- Ventajas e inconvenientes de la
citometria de flujo - Estructura básica de un
citómetro de flujo - Información obtenida
por citometría de flujo
La CMF es una técnica sencilla que se aplica
en la rutina diaria de muchos laboratorios clínicos y de
investigación, capaz de proporcionar
resultados de forma rápida que pueden ser aplicables al
diagnostico. Gracias a su gran especificidad es capaz de
distinguir entre varias diferentes, y detectar una población celular en una muestra en la que
predominan otras poblaciones celulares mayoritarias. Pero la
principal característica de la CMF es que puede ofrecer
información simultánea de varios
parámetros de cada una de las células
analizadas y la relación entre los parámetros de
una célula y
los de otra célula también analizada. Permite el
análisis de dos parámetros de
dispersión, SSC/FSC y tres de fluorescencia (en equipos
con un solo láser),
Fl1, Fl2 y Fl3, y de una cuarta fluorescencia en equipos con dos
láseres. (www.citometriadeflujo.com)
VENTAJAS E
INCONVENIENTES DE LA CITOMETRIA DE FLUJO
Debido a la
necesidad de utilizar una suspensión de partículas
(células, núcleos, cromosomas, etc),
para ser leídos de una en una hace que se pierda
información sobre la arquitectura de
los tejidos que
componen las células o de las propias células,
así como la ineracción entre estas y el medio que
las rodea (patrones nodulares o difusos de los linfomas). Frente
a este inconveniente la CMF presenta múltiples ventajas
frente al microscópio de fluorescencia y las técnicas
citoquímicas, como:
– Posibilidad de empleo de
multiples frente a un solo marcaje de la citoquímica y la
microscopia de fluorescencia.
– Posibilidad de analizar un elevado número de
partículas en un corto período de tiempo (5000
partículas/segundo).
– Posibilidad de cuantificar la por medio de los canales medios de
fluorescencia.
– Mayor sensibilidad y objetividad que le permiten detectar
enfermedad mínima residual y caracterizar poblaciones
celulares poco abundantes en condiciones normales como los
basófilos.
– Posibilidad de analizar poblacionescelulares y epitopos
celulares. – Permite almacenar informáticamente la
información del análisis para poderla utilizar en
cualquier momento y reanalizar análisis hechos con
anterioridad.
– Posibilidad de cuantificar las moléculas
antigénicas presentes en un grupo celular.
(www.citometriadeflujo.com)
ESTRUCTURA BÁSICA DE
UN CITÓMETRO DE FLUJO
Esta compuesto por tres partes:
* SISTEMA
FLUÍDRICO – Inyección de la muestra.
– Cámara de flujo.
* SISTEMA OPTICO – Fuentes de
luz.
– Detectores
* SISTEMA ELECTRICO – Amplificador-convertidor.
– Sistema informatico
- SISTEMA FLUÍDRICO: Este sistema consta de dos
fluídos, uno que contiene en suspension a
la muestra y otro que lo envuelve a fin de darle estabilidad
(sheath fluid). Las células deben pasar una a una por
delante del haz del láser. Ambos fluídos
(Solución fisiológica, PBS, aire) no se
mezclan porque circulan a diferente presión.
- SISTEMA ÓPTICO: Este
sistema se compone de dos tipos de ópticas: - La óptica de excitación,
compuesta de el láser y las lentes apra enfocar y
dirigir el haz de luz; y - La óptica de lectura,
compuesta por las lentes de recolección de luz emitida
luego de la interacción entre el haz del láser
y las partículas y el sistema de espejos y filtros para
direccionar longitudes de onda específicas hacia los
detectores correspondientes. - FILTROS OPTICOS: Son aquellos que
seleccionan las longitudes de onda que deja pasar hacia el
detector. Estos pueden ser: - DE INTERFERENCIA (Dicroicos que reflejan las long de
onda no deseadas); - DE ABSORCION (absorben las long de onda no deseadas).
De éstos hay tres tipos: - Filtros Band Pass : Dejan pasar un rango de
longitudes de onda (Por ej: 620 – 640 nm) - Filtros Short Pass: Dejan pasar por debajo de una
longitud de onda determinada ( Por ej: < 575 nm) - Filtros Long Pass: Dejan pasar por encima de una
longitud de onda determinada (Por ej: > 520 nm)
- SISTEMA ELECTRICO: El sistema
electrónico convierte todo en señales digitales para almacenar en
la
computadora.
INFORMACION
OBTENIDA POR CITOMETRIA DE FLUJO
Básicamente
podemos obtener los siguientes datos:
- Tamaño de la
célula - Complejidad de la membrana celular
- Con el uso de fluorocromos se puede deterctar hasta 3
colores con un
mismo laser
Señales de dispersión: La
dispersión resulta de la interacción de la luz con
una partícula que produce un cambio de
dirección (no de la longitud de onda) en
todas las direcciones del espacio. Las características
morfológicas que determinan la dispersión de la luz
son fundamentalmente el tamaño celular, la membrana, el
núcleo y el material granular del interior de la
célula, llamado complejidad. En los Citómetros de
Flujo se miden dos fracciones de dispersión:
-La luz dispersada en ángulo cónico pequeño
(0-10º) que casi coincide con la dirección de la luz
incidente, llamada FSC (Forward Scatter). Es una medida
proporcional al tamaño de la partícula que produce
la dispersión.
-La luz dispersada en ángulo recto llamada SSC (Side
Scatter). Es proporcional a la complejidad de la estructura
interna de la partícula. (www.citometriadeflujo.com)
Señales de Fluorescencia: Un
fluorocromo
es una molécula química que absorbe
luz a una determinada longitud de onda (energía) y emite a
una longitud superior (menor energía). El espectro de
absorción o excitación es el rango sobre el que un
fluorocromo absorbe luz, y el espectro de emisión es el
rango sobre el que un fluorocromo emite luz. Cuando un
fluorocromo interacciona con la luz de excitación
procedente del láser emite energía radiante. Debido
a que parte de la energía se utiliza para la
absorción, la luz emitida es de menor energía que
la luz de excitación, es decir la longitud de onda emitida
es mayor. La diferencia entre la longitud de onda de
absorción y emisión se denomina Stokes shiff. Los
citómetros de flujo permiten detectar señales de
fluorescencia procedentes de complejos Antigeno/Anticuerpo
marcados con un fluorocromo y situados en una célula,
siendo la cantidad de señal de fluorescencia emitida igual
a la proporción de la cantidad de componentes
fluorescentes de la partícula.
(www.citometriadeflujo.com)
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seleccione la opción "Descargar" del menú
superior
De forma esquemática, las células
teñidas entran en la cámara de flujo de una en una
y, al pasar por delante de un haz de luz de láser, emiten
una luz fluorescente y dispersada, que es separada de acuerdo a
su longitud de onda por apropiados filtros y espejos. Estas
señales luminosas son recogidas por detectores y la
información se integra y analiza adecuadamente por un
sistema informático. (http://www.opolanco.es/Apat/Boletin2/CITOFLUJO.htm)
MARIANA PUCCIARELLI