Seminario del género Haemophilus

• Caracteristicas generales
• Clasificacion
• Estructura Antigenica
• Patogénesis del genero Haemophilus
• Epidemiologia y control
• Medios y condiciones de incubación
• Tratamiento
• Bibliografía

 

 

TAXONOMIA

FAMILIA: PASTEURELLACEAE.

GENERO: HAEMOPHILUS

ESPECIES: Haemophilus influenzae

Haemophilus parainfluenzae

Haemophilus haemoliticus

Haemophilus parahemoliticus

Haemophilus aphrophilus

Haemophilus paraphrophilus

Haemophilus segnis

Haemophilus ducreyi

Haemophilus aegyptus

CARACTERISTICAS GENERALES

     Coco bacilos Gram negativos.

     Son pleomórficos

     Son inmóviles.

Tamaño: 0.4 mm de ancho x 1 mm de largo.

     Se agrupan a menudo en cadenas cortas y bacilos aislados o bien filamentosos

    No forman esporas.

    No pose cilios.

    Algunas espacies son capsuladas.

    Es una bacteria anaerobia facultativa

    Temperatura óptima de crecimiento a 37

• Algunas especies de Haemophilus requieren factores de crecimiento que están presentes en la sangre como factor X y factor V.  
• Algunos producen hemólisis como Haemophilus haemolyticus y Haemophilus parahaemolyticus.

 

CLASIFICACION DE HAEMOPHILUS.

• Se han descrito 19 especies distintas dentro del género Haemophilus y estos se han clasificado basándose en las necesidades para su crecimiento, pero solo 9 especies del género son humanas.
• Algunas especies requieren factor X que es un grupo de compuestos tetrapirrolicos termoestables que son proporcionados por diversos pigmentos que contienen hierro por ejemplo: Hemina y Hematina.
• Los compuestos de factor X se usan en la síntesis de Catalasas Peroxidasas y el Sistema de transporte de electrones de citocromo.
• 
  
  
• Los microorganismos que dependen del factor X para su crecimiento son capaces de sintetizar protocorfilina a partir de ácidos alfa aminolevelinico. Una reacción que sirve como base para detectar cepas de Haemophilus.
• Algunas especies de Haemophilus pueden también requerir factor V (dinucleótido de nicotidamina y adenina).
• Las especies de Haemophilus dependiente del factor V no crecen generalmente en agar-sangre de rutina en el cual los eritrocitos están intactos.
• Pueden usarse medios que contienen eritrocitos lisados como agar chocolate o agar sangre con 5% de sangre no lisada de caballo o conejo y medio con suplemento de fildes para la recuperación de especies de Haemophilus de muestras clínicas. 
• La especies humanas de Haemophilus se asocian con las vías respiratorias altas con excepción del Haemophilus ducreyi que causa una enfermedad de transmisión sexual denominada Chancroide.
• Las especies de Haemophilus recuperadas de muestras humanas se identifican en el laboratorio clínico por la demostración del requerimiento del factor X y V, reacciones hemolíticas en agar-sangre de caballo, producción de catalasa y oxidasa y mediante la realización de diversas pruebas bioquímicas de rutina, que incluyen producción de indol, actividad de ureasa, actividad de ornitina de decarboxilasa.
• 
  
  

 

ESTRUCTURA ANTIGENICA

El Haemophilus influenzae posee en sus envolturas 3 factores antigénicos importantes ellos son:

• • El polisacárido capsular
  • El LPS (endotoxina)
  • La proteína de la membrana externa (proteasas de Ig A humanas)
• Los componentes más importantes son: el polisacárido capsular y la endotoxina.
• Estos seria responsables de la virulencia, adherencia y resistencia a la fagocitosis.
• Estos microorganismos también elaboran proteasas de Ig A que son enzimas capaces de hidrolizar la cadena pesada de Ig A1 humana.
• Como se fija a las mocosas donde el mecanismo inmunológico esta mediado por Ig A, su clivaje puede ayudar a la virulencia del microorganismo.

 

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 PATOGÉNESIS DEL GENERO HAEMOPHILUS

• Forman parte de la flora normal de tracto respiratorio y ocasionalmente del tracto genito urinario del hombre.
• Pueden causar infecciones del tracto respiratorio superior, infecciones supurativas sobre todo en zonas adyacentes al tracto respiratorio e infecciones sistémicas.

 

HAEMOPHILUS INFLUENZAE TIPO B CAPSULADO

 

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• Es el agente etiológico mas común de meningitis bacteriana en niños de1 mes a 4 años de edad.
• La colonización nasofaringea previa en un huésped susceptible llevan a la invasión del torrente circulatorio y a la posterior siembra en las meninges.
• Haemophilus influenzae, la especie patógena más importante del género, también esta asociada a infecciones como epiglotitis, celulitis, artritis séptica y neumonía.

Manifestaciones clínicas de infección invasiva por Hib

Hib: colonización en el hombre

 

Haemophilus influenzae tipo b. Celulitis de brazo y pie.

 

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 HAEMOPHILUS INFLUENZAE NO CAPSULADO

Estos microorganismos están asociados a las siguientes patologías:

     Bronquitis crónica.

     Otitis media.

     Sinusitis.

     Conjuntivitis.

 

EPIDEMIOLOGIA Y CONTROL

MECANISMO DE TRANSMISIÓN: Es por vía inhalatoria a partir de los casos activos, de los convalecientes o de los portadores. Así los microorganismos penetran a los tejidos por vías respiratorias superiores.

FUENTE DE INFECCIÓN: Es el hombre. La incidencia del estado de portador es del alrededor del 70% en niños pequeños y del 35% en adultos, pero pueden ser aún mayor según la época del año. 

DISTRIBUCIÓN GEOGRAFICA: Las infecciones por este microorganismo ocurren en todo el mundo sobre todo en zonas de bajos recursos económicos.

Enfermedad por Hib: factores de riesgo

 

PREVENCIÓN: Se puede prevenir por administración de vacuna conjugada. Los niños de 2 meses de edad o mayores pueden inmunizarse con vacunas de Haemophilus tipo b con uno de sus dos portadores:

• Proteína portadora de Corynebacterium mutante (proteína de la toxina)

     Con el complejo de membrana externa de Neisseria meningitidis.

 

 

 

RECOGIDA DE MUESTRA.

1. 
   
   

   Se recogerá en un recipiente estéril de tapa bien ajustada y segura, se enviara al laboratorio sin demora para procesar la muestra. La muestra que no se procesa de inmediato se pude refrigerar por 3 horas.

2. Esputo:

   Obtenida por el medio en que recipiente estéril proporcionado por el laboratorio, la muestra debe procesares de inmediato.

3. LCR.
4. Hisopado de garganta, Secreciones faríngeas.

Es necesario que el paciente este en ayunas la muestra debe tomarse con sumo cuidado, debe:

• Colocar al paciente sentado y pedirle que trague saliva fuertemente dos veces.
• Pedir al paciente que abra la boca y saque la lengua. 
• Con un baja lenguas, presionar fuertemente la lengua hacia abajo simultáneamente iluminar bien el fondo de la lengua.
• Localizar en el fondo de la garganta y en las amígdalas los lugares de lesiones. 
• Con un hisopo estéril frotar firmemente las lesiones con sumo cuidado de no tocar la lengua, la campanita, los carrillos o los labios al retirar el hisopo.

 

 

1. Otras muestras.

• Sangre
• 
  
  
• Secreciones de ulceras genitas
• 
  
  
• Hisopado conjuntival
• 
  
  
• Aspirado de oído medio.

 

 

Transporte de la muestra 

• El hisopado y secreciones.

Se debe remitir al laboratorio de inmediato, si la muestra no se procesa en un plazo de tres horas colocara en un medio de transporte como Amies o Stuart.

• Esputo.
• 
  
  

Debe enviarse de inmediato al laboratorio, si se deja en reposo después de recogerlo puede producirse una proliferación de bacterias contaminantes que haga sumamente engañosos los resultados.

  

Medios y condiciones de incubación para Haemophilus

 

1. Agar chocolate

2. Técnicas de la estría de estafilococicos.

3. Agar sangre de Casman y disco de bacitracina de 10 microgramos

4. Agar de Levinthal o agar de enriquecimiento de fildes

1. AGAR CHOCOLATE

Este puede repararse calentando una base de agar de sangre estéril a una temperatura (alrededor de 80ºC) suficientemente alta como para lisar los eritrocitos de carnero y liberar los factores de x y v.

Debe evitarse el calentamiento prologado el factor V es termolábil.

También se puede comprar el agar chocolate de proveedores comerciales que estén mejor preparados para estandarizar el contenido de los productos.

Este agar habitualmente es una mezcla sintética de hemoglobina (factor x) y un "cócktail" de factores de crecimiento.

El agar chocolate tiene la desventaja de que no puede determinar las propiedades hemolíticas del Haemophilus haemolyticus y Haemophilus parahaemolyticus

Se requiere experiencia para visualizar colonias de Haemophilus, ya que tiene un aspecto blanco grisáceo semi opaco ligeramente mucoide.

2 .Técnica de la estría de estafilococos.

 

• Las especies de Haemophilus que requieren factor V pueden aparecer como pequeñas colonias que asemejan gotas de rocio dentro de las zonas de producción de NAD (Factor V) alrededor de las colonias de otras bacterias.  
• Esta técnica es particularmente adaptable al aislamiento de Haemophilus influenzae de LCR, sangre u otro tipo de muestra.
• Puede efectuarse una identificación presuntiva de los microorganismos en cultivo de material faringeo y esputo haciendo una estría estafilococcica a través del área de la segunda estría.

 

PRUEBA DE SATELITISMO

 El crecimiento de Haemophilus se logra en agar chocolate ya que los factores de crecimiento se encuentran libres en el medio.

Se inocula agar chocolate luego incubarlo de 18-24 horas en jarra con candela.

Observamos colonias muy pequeñas puntiformes, traslúcidas y ligeramente mucosas.

• Hacemos frotis y se colorea con Gram para observar si predominan cocos bacilos Gram negativos pleomórficos.

Tomar una asada del crecimiento en agar chocolate y estriar en el centro de agar sangre de carnero 5% solo en una dirección.

• En sentido perpendicular a la estría efectuada hacer una estría de Staphylococcus aureus, recta y a lo largo de toda la caja. 
• Incubar el agar sangre de 24 a 48 horas a 36º C. en jarra húmeda con candela.
• Una prueba positiva de satelitismo consiste en el crecimiento de las pequeñas colonias de Haemophilus solo muy cerca de la estría de Staphylococcus aureus.

Se debe hacer un frotis coloreado por Gram para confirmar la morfología.

 

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3. Agar Sangre de casman y disco bacitracina de 10 mg/ml

• El agar sangre de carnero con aplicación de un disco de bacitracina de 10 microgramos en el área más abundante inoculada provee un excelente método para aislamiento de Haemophilus
• 
  
  
• Sobre todo a partir de muestras en las que se puede anticipar un desarrollo confuso de bacterias mixtas.

Haemophilus se puede reconocer por su desarrollo alrededor del disco de bacitracina en agar Casman

 

• Los componentes del medio agar sangre de Casman son: peptona, extracto de carne, cloruro de sodio y agar al 2.5 % para acrecentar el desarrollo de las especies de Haemophilus.

 

El disco de bacitracina inhibe el desarrollo de muchas bacterias grampositivas comúnmente halladas en cultivos mixtos.

Placas de agar sangre equina preparadas con medio base de Casman y discos de bacitracina de 10 microgramos. Este medio enriquece el desarrollo de especies de Haemophilus. El disco de bacitracina inhibe el desarrollo de la mayoría de bacterias comensales halladas en las secreciones de las vías respiratorias superiores.

4. AGAR CON ENRIQUECIMIENTO DE FILDES.

Es un digerido peptídico de sangre ovina que puede obtenerse en el mercado e incorporarse al agar para el aislamiento de Haemophilus

Este agar contiene factor VyX lo que evita la necesidad de agregar sangre entera al medio, este enriquecimiento en general se agrega a una base de infusión de cerebro corazón o ATS con concentración al 5% lo que da como resultado un medio traslúcido.

No pueden determinarse propiedades hemolíticas en medios sin sangre con el enriquecimiento de fildes por que no hay eritrocitos enteros.

Usos: sirve como suplementos de medios para pruebas de susceptibilidad antimicrobiana para microorganismos exigentes.

 

Características utilizadas para identificar Haemophilus.

Se utilizan tres categorías para identificar las especies de importancia clínica que son:

1. 
   
   
2. Reacción hemolítica en sangre de caballo
3. La necesidad del factor V
4. Requerimiento del factor X para el desarrollo.

Hay otras características utilizadas como la necesidad de mayor tensión de CO2

Producción de indol

El factor X (Hemina) y el factor V (NAD) son requeridos en forma separada o combinada para promover el desarrollo de varias especies de Haemophilus.

• El organismo en estudio se inocula por estrías en un medio deficiente de factores X y V.
• Estos agares deficientes de estos factores son:
• Agar Muller Hilton o agar tripticasa soya.
• Las tiras o discos de papel filtro impregnados con los factores V y X se aplican a la superficie del agar inoculado y se observan los patrones de desarrollo alrededor de las tiras de papel.

 

 

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BIOTIPIFICACION DE HAEMOPHILUS INFLUENZAE Y HAEMOPHILUS PARA INFLUENZAE

El estudio taxonómico del género Haemophilus introdujo el uso de pruebas bioquímicas para la identificación y caracterización de estos microorganismos. Sobre la base de tres pruebas:

• Producción de indol
• Producción de urea
• Producción ornitina descarboxilasa

 

Condiciones de incubación.

Las placas para requerimiento de factor X y V se incuban con 5 a 10 % de CO2 a 35º C durante 18 -24 horas y se observan los patrones de desarrollo alrededor de las tiras.

También se utiliza el método de estrías de Staphylococcus aureus para determinar los factores V y X que requieren otros medios de agar:

1. Un medio deficiente de factor V y X (Muller Hinton)

2. Un medio de agar sangre que solo tenga factor X, como agar chocolate que se ha mantenido a 60º C para lisar los GR.

• • Cada uno de los medios se estría con una cepa de Staphylococcus aureus productora de factor V.
  • Luego de inocular la superficie del agar con la muestra, se incuba a 37oC en CO2
• El desarrollo de colonias en agar sangre indica necesidad de factor X únicamente.
• 
  
  
• La presencia de desarrollo solamente cerca de la estría de Staphylococcus en agar sangre indica requerimiento de ambos factores.

Si el desarrollo se observa solo cerca de la estría de Staphylococcus en ambos medios la especie solo necesita factor V.

 

 

PRUEBA DE LAS PORFIRINAS

También se puede utilizar la prueba de la porfirina que es para detectar cepas de Haemophilus dependientes del factor X, basada en el principio de que la cepa carece de la enzima porfobilinógeno sintetasa que transporta el ácido gamma aminolebulinico en porfobilinógeno, por lo tanto la detención de porfobilinógeno o porfirinas en el sustrato de la prueba indica que la bacteria es capaz de efectuar la síntesis endógena del hemo y no requiere una fuente exógena de factor X.

TÉCNICA

Se suspende una asada del microorganismo en 0.5 ml de sustrato enzimático.

Se incuba 35 º C durante 4 horas (Suspensión concentrada)

Si la concentración es diluida incubar de 18 a 24 horas

• Se añade reactivo de Erlich

INTERPRETACIÓN

La aparición de color rojo en la fase acuosa indica la presencia de porfobilinógeno, una prueba positiva indica que el organismo no requiere de factor X:

Prueba de la Porfirina. El tubo de la izquierda muestra una prueba positiva (color rosado) comparado con el control negativo de la derecha. Los tubos contienen un sustrato compuesto por clorhidrato de ácido gamma-aminolevulínico. Los microorganismos que no requieren factor X son capaces de sintetizar porfobilinógeno a partir del ácido levulínico del sustrato que produce un color rojo en la fase acuosa cuando reacciona con el reactivo de Ehrlich

 

 

IDENTIFICACIÓN RÁPIDA PARA HAEMOPHILUS INFLUENZAE TIPO "b"

• La importancia clínica de Haemophilus influenzae tipo b ha estimulado el desarrollo de métodos inmunológicos rápidos para la detección del polisacárido capsular directamente en las muestras clínicas como LCR, suero y orina.
• El microorganismo una vez aislado puede ser identificado rápidamente.
• 
  
  
• También es posible usar la prueba de Quellung con Ac específicos para identificar presuntivamente los microorganismos presentes en secreciones respiratorias y LCR.
• 
  
  

Prueba de Quellung (Hinchamiento de la cápsula)

• Si hay suficientes microorganismos en el preparado teñido, puede efectuarse una identificación confirmadora de Haemophilus influenzae tipo b usando la prueba de Quellung.

 

Procedimiento.

• Se mezcla una gota de Antisuero para Haemophilus influenzae, una gota de la muestra en un portaobjeto y una gota de azul de metileno al 3%.
• Si se desea se prepara un control negativo (una gota de la muestra con azul de metileno al 3% y sin Antisuero) en el mismo portaobjeto.

 

• Se colocan cubreobjetos sobre cada preparado y después de 10 minutos a temperatura ambiente, se examinan.
• Se debe ajustar la iluminación, cerrando el condensador.
• 
  
  
• Presentan una aparente "tumefacción" que se debe a la formación de un complejo Ag-Ac en la superficie del microorganismo, lo que causa un cambio en el índice de refracción de la cápsula y una "tumefacción" aparente.
• Un resultado positivo de la prueba de Quellung confirma la identificación de Haemophilus influenzae tipo b.
• Otros microorganismos a los que se les puede practicar la prueba son: Streptococcus pneumoniae y Neisseria meningitidis.
• 
  
  

PRUEBA RÁPIDA DE PRODUCCIÓN DE BETA-LACTAMASAS.

• Alrededor De un 10% de los aislamientos de Haemophilus recuperados en laboratorios clínicos es resistente a la ampicilina por la producción de las beta-lactamasas. Esta característica está ligada a plásmidos y puede transferirse de cepas resistentes a cepas sensibles. 
• La beta-lactamasa es una enzima extracelular producida por muchas cepas de bacterias que específicamente hidroliza la unión amida en el anillo b-lactámico de análogos de penicilina, con lo cual el antibiótico resulta inactivo.
• 
  
  
• Se usan dos pruebas para la detección de ácido peniciloico en el medio de la prueba: Método capilar y Método yodométrico.
• El método capilar depende de:
• Un cambio de color del indicador rojo de fenol que señala el cambio de pH.
• El método yodométrico depende de:
• la capacidad del ácido peniciloico de reducir yodo a yoduro, lo que da como resultado una decoloración del complejo azul de yodo y almidón.

Método Capilar.

• Se sumergen tubos capilares en la solución de prueba de penicilina y rojo de fenol.
• Se deja que los tubos se llenen por acción capìlar hasta una distancia de 1 a 2 cm.
• Se raspan suavemente varias colonias de Haemophilus influenzae crecidas en la superficie de una placa de agar, formando un tapón bacteriano en el fondo del tubo.

 

 

Prueba de la beta-lactamasa en tubo capilar. El desarrollo de un color amarillo cerca de la parte superior del tubo, en la zona de inoculación bacteriana, indica la producción de ácido peniciloico por destrucción del anillo beta-lactámico de penicilina por acción de la beta-lactamasa.

 

• Debe tomarse la precaución de que no quede aire atrapado entre la solución de prueba y las bacterias.
• Se incuban a temperatura ambiente en posición vertical.
• Si el microorganismo produce b-lactamasa, la solución se torna amarillo brillante en 5-15 minutos.
• 
  
  
• Los microorganismos negativos no producen cambios en el medio o sólo producen un tinte rosado.

 

 

Método yodométrico

• Se inocula agar de Levinthal modificado con un cultivo puro de microorganismo en estudio y se incuba a 35 grados C.
• Se suspende una asada de inoculación del crecimiento bacteriano en la mezcla de buffer-penicilina hasta obtener alrededor de 109 células (Standard de MacFarland).

 

• Después de una hora de incubación a temperatura ambiente.
• Se agregan 2 gotas del indicador de almidón y se mezcla. Se agrega una gotita de solución de yodo y se mezcla.
• Rápidamente se desarrolla un color azul inicial debido a la reacción del yodo con el almidón.
• Se gira la mezcla durante 1 minuto.
• La persistencia del color azul durante más de 10 minutos constituye una prueba negativa.
• La rápida decoloración del medio indica que se ha formado ácido peniciloico y representa una prueba positiva.

K y L

Tiras de papel filtro impregnadas con sustrato penicilina-almidón y 2 gotas de reactivo de yodo. Los organismos que producen beta-lactamasa son capaces de reducir el yodo a yoduro incoloro, creando áreas de decoloración del complejo yodo-almidón al aplicar las colonias directamente a las zonas reactivas. Obsérvense las reacciones positivas en las manchas de la derecha, en comparación con los controles negativos de la izquierda.

 

 

TINCIÓN DE GRAM Y AZUL DE METILENO

Puede hacerse un diagnóstico presuntivo y rápido de infección por Haemophilus influenzae por medio del exámen directo del material clínico adecuado usando estas tinciones.

• Si se recibe suficiente muestra debe centrifugarse antes del exámen en caso que fuese LCR.
• Se coloca una gota de la muestra en un portaobjeto de vidrio limpio.
• Se fija con calor y se efectúa la tinción de Gram.

 

• Se observan como pequeños cocobacilos Gramnegativos pálidamente teñidos.
• Hacer un frotis simultáneo teñido con azul de metileno.
• Con esta tinción las bacterias se ven como cocobacilos azul negro contra un fondo azul-gris claro. 

 

 

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Gram stain of Haemophilus influenzae from sputum

 

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SEROTIPIFICACION DE HAEMOPHILUS INFLUENZAE

• La técnica más sensible, rápida y económica para la tipificación y aislamiento es la aglutinación en portaobjetos.

 

• También se dispone de una prueba confirmadora con cultivo y coaglutinación.

DETECCIÓN DE ANTÍGENOS CAPSULARES TIPO B

• Para establecer un diagnóstico rápido de infección sistémica por Haemophilus tipo b, se dispone de varias técnicas para la detección del Ag de polirribosa-ribitol-fosfato de tipo b en LCR, suero y orina. Estas técnicas comprenden: 
• Contrainmunoelectroforesis (CIE) 
• Aglutinación con látex y coaglutinación de proteína A 
• Ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) 
• Se Dispone comercialmente de pruebas de aglutinación con látex y coaglutinación para la detección de Ag de H. influenzae tipo b en líquidos corporales y se usan ampliamente en laboratorios.
• En estos sistemas, Ac contra Ag capsular de polirribosa-ribitol-fosfato de los microorganismos tipo b se unen a partículas de látex o células estafilocócicas.  
• La mezcla de los líquidos corporales apropiados con estos reactivos da como resultado una aglutinación visible de segundos a minutos.
• La técnica de ELISA también es sensible para detectar el Ag en líquidos corporales.
• En este método los Ac se unen a los pocillos de plástico de una bandeja para microtitulación.
• Se coloca el líquido sospechoso de contener el Ag en los pocillos y el preparado se incuba para permitir la formación de complejos Ag-Ac.
• Después del lavado de los pocillos para eliminar material no unido.
• Se agrega a la mezcla un conjugado de enzimas-anticuerpos antihumanos específico.  
• Después de la incubación y el lavado.  
• Se agrega el sustrato enzimático y la reacción de color se lee con un espectrofotómetro.  
• La intensidad de la reacción de color es directamente proporcional a la cantidad de Ag unido.

 

TRATAMIENTO

    Son susceptibles a la ampicilina.

    Susceptibles al cloranfenicol cefalosporina

    Sensibles a penicilina G, eritrobicina o azitromicina

 

 

BIBLIOGRAFÍA.

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Diagnóstico Microbiológico

Editorial Médica Panamericana

Séptima Edición, Buenos Aires, Argentina.

Miguel Torres

Manual Práctico de Bacteriología Médica

Editorial Serviprensa C.A

Guatemala, Guatemala 1,999

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Métodos Básicos de Laboratorio en Bacteriología Clínica

Ginebra, Suiza 1,993

Koneman

Diagnóstico Microbiológico Editorial Médico Panamericano

Montevideo .R.O DE Uruguay

Buscador Google.

Buscador Altavista.

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Karla Rodríguez