos por digestión
(fibrinólisis).
La reacción en portaobjetos descubre la coagulasa
"ligada" (factor de aglutinación), que actúa sobre
el fibrinógeno directamente o la reacción en tubo
detecta la coagulasa "libre", que actúa sobre el
fibrinógeno en unión con otros factores del plasma.
Pueden estar presentes algunas de ellas o ambas.
Se siembran placas de agar DNAsa con un asa de manera
que el crecimiento en las placas sea como de 1 cm de
diámetro. Se incuba durante la noche a 37 ºC. Se
inunda la placa con ácido clorhídrico 1N. La
transparentación alrededor de las colonias indica
actividad de DNAsa. El ácido clorhídrico reacciona
con el ácido desoxirribonucleico no alterado para dar un
precipitado turbio. Algunas otras bacterias, por
ejemplo, Serratia, pueden dar una reacción
positiva.
Si los organismos son coagulasa y DNAsa negativos o se
han desarrollados en un medio selectivo se distinguen entre
estafilococos y estreptococos con al menos dos de estas
reacciones:
- Reacción OF utilizando el método
de Baird – Parker; - Reacción de Evans y Kloos,
- Reacción de Schleifer y Kloos,
- Sensibilidad a Lisostafina.
Se resiembran en agar sangre para repetir las pruebas de
la coagulasa y de DNAsa y se realizan la reacción de la
fosfatasa.
Reacción de Evans y Kloos
Se preparan cultivos agitados en medios de tioglicolato
de Brewer que contengan 0,3 % de agar. Se incuban a 37 ºC y
se examina el crecimiento sumergido, es decir, el crecimiento
anaerobio (estafilococos) o el superficial
(micrococos).
Reacción de Schleifer y Kloos
Se emplea agar púrpura base comercial que
contenga 10 nl de glicerina y 0,4 mg de eritromicina/litro. Los
estafilococos varía el color del
indicador (púrpura de bromocresol) amarillo: los
micrococos no crecen.
Reacción de la lisistafina:
Se prepara una solución de lisostafina (Sigma
Chemicals) disolviendo 10 mg en 40 ml de tampón fosfatos
(0,02 M). Se ajusta a pH 7,4 y se
añade NaCl para obtener una concentración de 1 %
(p/v). Se distribuye en cantidades de 1 ml y se conserva a
–60 ºC. Para usarlo se añade 1 ml a 9 ml de
tampón fosfatos y se mezclan cinco gotas de un cultivo en
caldo incubado durante la noche en un tubo de ensayo
pequeño. Se incuba a 35 ºC y se examina si se ha
producido lisis a los 30, 60 y 120 minutos. Debe incluirse un
testigo utilizando tampón fosfatos en vez de Lisostafina.
Se lisan la mayoría de los estafilococos.
Reacción de la fosfatasa:
Se siembra agar fosfato fenolftaleína y se incuba
durante la noche. Se expone a los vapores de amoníaco. Las
colonias de estafilococos coagulasa positivos viran a
rosa.
S. aureus produce una reacción positiva (aunque
se ahn señalado cepas negativas). Los estafilococos y
micrococos coagulasa – negativos son por lo general
fosfatasa negativos.
Caracterización general de la flora
fúngica (mohos y levaduras), medios de cultivos y
métodos adicionales de aislamiento, identificación
de los mohos y levaduras en aislamientos.
Levaduras y Mohos:
Las levaduras y los mohos crecen mas lentamente que las
bacterias en
los alimentos no ácidos que
conservan humedad y por ello pocas veces determinan problemas en
tales alimentos. Sin embargo, en los alimentos ácidos y en
los de baja actividad de agua, crecen con mayor rapidez que las
bacterias, determinando por ello importantes pérdidas por
la alteración de frutas frescas y jugos, vegetales,
quesos, productos
cerealícolas, alimentos salazonados y encurtidos,
así como en los alimentos congelados y en los
deshidratados, cuyo almacenamiento se
realiza en condiciones inadecuadas. Además, existe el
peliro potencial de producción de micotoxinas por parte de los
mohos. Para eliminar o reducir tales problemas, los
manipuladores de alimento susceptibles de enmohecimiento
deberán:
- Reducir la carga de esporas, observando unas buenas
prácticas higiénicas. - Reducir los tiempos de almacenamiento y vender los alimentos lo antes
posible - Almacenar los alimentos congelados a temperaturas
inferiores a los –12 ºC, - Eliminar o reducir el contacto con el aire (mediante
envasado o por otros procedimientos) - Calentar el alimento en su envase final para destruir
las células
vegetativas y las esporas - Añadir ácidos para retardar el
crecimiento - Añadir conservadores químicos, tales
como los sorbatos y benzoatos.
Ni el hombre ni
los animales deben
consumir alimentos visiblemente enmohecidos, excepto, por
supuesto, los quesos tales como Roquefort ó Camembert y
ciertos salamis que deben sus sabores especiales a algunos
mohos.
Las levaduras crecen mas rápidamente que los
mohos, pero con frecuencia junto a ellos. Mientras que los mohos
son casi siempre aerobios estrictos, las levaduras generalmente
crecen tanto en presencia como en ausencia de oxígeno,
aunque con mayor rapidez y hasta poblaciones mas elevadas en
presencia de este gas. La fermentación es completamente un proceso
anaeróbico. Las bebidas fermentadas están fuera del
marco de esta publicación.
En los alimentos frescos y en los congelados, pueden
encontrarse números reducidos de esporas y células
vegetativas de levaduras, pero su presencia en estos alimentos es
de escaso significado. Solo cuando el alimento contiene cifras
elevadas de levaduras o mohos visibles, el consumidor se
dará cuenta de la alteración. La alteración
por levaduras no constituyen un peligro para la salud.
Factores de crecimiento de los mohos:
Nutrimentos:
Los mohos, por sus paredes celulares quitinosas duras,
obtienen nutrimentos solo por difusión o por transporte de
sustancias solubles y en consecuencia, su nutrición se limita a
alimentos bastantes sencillos. Muchos mohos obtienen carbono y
energía de los carbohidratos;
especialmente de la glucosa, pero algunos utilizan alcoholes o
ácidos orgánicos. Pueden obtener también el
carbono de las
proteínas, y si falta alguna fuente de
fácil obtención, lo obtienen de productos de la
digestión de las proteínas.
Algunas especies utilizan exclusivamente grasas.
Humedad y presión
osmótica:
El medio húmedo facilita el crecimiento de los
mohos, pero dichos organismos no necesitan el mismo grado de
humedad que bacterias y levaduras, que requieren un medio
prácticamente hídrico. El crecimiento en materiales
secos; pulpas secas, granos, tejidos, cuero
curtidos y muebles ocurre solamente en una atmósfera
húmeda. Al añublo o moho aparece en libros o
zapatos; por ejemplo: durante periodos duraderos, húmedos
y calurosos en climas en que hay poco sol.
Temperatura:
Algunas especies de hongos crecen a
temperaturas menores de 42 ºC o mayores de 42
ºC.
Oxígeno:
Prácticamente todos los mohos son aerobios y
necesitan bastante oxígeno. Solamente algunas especies; la
que se emplea en la manufactura
del queso Roquefort, crecen satisfactoriamente en medios con
menor tensión de oxígeno. Incluso en este caso, no
obstante, se facilita el crecimiento al picar el queso con
alambres para obtener agujeros por el cuajo en
maduración.
Cultivo de los Mohos:
Para estudiar los mohos se usan los mismos métodos
generales de cultivo que para las bacterias. Casi todos, se
desarrollan en condiciones de aerobiosis en los medios de
cultivos bacteriológicos usuales, a temperaturas que
varían entre 20 y 30 ºC. La mayor parte lo hacen mas
lentamente que las bacterias, y así, cuando llegan a
coexistir, el desarrollo de
estas sobrepasa con creces el de los mohos.
Si se quiere aislar los mohos, resulta muy
práctico usar un medio de cultivo que favorezca su
desarrollo pero que no sea óptimo para las bacterias.
Medios ácidos (ph 5,6) con
concentraciones relativamente elevadas de azúcar
con tolerados bien por los mohos pero inhiben muchas
bacterias.
Medios de cultivos:
Hay tres tipos generales de medios de cultivos para los
mohos:
- Medios naturales, como pedazos o infusiones de
frutas, vegetales, granos de cereales o tejidos
animales.
Estos medios varían mucho en su composición y no
son fácilmente reproducibles. Tampoco son de amplio
uso. - medios de cultivos preparados con peptonas, extractos
de plantas,
agar y otros compuestos de composición desconocida o
variable. - medios de cultivos sintéticos de
composición química
definida.
Un medio natural de amplio uso para el cultivo de los
hongos es una
infusión de maíz al
que se le adiciona agar y glucosa. Otro medio de cultivo para los
mohos y levaduras contiene infusión de papa con agar y
glucosa.
Muchas fórmulas de los medios de cultivos para
los mohos y levaduras contienen peptona, algún
carbohidrato y agar; en cambio, los
medios para los hongos patógenos necesitan ser
enriquecidos con otras sustancias.
Uno de los medios de cultivos mas conocido y antiguo
para cultivar hongos Sabouraud, y contiene maltosa y peptona con
sus ingredientes principales, pero fue modificado y ahora en
Estados Unidos
se usa uno que solo contiene glucosa. Este medio se utiliza mucho
para aislar mohos y ciertas levaduras; además es muy
útil para el crecimiento de hongos patógenos a
partir del cuerpo y exudados. Su acción selectiva parcial
se debe a su alta concentración de azúcar
y bajo pH.
Examen Morfológico de los
Mohos:
Puesto que la identificación de los hongos
depende en gran parte de características
morfológicas como el tipo y la agrupación de las
esporas se deben tomar muchas precauciones al hacer preparaciones
para el examen microscópico. En general, el cultivo en
medios líquidos no es satisfactorio para este
propósito. Los cultivos en medios sólidos, sobre
todo en placas se pueden ver con una lupa o con el objetivo seco
débil del microscopio,
empezando desde el fondo hasta la parte superior de la placa lo
cual nos proporcionará suficiente información para identificar o precisar el
genero del
moho examinado. Se deben hacer observaciones posteriores tomando
con una aguja o asa una pequeña muestra de
micelio en desarrollo, la que se coloca en una gota de azul
algodón lactofenol que esté sobre un portaobjeto y
se cubre luego con el cubreobjeto. En una preparación
hecha de esta manera, la hifas deben ser examinadas para ver si
hay tabiques, estructuras de
las esporas y otras partes del hongo que son determinantes, sin
embargo, una manipulación de este tipo rompe y desorganiza
las estructuras
del organismo pues la disposición característica de
la que depende la identificación se pierde y no es posible
clasificarlo.
Un método mejor para examinar los hongos es la
técnica de cultivos en portaobjeto (microcultivo), ya que
permite manejar y observar la especie sin modificar su
desarrollo, y el arreglo y acomodo de sus partes permanecen
intactos.
Factores de crecimiento de las
levaduras:
Agua:
En términos generales, las levaduras necesitan un
poco mas de agua que los mohos, pero menos que las bacterias.
Conviene insistir no obstante, que entre las levaduras hay gran
variación; algunas especies crecen en medio que contienen
incluso 40 por 100 de agua, por ejemplo en miel y jaleas o
compotas. Los microorganismos que crecen en soluciones de
gran presión
osmótica se denominan osmófilos.
PH:
Las levaduras crecen en límites
amplios de pH, aunque sus requerimientos son mas limitados que
los de los mohos. Muchas especies se multiplican en soluciones con
acidez de pH 3 y alcalinidad de pH 7.5. la reacción
óptima suele localizarse entre pH 7.5 y 5.0
Temperatura:
No hay crecimiento a temperaturas superiores a la del
congelamiento, ni tampoco a temperaturas superiores a 47 ºC;
las temperaturas máximas para algunas especies son algo
menores. La temperatura
mas adecuada suele situarse entre 20 y 30 ºC. La
incubación a 30 ºC suele ser satisfactoria
Oxígeno:
Las levaduras fueron los primeros microorganismos en que
se encontró crecimiento en un medio sin oxígeno
atmosférico. Pasteur se admiró notablemente de este
hecho, y observó que la utilización anaerobia de
azúcar generaba principalmente alcohol y
bióxido de carbono, en tanto que los productos aerobios
eran bióxido de carbono y agua. La multiplicación
de las levaduras es más rápida y la cosecha de
células es mayor en condiciones aerobias que en
anaerobias, en consecuencia, se necesita abundancia de
oxígeno en la elaboración de levadura comercial,
pero el oxígeno se excluye cuando se desea producir
alcohol (en la
fermentación de cerveza o en la
producción de vino).
Recuentos de Mohos y Levaduras:
Todos los mohos y levaduras crecen bien a valores de pH
de 5,0 y aún inferiores, por lo que generalmente
sustituyen a las bacterias en los alimentos ácidos.
Además, muchos mohos y levaduras toleran bajas Aw
(aproximadamente inferiores a 0,95) mucho mejor que la
mayoría de las bacterias; incluso a valores por
debajo de 0,75, algunos mohos y levaduras son los únicos
organismos que pueden crecer. Por lo tanto, los mohos y las
levaduras son los agentes alterantes de un número
importante de alimentos.
Waksman (1922) sugirió el uso de medios
acidificados para el recuento de mohos del suelo y a partir
de esta fecha los microbiólogos de los alimentos adoptaron
esta técnica para el recuento de mohos y levaduras en
alimentos. Sin embargo, pronto se hizo patente que el uso de
medios con pH bajo, incluso por debajo de 4 (Mossel y col., 1962;
Koburger, 1970), y (2) algunos mohos y levaduras crecen con
dificultad a los valores de
pH de muchos de los medios propuestos (Holwerda, 1952; Mossel y
col., 1962; Ingram, 1959; Koburger, 1970, 1971, 1972, 1973; B.
Jarvis, 1973), especialmente cuando las células han sido
dañadas poco antes de la siembra (Nelson, 1972). Por lo
tanto, los medios de pH bajo no son enteramente satisfactorios
para el recuento de mohos y levaduras.
Para inhibir el crecimiento de las bacterias en los
medios diseñados para el recuento de mohos y levaduras, en
los últimos 20 años se han utilizado con eficacia los
antibióticos. Entre ellos puede citarse la penicilina +
estreptomicina, el cloranfenicol, la clorotetracilina, la
oxitetracilina y la gentamicina (W. B Cooke, 1954; Beech y Carr,
1955; Flannigan, 1973). Para fines generales, han sido muy
utilizadas la oxitetracilina (Moosel y col., 1962; Put, 1964;
Sainclibver y Roblot, 1966), que se refiere al a clorotetracilina
debido a su mayor estabilidad. La gentamicina suprime el
crecimiento de las bacterias Gran negativas y es efectiva por
ellos en alimentos tales como la carne refrigerada (Hup y
Stadhouders, 1972; Mossel y col., 1970, 1975). El rosa de bengala
retarda el crecimiento de aquellos mohos que normalmente producen
abundante micelio aéreo, como Neurospora y Rhizopus (B.
Jarvis, 1973). Sin embargo, también anhibe algunas
levaduras (Mossel y col., 1975). La mejor temperatura de
incubación de los cultivos se sitúa alrededor de 22
ºC (Mossel y col., 1962; Koburger, 1970, 1972; Flannigan,
1973), y el tiempo de
incubación es de 5 días.
Las colonias de mohos pueden formarse a partir de hifas
o de esporas. Por ello el talo de un moho que esté muy
cargado de espora dará recuentos de placas muchos mas
altos que otro de tamaño similar sin esporas. Si el
método de recuentos de mohos de Howard (AOAC, 1975) en
lugar del método de recuento en placa por siembra en todo
el medio que se describa a continuación.
Método de
Recuento de Levaduras y Mohos por Siembra en Placa en Todo el
Medio:
Material y Aparatos:
- Lo necesario para la preparación y
dilución de los homogenizados de alimentos - Placas de Petri, de vidrio (100 x
15 mm) ó de plástico
(90 x 15 mm). - Pipetas bacteriológicas de 1,5 y 10
ml. - Baños de agua o estufa de aire forzado
para templar el agar fundido, 44 – 46
ºC. - estufa de incubación, 20 – 24
ºC. - Contador de colonias (tipo Québec de campo
oscuro o similar) - Dispositivo de recuento con registro
automático. - agar oxitetraciclina gentamicina extracto de levadura
glucosa (Medio 79).
Técnica:
- Preparar la muestra de
alimento por alguno de los tres procedimientos
recomendados en el capítulo sobre preparación y
dilución de los homogenizados de alimentos. (Importante:
procurar que transcurra el menor tiempo posible
para evitar el crecimiento o la muerte
delos microorganismos suspendidos en el diluyente). - Pipetar en placa de Petri alícuota de 1 ml de
las diluciones 10-1, 10-2,
10-3, 10-4 y 10-5, utilizando
dos placas por cada dilución. Se propone esta serie de
diluciones para los casos en que no se conozca el número
aproximado de unidades formadoras de colonias presentes en la
muestra. Por supuesto, las diluciones que han de prepararse y
sembrarse siempre están función
del recuento esperado. - Rápidamente, verter en las placas de Petri 10
– 15 ml de agar oxitetraciclina gentamicina extracto de
levadura glucosa, fundido y templado a 44 – 46
ºC. - Mezclar inmediatamente el inóculo con el agar
balanceando la placa de izquierda a derecha cinco veces,
realizando otras cinco vedes el movimiento
de vaivén en sentido perpendicular al primero y
rotándola, finalmente, cinco veces en sentido contrario
a las agujas del reloj. - invertir las placas cuando se haya solidificado el
agar e incubarlas a 20 – 24 ºC durante 3 – 5
días. - Con ayuda del contador de colonias y el dispositivo
de recuento con registro
automático, contar las colonias en aquellas placas que
contengan entre 30 y 300, llevando a cabo un examen
microscópico cuando sea necesario para identificar las
colonias de levaduras. - calcular el número de levaduras y mohos por
gramos o mililitros de alimento.
Característica general del Staphylococcus
aureus. Identificación bioquímica
del S. Aureus. Medios de cultivos y métodos de aislamiento
a nivel de laboratorio de
microorganismos.
Staphylococcus aureus:
Esta especie es coagulasa y DNAsa positiva, produce
ácido e la lactosa, maltosa y manitol, reduce los
nitratos, hidroliza la urea y reduce el azul de metileno. Es por
lo general fosfatasa positivo, aunque no crece en agar fosfato de
amonio.
La mayoría de las cepas son hemolíticas en
agar sangre de caballo, pero la zona de hemólisis es
relativamente pequeña si se compara con el diámetro
de la colonia (diferenciación con los estreptococos
hemolíticos).
La producción de pigmento amarillo dorado es
probablemente la característica mas variable. Los cultivos
jóvenes pueden no producir ningún pigmento. Puede
desarrollarse color si se dejan los cultivos uno o dos
días sobre la mesa del laboratorio a
temperatura ambiente.
Se favorece la producción de pigmento pr la
presencia en el medio de lactosa o de otro carbohidrato y de sus
productos de escisión. La mejor forma de demostrarlo es en
agar glicerina monoacetato.
En los laboratorios clínicos, se identifica
generalmente S. Aureus bien por la reacción de la
coagulasa o la de la DNAsa. Son posibles pruebas positivas falsas
de las coagulasa con enterococos, Pseudomonas y Serratia si se
utiliza plasma citratado. Serratia puede dar una reacción
DNAsa positiva. También se presentan cepas coagulasa
negativas, DNAsa positivas. Por tanto pensamos que deben
realizarse ambas reacciones, la de coagulasa y la de
DNAsa.
La fermentación del manitol no es fiable. Se
hallan cepas de S. Epidermidis que fermentan el
manitol.
S. aureus es un agente corriente de las infecciones
piógenas y de las toxiinfecciones alimentarias. Los
estafilococos se diseminan por las actividades domesticas y
comunitarias tales como hacer cama, vestirse o desvestirse. Se
hallan presentes fosas nasales, sobre la piel y el
cabello de una gran proporción de la población.
Son un ejercicio interesante las tomas de muestra de
aire mediante placas, las cepas de S. Aureus deben enviarse a un
experto de referencia para la tipificación por
bacteriófago. Las bacterias de fagotipificación han
sido descritas por Blair y Williams y Asheshov.
Identificación:
El S. aureus es cogulasa positivo, lo cual constituye su
característica mas distintiva. Enlos pocos casos de un
posible S aureus que no produce coagulasa puede realizarse la
prueba para desoxirribonucleasa termoestable que es aún
mas específica. Otros métodos para nucleasa
termoestables, como el de Zarzour y Belle, consisten en cavar
pequeños huecos en el agar ADN y colocar
suspensiones de cultivos de 18 – 24 horas hervidas; este
método es algo mas engorroso pero necesario para
laboratorios que no tienen acceso a mecheros de gas.
Madison y Baselski emplearon 1 ml de líquido
sobrenadante de botellas para hemocultivos con cocos Gram –
positivo en racimos para un amodificación rápida de
la prueba para nucleasa termoestable descriptiva. El sobrenadante
se lleva a ebullición durante 15 min y se coloca en
cavidades de 3mm de diámetros practicadas en placas con
agar ADN.la
correlación con los métodos estándar fue 100
% y solo se necesitaron 2 horas de incubación antes de
interpretar los resultados. Otro método rápido muy
similar para realizar la prueba de la nucleasa termoestable
directamente a partir del caldo de un hemocultivo. El origen de
agar ADN es esencial para obtener resultados confiables. Otro
método rápido para la identificación de los
cocos Gram- positivos visualizados en los caldos de hemocultivos
es la modificación de la prueba de Severance y col. Para
lisostafina descrptiva por Knight y Slhaes. También se ha
encontrado que la sensibilidad a la polimixina permite distinguir
entre cepas de S aureus coagulasa positivas y negativas. Heltberg
y Bruunencontraron que los S. Aureus, incluso las pocas cepas
coagulasas negativas, son resistentes a la polimixina, mientras
que otras especies de Staphylococcus son sensibles.
En el comercio se
encuentra varias pruebas de aglutinación de
partículas para la diferenciación rápida
entre S. Aureus y otros estafilococos. Staphylatex (American
Scientific Products), Sero – STAT (Scott Laboratories),
Staph Latex (Difco Laboratories) y ACU – Staph (Carr
– Scarborough Microbiologicals) emplean partículas
de latex y Staphyloslide (BBL Micrbiology Systems) usa
eritrocitos sensibilizados de oveja como partículas.
Aunque estos sistemas son
confiables, existe un pequeño porcentaje de resultados
negativos falsos con las cepas resistentes a la meticilina,
según ha sido informado por Woolfrey y col. Las cepas de
S. aureus resistentes a la meticilina con frecuencia dan
resultados negativos en la prueba para coagulasa sobre
portaobjetos, lo que sugiere que una misma estructura
celular contribuye a la expresión del factor de
agregación y a la resistencia a la
meticilina. Los métodos rápidos comerciales
mencionados pueden ser usado en la mayoría de las instituciones
siempre que el laboratorios confirme la identificación de
las cepas resistentes a la meticilina (mencionadas mas adelante)
mediante la prueba para coagulasa en tubo.
Las cepas de S. Aureus pueden ser identificadas para
fines epidemiológicos por tipificación con fagos.
La caracterización de cepas según su fagotipo,
biotipo, perfil de plásmidos y producción de
polisacáridos capsular (Slime) permiten reconstruir el
trazado de las vías de diseminación de las cepas
entre los pacientes hospitalizados, le medio ambiente
y el personal
médico. Si bien este método fue empleado
principalmente para la investigación de brotes hospitalarios de
infección por S. Aureus, se han desarrollados pruebas de
fagotipia para estafilococos coagulasa negativos. En algunos
casos los factores de virulencia pueden asociarse con ciertos
fagotipos determinados. Este procedimiento,
que insume mucho tiempo, es realizado por un pequeño
número de laboratorios en los EEUU, Canada e Inglaterra.
Caracterización
general de la flora ácido láctica.
Identificación bioquímica, medios de cultivos y técnicas
de aislamiento:
Género Streptococcus:
Los cocos de este género se
disponen característicamente en pares o cadenas largas o
cortas, dependiendo de las especies y condiciones de crecimiento.
Todos son homofermentativos. Los estreptococos se pueden
clasificar serológicamente mediante una reacción de
precipitinas en grupos llamados de Lancefield, que se designan
con letras mayúsculas (A, B, C, D, etc.), pero normalmente
los que son importantes en los alimentos se dividen en cuatro
grupos: piógenos, viridans, lácticos y
enterococos.
El grupo
piógeno (productores de pus) comprende especies
patógenas, entre las que están el S. Agalactiae,
que ocacionan matitis en las vacas, y el S. Pyogenes, que origina
en la especie humana faringitis séptica, escarlatina y
otras enfermedades;
se han encontrado en la leche cruda. Los estreptococos
piógenos no crecen a 10 ºC ni a 45
ºC.
Los del grupo viridans
incluyen el S. Thermophilus, importante en los quesos que se
elaboran cociendo a altas temperaturas la cuajadas y en ciertas
leches fermentadas como el yogur, y el S bovis, que se encuentra
en el estiércol y en la saliva del ganado vacuno, como el
S. Thermophilus, es termodúrico, por lo que se puede
hallar en el recuento en placas de la leche pasteurizada. Estas
especies crecen a 45 ºC pero no a 10 ºC.
El grupo láctico comprende las importantes
bacterias de la leche Streptococcus lactis y S. Cremoris, que
crecen a 10 ºC pero no a 45 ºC. Estas bacterias se
emplean como "fermentos" para el queso, mantequilla fermentada y
ciertos tipos de mantequilla, juntamente con especies de
Luconostoc. S, lactis a menudo toma parte en la
acidificación de la leche cruda. Estas bacterias
lácticas no toleran mas del 2 a 4% de sal, por lo que no
toman parten en la fermentación láctica de los
productos vegetales, en salmueras. Los gérmenes
lácticos se encuentran en las plantas verdes,
piensos, ensilajes y en algunos utensilios.
El grupo entero cocos los constituyen el S. Faecalis, S.
Faecium y ciertas subespecies afines. S. Faecalis y S. Faecium
son muy parecidos entre sí, pero se pueden diferenciar
mediante pruebas fisiológicas. S. Faecalis es, en general,
mas resistente al calor y suele
ser mas veces de procedencia humana, mientras que S. Faecium
procede en mas ocasiones de vegetales. S. Faecalis subespecie
zymogenes es una variedad beta – hemolítica. Estos
estreptococos en un principio recibieron el nombre de S.
Liquefaciens S. Zimogenes, respectivamente. S. Faecalis y S.
Faecium se encuentran con mas frecuencia en los alimentos crudos.
Las bacterias de este grupo crecen tanto a 10 ºC como a 45
ºC.los enterococos tienen ciertas características en
común que los convierten en estreptococos muy
particulares:
- Son termodúricos, resistiendo
fácilmente la temperatura de pasteurización de la
leche o incluso otras mas altas. - Toleran un porcentaje de sal del 6,5 % o
superior - crecen a un pH alcalino de 9,6
- se desarrollan en un intervalo de temperaturas
amplio, algunos desde los 5 y los 8 ºC, y la
mayoría pueden hacerlo incluso a 48 ó 50
ºC.
S. faecalis se han encontrado también en el
tocino entreverado. Como indica su nombre, los enterococos
provienen del tracto intestinal del hombre y de
los animales y a veces se usan como organismos indicadores de
contaminación fecal en los alimentos. Puede
también desarrollarse en productos lácteos,
contaminando los utensilios y los equipos
industriales.
Género Pediococcus:
Hasta la fecha solo se han encontrado en los alimentos
la especie P. Cerevisiae. Son cocos aislados, en parejas, en
cadenas cortas o en tétradas. Son Gram – positivos,
catalasa – negativos y microacrófilos.
Homofermentativos, produciendo a partir delos azúcares de
0,5 a 0,9 % de ácido, principalmente láctico,
crecen bien en salmueras de cloruro sódico de hasta una
concentración de 5,5 % y pobremente cuando la
concentración es alrededor de 10 %. Crecen a temperaturas
de 7 a 45 ºC, pero su crecimiento óptimo tiene lugar
entre 25 y 32 ºC. Características que los hacen
interesantes en los alimentos son: tolerancia a la
sal, producción de ácido, escala de
temperaturas de crecimiento amplia y habilidad especial para
crecer a temperaturas de refrigeración. Los pediococos se han
encontrado en las salmueras de los encurtidos en fase
fermentativa, siendo responsables de ciertas alteraciones en las
bebidas alcohólicas, por ejemplo, cerveza, donde su
proporción de diacetilo es perjudicial. El P.
Cerevisiae se usado como cultivo starter en los embutidos
fermentados.
Género Leuconostoc:
Este género,
llamado Betacoccus por Orla – Jensen, comprende los
estreptococos lácticos heterofermentativos que fermentan
el azúcar, produciendo ácido láctico y
cantidades considerables de ácido acético, alcohol
etílico y dióxido de carbono. Por la capacidad que
tienen las especies L. Dextranicum y L. Citrovorum de fermentar
el ácido cítrico de la leche, produciendo una
sustancia de sabor agradable, diacetilo (también produce
acetoina y 2,3 – butilenglicol), y estimular a los
estreptococos lácitocos, se han incluido en los llamados
"fermentos lácticos" dela mantequilla, crema y
queso.
Son importantes las especies de Leuconostoc en los
alimentos por
- producir diacetilo y otras sustancias
aromáticas. - tolerar las concentraciones salinas de ciertas
salmueras, como la de la fermentación del sauerkraut y
encurtidos hortícolas, permitiendo al L. Mesenteroides
que lleve a cabo la primera fase de la fermentación
láctica - su capacidad de iniciar la fermentación en
productos vegetales con mas rapidez que otras bacterias
lácticas u otros organismos y de producir suficiente
ácido como para inhibir el crecimiento de las bacterias
no lácticas - la gran tolerancia de
l: mesenteroides para concentraciones azucaradas de hasta 55 a
60%, lo que permite crecer en jarabes, caramelo líquido,
crema de helados, etc. - producción de cantidades considerables de
dióxido de carbono a partir de los azúcares,
produciendo ojos en ciertos quesos, la alteración de
alimentos de gran contenido azucarado (jarabes, cremas, etc.) y
la fermentación de algunas clases de pan - producción de gran cantidad de
mucílagos en medio que contienen sacarosa, lo que es
desear en la producción de dextrano, pero presenta un
riesgo en
alimentos ricos en dicho disacárido
Leuconostoc:
Este género contienen varias especies de
estreptococos microerófilos de importancia
económica. Algunos de ellos producen un dextrano viscoso
en los vegetales congelados.
Aislamiento:
Se cultiva en material en agar levadura glucosado a pH
6,7 – 7,0. se incuba a 20 – 25 ºC en 5% de
dióxido de carbono.
Identificación:
Se siembran azúcares MRS: glucosa, lactosa,
sacarosa, manosa, arabinosa y xilosa y se investiga la
formación de dextrano viscoso en medios sólidos que
contengan glucosa.
Especies de Leuconostoc:
Leuconostoc mesenteroides:
Es esta la especia mas importante. Forma una gran
cantidad de dextrano viscoso en medios y en materia
vegetal que contengan glucosa. Las colonias en los medios de agar
sin el azúcar son pequeñas y grises. Es crecimiento
es muy pobre en medios sin extracto de levadura. Intervienen en
la fermentación del chucrut y en la producción de
ensilado y es responsable de la alteración viscosa de la
salmuera (a menos que se favorezca el desarrollo de Lactobacillus
Plantarum por la elevada salinidad). También es
responsable del "azúcar limoso" o de la "alteración
del azúcar". Altera los guisantes y sumos de frutos
congelados.
L. paramesenteroides:
Es similar a L. Mesenteroide pero no forma dextrano
viscoso. Está muy difundido en la vegetación y en
la leche y productos lácteos.
L. dextranicum:
Forma bastante menos viscosidad que L.
Mesenteroides y es menos activo bioquímicamente.
Está extensamente difundido en verduras en
fermentación y en la leche y productos
lácteos.
L. cremoris:
Es raro en la naturaleza, auque
es utilizado como indicador en los productos
lácteos.
L. lactis
No es frecuente. Se halla en la leche y en productos
lácteos.
Pediococcus
Los pediococos son cocos microaerófilos no
capsulados que se representan aislados y en parejas. Son exigente
nutricionalmente y tienen importancia económica en la
industria
cervecera, de la fermentación y del procesado de
alimentos.
Aislamiento:
Se emplean medios enriquecidos y agar mosto de cerveza
para los pediococos alterantes de la cerveza. Los mejores medios
son los de sumo de tomate a pH 5,5. se incuban a temperaturas
distintas de acuerdo con la especie investigada en 10% de
dióxido de carbono.
Identificación:
Si es necesario proceder a la identificación de
las especies, se siembran medios azucarados MRS: lactosa,
sacarosa, galactosa, salicina, maltosa, arabinosa y xilosa. Se
incuban a temperaturas adecuada. Ninguna de las especies produce
gas.
Especies de Pediococcus:
Pediococcus damnosus (P. Cerevisiae)
Se halla en las levaduras y en el mosto de cerveza.
La
contaminación de la cerveza da lugar a un producto
turbio y ácido con un olor peculiar "alteración por
sarcina". P. Damnosus es resistente a los agentes antibacterianos
en el lúpulo.
P. acidi-lacti:
Se halla en el chucrut, así como en los
encurtidos, ensilados y papillas de cereales, pero no en la
cerveza lupulada.
P. urinae – equi:
Es un contaminante de la levaduras de cerveza. (el
nombre indica que se aisló originalmente de la orina de
caballo).
P. halophilus
Como sugiere su nombre, es tolerante a la sal (hasta 15%
de NaCl). En halla en la papilla de soja.
Lactobacillus:
Los lactobacilos son importantes para la industria
láctea y alimenticia y son comensales del hombre y los
animales.
Aislamiento:
Se siembra en placas por duplicados en medios MRS,
Rogosa o simila a pH 5,0 – 5,8. es especialmente
útil el medio diferencial LS (O) en el examen del yogur.
Muchas cepas crecen muy mal, si lo hacen a pH 7,0, aunque el
material patológico humano se siembra en agar sangre. Se
incuba una serie de placas en aerobiosis y la otra en atmósfera de
dióxido de carbono – hidrógeno 5:95. se
incuban los cultivos procedentes de alimentos a 28 – 30
ºC y los de procedencia humana o animal a 35 – 37
ºC durante 48 – 72 horas. Se investiga la presencia de
colonias blancas, muy pequeñas. Muy pocos otros
organismos, aparte de los hongos, pueden crecer en medios
ácidos. Para la identificación provisional de L.
Acidophylus, que es la especie mas común en materiales
humanos, se pone en placas de agar sangre.
- un disco de sensibilidad de sulfamida que se ha
sumergido en la solución saturada de sacarosa,
y - un disco de penicilina (5 unidades).
L. acidophylus da hemólisis verde. El crecimiento
se estimula por la sacarosa; es resistente a las sulfamidas y
sensible a la penicilina.
Identificación:
Se resiembra si es necesario para obtener un cultivo
puro y se siembra densamente en caldo MRS modificado que contenga
los siguientes azúcares: glucosa (con un tubo de Durham),
lactosa, sacarosa, salicina, manitol, sorbosa y xilosa, en caldo
MRS que contenga 2% de glucosa en el que el citrato
amónico se ha sustituido por 0,3 % de arginina (para la
prueba de hidrólisis de la arginina) y el caldo MRS que
contenga 4% de cloruro sódico. Se incuba a 28 – 30
ºC durante 3 – 4 días. Se siembran tubos de
caldo MRS y se incuban a 15 ºC y a 45 ºC.
Se cultiva en medio sólido con bajo contenido en
carbohidratos
para la prueba de la catalasa (los medio con altos contenidos dan
reacciones falsas positivas). Es útil el sistema
API.
No es fácil la identificación de los
lactobacilos; las reacciones varían de acuerdo con la
técnica y la posición taxonómica de algunas
especies es confusa.
El método del tubo Durham no siempre puede
detectar el dióxido de carbono producido por los
lactobacilos heterofermentadores. Es útil el método
de Leon – Campbell.
Se siembra un tubo de medio, por ejemplo, caldo MRS, que
contenga 2% de glucosa y, si es necesario, 5% de zumo de tomate.
Se pone este tubo dentro de otro mayor que contenga varios
mililitros de solución de hidróxido bárico y
se cierra el tubo mas grande con un tapón de goma. Se
incuba a 72 ºC durante 48 – 72 horas. Si se produce
dióxido de carbono, se formará un precipitado de
carbono bárico. Es aconsejable poner un testigo con una
cepa homofermentadora conocida.
Para el crecimiento de los lactobacilos
homofermentadores que producen el enverdecimiento de las carnes
curadas, se añade 0,1 g de clorhidrato de tiamina a cada
litro de medio o se usa medio APT (D).
Especies de lactobacilos:
Lactobacillus acidophylus:
Está ampliamente diseminado y se halla en la
leche y productos lácteos y como comensal del tracto
digestivo de los mamíferos. Se emplea para fabricar "leche
ácida" y se supone se halla relacionado con la caries
dental del hombre, en la que puede describirse como L.
Odontolyticus, L. Acidophylus es probablemente el organismo
descrito como bacilo de Boas – Oppler, que se observa en
casos de carcinoma del estómago del hombre y
también del bacilo Doderlein, que se encuentra en la
vagina humana.
Las colonias de este organismo en medios de agar se
describen como "plumosas" o "canceriformes".
L. Bulgaricus:
Están asimismo relacionadas con la leche y
productos lácteos, aunque es termófila y no se
halla en el intestino de los mamíferos. Se utiliza en la
elaboración del yogurt, junto con S. Thermophilus, en la
de quesos cremosos y para producir agujeros de gas en la de
quesos duros. La fermentación natural del ensilado se debe
en parte a este organismo. Las colonias en medios de agar son
pequeñas y grises.
L. casei y L. Plantarum
Son difíciles de separar salvo por
cromografías de papel del
resultado de la fermentación de los carbohidratos. L.
Casei se emplea para obtener suero de la leche y se presenta
naturalmente en la leche y en el queso. L. Plantarum está
extensamente difundido en vegetales, vivos o muertos, y es uno de
los organismos responsables de la fermentación de los
encurtidos y de la fabricación de chucrut. Ambos
organismos dan crecimientos muy deficientes en agar.
L. delbruckii:
Se halla en la vegetación y en los cereales y se
emplea como "starter" para iniciar las condiciones ácidas
en la fermentación de granos mediante levaduras. Este
organismo crece en medio de agar en colonias pequeñas,
planas y de bordes dentados.
L. leichmanii:
Se encuentra en la mayoría de los productos
lácteos. Se emplea en la producción comercial de
ácido láctico y crece en agar como pequeñas
colonias blancas.
Experimento # 1:
Determinación de la familia
microcococea
(Staphylococcus, Micrococcus), Muestra de
Queso:
para esto se utilizó agar manitol sal, este es un
medio bastante rico y su capacidad para crecer en este con altas
concentraciones de sal ofrece un amanera sencilla para el
aislamiento de ambos.
Para ello se pesó la muestra (25 gr), se
agitó con el diluyente, luego le agregamos 0,1 ml de la
muestra a las placas. Las placas se inocularon en superficies y
estas placas tenían rojo fenol, luego a las 24 horas se
observó crecimiento de las colonias rojas y amarillas. Lo
cual nos indica que el micrococo es un aerobio estricto que
además de fermentar el rojo fenol produjo ácido a
partir de la glucosa. Mientras que el staphylococcus es un
aerobio facultativo y produjo ácido a partir de la glucosa
tanto aeróbicamente como anaeróbicamente.
Según la bibliografía de Madigan de Biología de los
Microorganismos. Y esto se debe a que su composición de
base del DNA es muy distinta a la del micrococo.
Tanto el staphylococcus como el micrococcus son
organismos aeróbico con un metabolismo
respiratorio típico. Son catalasa positivos y esta prueba
permite diferenciar del streptococcus y de algunos géneros
de cocos gram – positivos.
Como se sabe los cocos gram – positivos son
relativamente resistentes a un potencial de agua reducido y
toleran bastante bien las sequías y la salinidad y como en
el laboratorio se sembró un inóculo cobre la placa
de agar con un medio (manitol sal) que contenga un porcentaje de
NaCl y se incubaron aeróbicamente y observándose a
las 24 horas observamos que los cocos gram – positivos eran
las colonias predominantes y como estos microorganismos suelen
ser fermentados constituyen ayuda para su selección
tanto de staphylococcus y de micrococcus pueden separarse
fácilmente a través de la prueba oxidación
– fermentación.
Según la bibliografía de Madigan,
los pigmentos amarillos nos indican la presencia de
staphylococcus aureus en la muestra ya que el presenta una forma
fermentada amarilla, el cual está asociada corrientemente
a situaciones patogénicas como; neumonía, artritis,
meningitis, etc. Y donde este produce un exotoxina importante, la
coagulasa, factor parecido a una enzima que actúa sobre
una fibrina y forma un coagulo y son normalmente coagulasa
positiva.
Como la muestra analizada (queso) se observaron un gran
número de staphylococcus, esto significa por lo general,
que las prácticas de limpieza y desinfección y el
control de la
temperatura no han sido, en algún lugar,
adecuado.
Experimento # 2 "Flora Fúngica"
Los mohos comprenden hongos predominantemente
unicelulares y filamentoso; por otra parte las levaduras son, por
lo regular unicelulares, dado que los hongos son clasificados
parcialmente basándose en los métodos de reproducción sexual., los mohos y las
levaduras pueden reducirse de la misma forma.
En el laboratorio se observó colonias blancas y
amarillas en la cual, la dilución 10-1 por
duplicado dio una población incontable y la dilución.
En la dilución 10-2 presenta colonias blancas
(176) y un hongo en la muestra de queso blanco, y la
10-3 presentó 135 colonias. Según la
bibliografía de Carpenter de Microbiología los mohos crecen por un
fenómeno vegetativo de agrandamiento y divisiones
celulares especialmente en el extremo de una hifa y ellos crecen
medios muy diversos. Su crecimiento es facilitado por la acidez y
por ende las placas con agar contenían HCl para facilitar
su crecimiento e inhibir bacterias; e igualmente necesitan
humedad pero no necesariamente sustrato húmedo y
abundancia de oxígeno.
Los mohos suelen asociarse con la descomposición
de los alimentos, pero también son fuentes
importantes de sustancias químicas y de
antibióticos. Casi todos los mohos son estrictamente
aerobios, su crecimiento lo incrementa la abundancia de
oxígeno y se desarrolla generalmente de 22 – 30
ºC que es la óptima para la mayoría de las
especies.
Se aconseja que para aislar los mohos se debe usar un
medio de cultivo que favorezca su desarrollo pero que no sea
óptimo para la bacteria. Medio ácido (pH 5,6) con
concentraciones relativamente elevadas de azúcar son
toleradas por hongos y mohos pero inhiben muchas
bacterias.
Experimento # 3
Es un medio rápido para determinar muchos
organismos presentes, ya que trae un medio deshidratado con todos
sus nutrientes, para propiciar el desarrollo rápido de los
microorganismos a utilizar y para ello preparamos en el
laboratorio diluciones para determinar flora fúngicas,
enterobacterias, aerobios mesófilos, etc., tanto en
muestras de queso como en muestras de pollo.
A cada grupo de laboratorio se le hizo entrega de
petrifilm por duplicado, y una vez que se le agregó un ml
de muestra se tapó y se incubó a 37 ºC por 24
horas. Observándose en los petrifilm de enterobacterias
colonias rojas incontables en dilución 10-1. en flora
fúngica la dilución 10-1 nos dio ufc =
930 por lo tanto es incontables.
Aerobios dio incontable en la dilución
10-1 en muestras de pollo.
Experimento # 4: "Prueba de
Portadores"·
Para esto se tomó un hisopo, el cual fue
introducido en las fosas nasales, luego inoculamos en la placa
que contenía agar para staphylococcus,
procediéndose a dividir una placa y colocándosele
el nombre de cada uno delos integrantes y luego inoculamos con
líneas paralelas; lo incubamos a 37 ºC / 24 horas,
luego le observamos y a las placas de Rómulo y Lisseth les
dio negativa esta prueba. Al equipo 3 que les dio positivo se le
hizo la prueba del DNAsa; con un asa tomaron del cultivo que se
desarrolló en inocularon en otra placa y lo incubaron a 37
ºC/ 24 horas. Procediéndose al siguiente día a
realizar la prueba de la catalasa la cual es útil para la
identificación de catalasa. Como el staphylococcus es
catalasa positivo, catalisa la liberación de agua y
oxígeno a partir del peróxido de hidrógeno,
un producto final
del metabolismo
que es tóxico para la bacteria según la
bibliografía de Bailey Scott Diagnostico
Microbiológico. Como al agregarle una gota de
peróxido de hidrógeno a una colonia se
liberó burbujas de gas dejándose por 15 minutos y
se observó la formación de un aro transparente el
cual nos indica que ambos individuo son portadores de
staphylococcus aureus patógenos.
Experimento # 5
"Métodos para el establecimiento de
anaerobiosis"
las bacterias anaeróbicas estrictas son causa
frecuente de infecciones y pasan desapercibidas, a menos que se
tomen las debidas precauciones para su aislamiento y cultivo.
Muchos anaerobios son muy sensibles al oxígeno. En el
organismo existen distintos hábitos en los que pueden
encontrarse bacterias anaerobias obligadas formando parte de la
microbiota. Otras partes del organismo pueden llegar a ser
anóxicas como resultado de una herida o un traumatismo que
da lugar a la disminución de aporte sanguíneo al
lugar de la herida.
En general las bacterias anaerobias patógenas
forman parte de la microbiota y son únicamente
patógenos oportunistas.
Existen dos patógenos anaerobios importantes,
Clostridium tetanis (que produce el tétano) y Clostrium
perfungens (causante de la gangrena gaseosa y un tipo de
toxiinfección alimentaria), que osn bacterias formadoras
de esporas y predominan en el suelo.
El microbiólogo debe asegurarse de que la muestra
tomada esté libre de contaminación y que no entre
en contacto con el aire.
Cuando se precisa de una incubación en
anaerobiosis, las placas de agar se coloca en una jarra Gaspack
sellada que se hace anóxica reemplazando la
atmósfera de la jarra con una mezcla de gas libre de
oxígeno. Existen otras formas de eliminar el
oxígeno libre como son cultivos que contengan agentes
reductores y la utilización de cámaras de
anaerobiosis.
En el laboratorio las placas con agar se inocularon con
una muestra diluida con un ml de pollo luego las placas se
introducen en la jarra. Luego se corta el sobre por un extremo y
se le agrega 10 ml de agua y este se introduce en la jarra, luego
se tapa.
La inoculación de una muestra de gases que
contiene hidrógeno es seguida con la reacción
catalítica del oxígeno con el hidrógeno
produciendo agua. De esta forma solamente se desarrollará
microorganismos anaeróbicos estrictos y los aerobios
facultativos crecen limitados.
Experimento # 6
Este experimento se realizó igual que el de la
jarra Gas Pack con la diferencia en que aquí las placas se
colocaron en un frasco de forma invertida se le colocó una
vela encendida y se tapó el frasco y luego que la vela se
apagó se creo un vacío; se dejó en
temperatura ambiente por
24 horas y luego se sacó del frasco y se observó
colonias y se procedió a la prueba de la catalasa para
determinar su patogenesidad.
PELZAR, MICHAEL. Microbiología. Editorial Mc Graw –
Hill. 2ª edición. Impreso en México,
S.A.
SCOTT, BAILEY. Diagnóstico Microbiológico.
Editorial Panamericana. 7ª edición. Impreso en
Argentina.
CARPENTER PHILIP. Microbiología. Editorial
Interamericana. 2ª edición. Impreso en México.
COLLINS, C.H. Métodos Microbiológicos.
Editorial Acribia, S.A. Zaragoza España.
Impreso en España.
MADIGAN, MICHAEL. Biología de los
Microorganismos. Editorial Prentice may. 8ª edición.
Impreso en España (1999).
Documento cedido por:
JORGE L. CASTILLO T.
Universidad Nacional Experimental
De los Llanos Occidentales
Ezequiel Zamora
UNELLEZ