- Líneas actuales de
investigación - Obtención de dihaploides
y optimización del proceso de
Androgénesis - Androgénesis en cebada.
Análisis genético - Obtención de nueva
variabilidad mediante transformación génica y
mutación in Vitro - Publicaciones más
representativas - Proyectos y Contratos de
Investigación más
representativos
Líneas actuales
de investigación:
Los cereales trigo y cebada tienen gran importancia en la
agricultura de
nuestro país, tanto por la superficie sembrada como por el
valor de la
producción. Los programas de
mejora de estos cereales, llevados a cabo tanto en organismos
públicos como en el sector privado, necesitan explotar la
máxima variabilidad posible. Esto debe hacerse de forma
rápida y además se debe complementar con nueva
variabilidad como base óptima para la obtención de
nuevas variedades. En este contexto, las actividades del Grupo se
centran en la optimización de técnicas
de cultivo in Vitro y regeneración de cereales como
herramientas
para la mejora de cereales. Estas técnicas permiten tanto
acortar el tiempo de
desarrollo de
los programas de mejora mediante la utilización de
plantas
doblehaploides (DH), ó introducir nueva variabilidad
mediante técnicas de transformación génica y
mutagénesis.
1. Obtención de
dihaploides y optimización del proceso de
androgénesis
Las actividades desarrolladas por nuestro Grupo en los
últimos años se han centrado en la puesta a punto
de técnicas de regeneración de plantas
doblehaploides (DH) de cebada a partir del cultivo de anteras y
microsporas. Como aplicación directa de estas
técnicas, se obtuvieron más de 2700 líneas
DH que entraron a formar parte de; a) Programa Nacional
de Mejora de Cebada; b) Proyectos de
búsqueda de marcadores
moleculares ligados a caracteres agronómicos.
Destacamos también que las variedades de cebada
"Belén" y "Lola" ambas registradas por el Instituto
Técnico Agrícola Provincial de Albacete (ITAP S.A.)
proceden de dos líneas DH obtenidas por nuestro grupo de
trabajo.
Asimismo se ha establecido una colaboración con la
Universidad
del Estado de
Washington (USA) para producir DH con el fin de obtener
variedades de cebadas cerosas desnudas, y el mapeo de genes que
afectan a la dormancia.
A pesar de los logros obtenidos, el bajo número de
microsporas que dividen, la baja proporción de embriones
completos desarrollados respecto al número de microsporas
que dividen, y los elevados porcentajes de albinismo de algunos
genotipos limitan en algunos casos la aplicación
práctica en mejora. Se necesita seguir optimizando los
protocolos de
androgénesis para reducir el coste de la producción
de los DH a partir de cualquier cruzamiento de interés
agronómico o científico.
Nuestros objetivos en
esta línea de investigación son: El desarrollo de
protocolos de androgénesis independientes del genotipo, el
estudio de los procesos
biológicos involucrados en el proceso del pretratamiento
de las anteras, y la influencia de la concentración de
algunos micronutrientes, en la inducción de la embriogénesis a
partir de microsporas de cebada y trigo. Al mismo tiempo estamos
estudiando la posibilidad de existencia de selección
gametofítica asociada a los procesos de
androgénesis. Para la evaluación
de las características agronómicas de los DH
producidos y la posible obtención de nuevas variedades,
este trabajo se realiza en colaboración con los Entes
Promotores/Observadores: Semillas Batlle S.A. y Prof. I. Romagosa
(UdL Lérida).
En el cultivo de anteras de cereales, a pesar de ciertas
dificultades todavía existentes, la cebada y el arroz se
han considerado cultivos modelos. La
aplicación directa al trigo de los protocolos
desarrollados para cebada han dado resultados limitados. Nuestro
grupo ha iniciado el desarrollo de técnicas de
producción de plantas DH de trigo blando y trigo duro, en
estrecha colaboración con distintas empresas
productoras de semillas. Estamos estudiando la influencia de
varios factores en las distintas fases de la androgénesis,
pretratamientos de estrés, y
medios de
inducción y regeneración. Hemos obtenido plantas DH
de varios cultivares de trigo duro y trigo panadero mediante el
cultivo de microsporas. El gran interés de estos materiales
para las empresas del sector se traduce en la firma de dos
Contratos,
CSIC-Agromonegros S.A y CSIC-Semillas Batlle S.A., para la
producción de dihaploides de trigo panadero y trigo
duro.
2. Androgénesis en
cebada. Análisis genético
La búsqueda de regiones cromosómicas (QTL,
Quantitative trait loci) implicadas en la respuesta al cultivo de
anteras ayudan a conocer los mecanismos genéticos que
gobiernan el proceso de la androgénesis. Nuestro objetivo en
esta línea de investigación es la
identificación de marcadores moleculares asociados a los
procesos de androgénesis en cebada, que nos permitan una
caracterización inicial de los híbridos propuestos
por los mejoradores, predecir su nivel de respuesta
androgénica y por lo tanto optimizar los recursos
destinados a la producción de líneas DH.
Se han obtenido poblaciones de doblehaploides segregantes para
el carácter cultivo de anteras, mediante el
cruzamiento entre dos genotipos Dobla e Igri de muy distinta
capacidad androgénica. Se realizó la
caracterización androgénica de la población mediante el análisis de:
número de divisiones, el número de embriones, la
capacidad de regeneración y la frecuencia de albinismo, de
cada una de las líneas.
De la caracterización de los polimorfismos moleculares
entre los parentales de las poblaciones segregantes, con
cebadores del tipo RAPD, microsatélites y marcadores del
tipo STS, se han podido determinar aproximadamente 100 marcadores
moleculares polimórficos que se han utilizado para
estudiar las poblaciones. Así se esta completando un mapa
de ligamiento para el cruzamiento Igri x Dobla. Con todos los
datos
obtenidos hasta el momento se esta trabajando en la
identificación de QTLs asociados al carácter
porcentaje de plantas verdes regeneradas, limitante de la
producción de plantas doblehaploides.
Dentro de esta línea de análisis genético
hemos insistido en la asociación entre el carácter
número de carreras y la respuesta androgénica.
Nuestra experiencia indicaba que los cultivares de cebada de seis
carreras tenían una respuesta menor que los de dos
carreras. La caracterización androgénica de un
mutante de Igri (cultivar de dos carreras) de seis carreras nos
ha permitido determinar que la baja respuesta androgénica
de los cultivares de seis carreras no se debe a un efecto de
pleiotropía, sino a ligamiento con genes relacionados con
androgénesis.
3.
Obtención de nueva variabilidad mediante
tranformación génica y mutación in
vitro
La mejora de plantas tiene ante sí grandes retos
para el desarrollo de nuevas variedades con
características agronómicas, comerciales y sociales
distintas a las que se habían considerado hasta ahora.
Para poder afrontar
no sólo la problemática actual, sino también
aquella que va emergiendo el mejorador necesitará explotar
una variabilidad que antes no era capaz de generar. En los
últimos años nuevas técnicas
biotecnológicas basadas en el cultivo in vitro han surgido
como respuesta a esta demanda como,
por ejemplo entre estas técnicas están la
tranformación génica y la mutación in
vitro.
La cebada ha resultado ser uno de los cereales más
recalcitrantes a las técnicas de transformación
génica, debido a la baja capacidad de regeneración
de los cultivos celulares y tisulares adecuados para la
transformación. Aunque en los últimos años
se han conseguido grandes avances en la producción de
plantas transgénicas de cebada, no podemos considerar esta
metodología como firmemente
establecida.
En nuestro grupo hemos puesto a punto un método
sencillo de transformación mediante una pistola de
partículas del tipo "Particle Inflow Gun" (P.I.G.),
construida en nuestro laboratorio.
Se ha utilizado como material vegetal microsporas aisladas y
embriones inmaduros. Mediante este protocolo se han
obtenido lineas transgénicas de los cultivares de cebada
Igri y Cobra utilizando microsporas como explantes diana.
También se han obtenido líneas transgénicas
de cebada a partir de embriones inmaduros o callos
embriogénicos jóvenes de los cultivares Hop y
Cobra, utilizando material crecido en campo y en cámaras
de crecimiento. Las mayores eficiencias de transformación
se alcanzaron con material de campo y presiones de
selección elevadas. Se demostró la presencia de los
transgenes en el interior del genoma de las plantas T0 y
T1.
Una vez puesta a punto la técnica de
transformación, se ha aplicado para aumentar a
producción de fructanos en cebada, dentro de un proyecto FEDER,
que se está realizando en colaboración con los Drs.
Martinez-Carrasco (CSIC-Salamanca) y Puigdomenech
(CSIC-Barcelona). Actualmente se están realizando los
análisis moleculares de las líneas que han superado
el proceso de selección.
La aplicación de agentes mutágenos y
recuperación de líneas mutantes ha demostrado ser
muy útil para la generación de nueva variabilidad.
En los últimos años ha aumentado la potencialidad
de esta técnica gracias a la inducción y
selección de mutaciones in vitro y el uso de dihaploides
para acortar los ciclos de mejora de las variedades mejoradas a
partir de los mutantes. Nuestro grupo ha puesto a punto un
protocolo que nos permite la producción eficiente de
mutantes de cebada mediante la aplicación de ázida
sódica a anteras o a microsporas cultivadas in vitro. Se
han podido identificar 61 mutantes a partir de una
población inicial de 564 dihaploides procedentes de
microsporas tratadas con ázida sódica. Estos
incluyen mutantes en altura de la planta, precoces,
tardíos, cerosos, con desarrollo de las flores
laterales.
Publicaciones más
representativas:
Castillo AM, Egaña
B, Sanz JM, Cistué L (1998). Somatic embryogenesis and
plant regeneration from barley cultivars grown in Spain. Plant
Cell Reports, 17: 902- .
Cistué L, Ramos A, Castillo AM (1999). Influence of
different anther culture pre-treatments in the production of
barley doubled haploid. Plant Cell Tissue and Organ
Culture, 55: 159- .
Castillo AM, Vallés MP, Cistué L (2000).
Comparison of anther and isolated microspore culture in barley.
Effects of culture density and generation medium.
Euphytica, 111: 1- .
Castillo AM, Vallés MP, Cistué L (2000).
Improvements of barley androgenesis for plant breeding. In: B.
Bohanec (ed) Biotechnological Approaches for Utilization fo
Gametic Cells, pp.15-21. European COST Action 824: Gametic
Embryogenesis, Brussels (Belgica).
Ramírez C, Testillano PS, Castillo AM, Vallés
MP, Coronado MJ, Cistué L, Risueño MC (2001). The
early microspore embryogenesis pathway in barley is accompained
by concrete ultrastructural and expression changes.
International Journal of Developmental Biology, 45:
57-
Castillo AM, Cistué L, Vallés MP, Sanz JM,
Romagosa I, Molina-Cano JL (2001). Efficient production of
androgenic doubleb haploid mutants in barley by the application
of sodium azide to anther and microspore cultures. Plant Cell
Reports, 20: 105- .
Castillo AM, Cistué L, Romagosa I, Vallés MP
(2001). Low responsiveness of six-row genotypes to androgenesis
in barley does not have a pleiotropic basis. Genome, 44:
936- .
Proyectos y Contratos de
Investigación más representativos:
Embriogénesis
androgénica encaminada a la mejora de cebada mediante
biotecnología: Análisis
genético y molecular. Programa Sectorial de Promoción General del Conocimiento
(DGES). 1998-2001.
Investigadora principal: María Pilar Vallés
Brau.
Mejora del proceso de obtención de nuevas variedades
de trigo duro (Triticum durum, L.), para su cultivo
en Aragón, mediante el método de
Haplo-Diploidización. Proyectos cofinanciados con
Fondos FEDER. 2000-2001.
Investigador principal: Luis Cistué Sola.
Transformación genética
de la cebada para la producción de fructanos con nuevos
usos en la industria
agroalimentaria de Castilla y León. Proyectos
cofinanciados con Fondos FEDER. 1999-2002.
Investigador principal: R. Martínez-Carrasco.
Mejora del proceso de obtención de nuevas variedades
de cebada de mayor calidad y
tolerancia a
estreses abióticos mediante la optimización del
proceso de producción de dihaploides, generación de
nueva variabilidad somática por medio de la
mutagénesis inducida y posterior selección
gametofítica. CICYT, Plan Nacional de
Ciencias
Agrarias. 2000-2002.
Investigador principal: Luis Cistué Sola.
Contrato CSIC – Semillas Batlle S.A. para la
producción de dihaploides de trigo panadero y trigo
duro. Semillas Batlle S.A. 2001-2002.
Investigador principal: Luis Cistué Sola.
Contrato CSIC – Agromonegros S.A. para la producción
de dihaploides de trigo panadero y trigo duro. Agromonegros
S.A. 2001-2002.
Investigador principal: Luis Cistué Sola.
Producción y aplicación de técnicas de
biotecnología en las líneas doblehaploides de
cebada. Predicción de la respuesta androgénica de
los genotipos y análisis de la variación
genética generada. Plan Nacional de Recursos y
Tecnologías Agroalimentarias. 2001-2004.
Investigadora principal: María Pilar Vallés
Brau.
El autor pidió el anonimato.