Laboratorios de Bioquímica

Para biólogos, médicos, agrónomos y veterinarios

1. Práctica de laboratorio # 1. Células procariotas y eucariotas
2. Práctica de laboratorio # 2. Cloroplastos y pigmentos fotosintéticos
3. Práctica de laboratorio # 3. Estudio de la actividad de las peroxidasas
4. Práctica de laboratorio # 4. Estudio cinético del enzima alfa-amilasa
5. Práctica de laboratorio # 5. Acción hidrolítica de las amilasas de semillas de gramíneas
6. Práctica de laboratorio # 6. Acción hidrolítica de las lipasas de semillas de oleaginosas
7. Práctica de laboratorio # 7. Reacciones de transaminación
8. Práctica de laboratorio # 8. Respiración en células vegetales

Estimado Estudiante o Profesor :

Cuando un estudiante graduado de un nivel medio de enseñanza decide optar por el estudio en el nivel superior de carreras de las Ciencias Biológicas puras o aplicadas como las Ciencias Médicas, la Cultura Física, la Veterinaria o la Agronomía se encuentra con el hecho de que en casi todas ellas se encuentran incluidos cursos iniciales de Química que pueden abordar contenidos básicos de la Química General , Química Orgánica y Bioquímica. Los laboratorios que generalmente aparecen en los manuales son dedicados a los estudiantes de Ciencias Químicas por lo que presentan poca vinculación con estas otras carreras.

El presente manual se elaboró dirigido a el resto de las carreras que reciben la Bioquímica como una asignatura básicaEste manual tiene como característica que los laboratorios están diseñados en forma de experimentos. El nivel de complejidad va en incremento de forma tal que los experimentos precedentes van preparando al estudiante para el desarrollo de los posteriores y las habilidades prácticas se van sistematizando a lo largo de los diferentes laboratorios. Al final d cada uno de ellos se orienta la realización d un informe que facilita la integración de los conocimientos.

Otra característica importante es que la mayoría de los laboratorios emplean materiales obtenidos de fuentes naturales para comprobar en ellos la presencia y transformación de las sustancias que se quieren estudiar. Esto permite que el estudiante tenga mayor vinculación con la vida y con la carrera específica que estudia , lo que hace más amenos estos laboratorios.

Esperamos que los mismos sean de utilidad para sus estudios. Muchas gracias.

Los autores

BIOQUIMICA.

PRACTICA DE LABORATORIO # 1.

CELULAS PROCARIOTAS Y EUCARIOTAS.

INTRODUCCION.

Por su pequeño tamaño las bacterias no resultan fáciles de distinguir al microscopio óptico sin la ayuda de coloraciones específicas. Algunos métodos complejos de coloración dan incluso la posibilidad de diferenciar unas bacterias de otras, y estudiar particularidades de la estructura de las células bacterianas. Un ejemplo de éstos es el desarrollado por Gram en 1884, pero que no ha perdido su valor práctico hoy día. En el caso de este método las bacterias se subdividen en grampositivas y gramnegativas, lo que facilita la realización del diagnóstico diferencial de algunas enfermedades infecciosas, así por ejemplo se sabe que todos los cocos patógenos, excepto los gono y meningococos, son grampositivos; los vibriones, treponemas y representantes de la familia de las bacterias intestinales son gramnegativos, y todos los bacilos y clostridios son grampositivos.

En el caso de la coloración por este método los microorganismos son sometidos a dos procesos de tinción consecutivos y separados entre sí por una decoloración alcohólica. La primera tinción se realiza con el colorante de violeta genciana o violeta de metilo, y la segunda con fucsina. En este caso los microorganismos grampositivos se tiñen de color violeta y los gramnegativos de color rosado-rojo, lo que está condicionado por las particularidades de la estructura y la composición química de las células de los microorganismos: en los grampositivos la pared celular consta, en lo fundamental de una capa gruesa de mureína (90%) y ácido teicoico, mientras que en los gramnegativos la pared contiene solamente un 5-10% de mureína, no hay ácido teicoico y tienen una mayor cantidad de proteínas y lípidos en su pared. En el transcurso de la coloración, durante el tratamiento con alcohol las bacterias grampositivas cierran los poros de su pared impidiendo la salida del colorante y conservando el color violáceo que las caracteriza, mientras que las gramnegativas, de paredes más finas lo pierden al ser tratadas con alcohol, se decoloran y luego pueden reteñirse con el segundo colorante rosado.

BIBLIOGRAFIA.

- Chechetkin, A.V. Prácticas del ganado y las aves de corral. Editorial Mir, 1984.

- Pequeño Pérez, J. Prácticas de Fisiología Vegetal. Editorial Pueblo y Educación, 1972.

PARTE EXPERIMENTAL

EXPERIMENTO # 1:

OBSERVACION DE CELULAS PROCARIOTAS. TINCION DE GRAM PARA BACTERIAS.

MATERIALES Y REACTIVOS:

• Suspensión de cultivo bacteriano o material biológico fuente de bacterias a examinar.
• Solución de violeta genciana o de violeta de metilo
• Solución de Lugol
• Alcohol al 95 %
• Solución Fucsina o Safranina para contrateñir
• Goteros, pipetas, portaobjetos, mechero, microscopio con lente de inmersión.

PROCEDIMIENTO:

1. Tome con la ayuda del gotero una muestra de la suspensión bacteriana a examinar y colóquela cuidadosamente sobre el portaobjetos. Fije las células por calor al mismo con la técnica del frotis.
2. Sobre el frotis fijado vierta la solución de violeta y deje en reposo 1 minuto. Luego vierta la solución.
3. Trate el frotis con la solución de Lugol durante 3 minutos y sin lavarlo con agua, se vierte luego la solución. (El Lugol forma un complejo cristal violeta-iodo).
4. Decolore el frotis con alcohol al 95 % durante 0,5 min (30 seg) moviendo el portaobjetos hasta que desaparezcan los chorros gris violáceos del colorante. Después lave con agua.
5. Sobre el frotis eche la Fucsina o la solución de Safranina para realizar la contratinción. Al cabo de 1 ó 2 minutos se vierte el colorante, el preparado se lava con agua, se seca con papel de filtro.
6. Observe al microscopio la tinción utilizando el lente de inmersión. Localice las bacterias y determine al tipo que pertenecen.

EXPERIMENTO # 2:

OBSERVACION DE CELULAS EUCARIOTAS ANIMALES Y VEGETALES.

MATERIALES Y REACTIVOS.

• Suspensión de células de mieloma o hibridomas murinos.
• Tejido vegetal como fuente de células para su observación.
• Solución acuosa de Azul tripán al 1%
• Portaobjetos, cuchillas, pipetas, microscopio.

PROCEDIMIENTO:

1. Con la ayuda de una cuchilla realice un corte al tejido vegetal de forma longitudinal y extraiga una muestra lo más fina posible. Colóquela en un portaobjetos y observe al microscopio utilizando diferentes aumentos de forma progresiva. Esquematice lo observado en un campo del microscopio.
2. Utilizando una pipeta extraiga una gota de la suspensión celular de mielomas o hibridomas y deposítela en un portaobjeto. Observe al microscopio utilizando distintos aumentos crecientes e identifique las formas y tamaños de las células, en comparación con las vegetales observadas anteriormente. Esquematice lo observado en un campo del microscopio.

   REPORTE DE LABORATORIO.

   Experimento # 1: Observación de células procariotas. Tinción de Gram.

   1.¿ Por qué es necesario observar las bacterias utilizando métodos de coloración y el lente de inmersión en microscopía óptica?

   2. Anexe el dibujo del campo observado por usted al realizar la coloración de Gram a la suspensión bacteriana. ¿De qué color aparecen teñidas las bacterias?

   3. Identifique el tipo de bacteria observado en el cultivo (según su reacción a la tinción de Gram) y explique por qué se observa de ese color

   Experimento # 2: Observación de células eucariotas animales y vegetales.

   1. Anexe los dibujos de los campos observados en cada uno de los pasos de la técnica de trabajo.

   2. Compare los rasgos característicos de las células vegetales y las células animales observadas.

3. Repita el procedimiento del paso anterior pero adicionando previamente a la gota de la suspensión celular otra gota del colorante Azul tripán. Observe al microscopio y determine cualitativamente la viabilidad del cultivo celular.
4. Valore cualitativamente la calidad del cultivo de células animales examinados basándose en la tinción de Azul tripán.

BIOQUIMICA.

PRACTICA DE LABORATORIO # 2.

CLOROPLASTOS Y PIGMENTOS FOTOSINTETICOS.

INTRODUCCION.

Uno de los procesos metabólicos más importantes de las células vegetales lo constituye la Fotosíntesis. Durante la fase luminosa de la misma es imprescindible la participación de diferentes pigmentos fotosintéticos que se encuentran dentro de los plastidios, y que le confieren la coloración característica de las hojas de las plantas. Los pigmentos de mayor importancia son las clorofilas: la clorofila A que tiene un color verde azulado, y la clorofila B de color verde amarillento. También son importantes los carotenoides, de color anaranjado-rojizo, y las xantofilas de color amarillo.

El surgimiento de los métodos cromatográficos está marcado precisamente por el estudio realizado por el científico ruso M.S.Tswett, quien en 1903 publicó un trabajo sobre la separación de pigmentos vegetales a través de una columna llena de un compuesto adsorbente (yeso, alúmina, almidón u otro) al aplicar un extracto de plantas preparado con solventes orgánicos (etanol, acetona, benceno, etc.). La separación de estos pigmentos se puede realizar también mediante cromatografía en capa fina o en papel, utilizando diferentes sistemas de solventes.

Bibliografía.

- Chechetkin, A.V. Prácticas del ganado y las aves de corral. Editorial Mir, 1984.

- Pequeño Pérez, J. Prácticas de Fisiología Vegetal. Editorial Pueblo y Educación, 1972.

- Gott, A Cromatografía en capa fina. ISPH, 1982.

PARTE EXPERIMENTAL

MATERIALES Y REACTIVOS.

• Microscopio óptico Hojas de Elodea
• Portaobjetos Hojas de plantas de diferentes
• Cubreobjetos Colores
• Mortero Acetona al 85% en agua
• Tubos de ensayo Etanol al 90%
• Papel cromatográfico
• Papel de filtro Espectrofotómetro

PARTE EXPERIMENTAL.

PROCEDIMIENTO:

Observación de cloroplastos en hojas de Elodea.

1. Coloque en un portaobjetos hojas de Elodea, y cúbralas con el cubreobjetos.
2. Coloque la preparación en la platina del microscopio óptico, y enfoque comenzando con el menor aumento, para observar los cloroplastos.
3. Dibuje un esquema de lo observado en el microscopio.

Extracción de pigmentos vegetales y separación cromatográfica.

1. Pese 2 gramos de hojas frescas (de un mismo color) desmenuzadas y tritúrelas en el mortero, añadiendo una pequeña cantidad de arena.

2. Añada poco a poco 5 ml del solvente orgánico seleccionado para la extracción (acetona al 85%, etanol al 90%, ó tolueno: acetona 4:1) para realizar la extracción de los pigmentos.

3. Filtre el extracto y recoja el filtrado que contiene los pigmentos. Anote su color.

4. Aplique sobre una tira de papel cromatográfico una alícuota del extracto obtenido a unos 2 ó 3 cm del borde inferior del papel, cuidando que la mancha de la solución no exceda del tamaño de 0,5 cm (proceda punteando poco a poco, dejando secar entre punteos).

5. Coloque la tira en la cámara cromatográfica, cuidando que el nivel de líquido no llegue al punto de aplicación de la solución de pigmentos. Deje ascender el solvente aproximadamente 10 cm.

6. Observe el desarrollo del cromatograma. Analice las zonas en que se han separado la mezcla de pigmentos vegetales contenidas en las hojas.

Extracción de pigmentos vegetales y separación cromatográfica.

1. Pese 2 gramos de hojas frescas (de un mismo color) desmenuzadas y tritúrelas en el mortero, añadiendo una pequeña cantidad de arena.
2. Añada poco a poco 5 ml del solvente orgánico seleccionado para la extracción (acetona al 85%, etanol al 90%, ó tolueno: acetona 4:1) para realizar la extracción de los pigmentos.
3. Filtre el extracto y recoja el filtrado que contiene los pigmentos. Anote su color.
4. Aplique sobre una tira de papel cromatográfico una alícuota del extracto obtenido a unos 2 ó 3 cm del borde inferior del papel, cuidando que la mancha de la solución no exceda del tamaño de 0,5 cm (proceda punteando poco a poco, dejando secar entre punteos).
5. Coloque la tira en la cámara cromatográfica, cuidando que el nivel de líquido no llegue al punto de aplicación de la solución de pigmentos. Deje ascender el solvente aproximadamente 10 cm.
6. Observe el desarrollo del cromatograma. Analice las zonas en que se han separado la mezcla de pigmentos vegetales contenidas en las hojas.

Espectro de absorción de los pigmentos.

1. Extraiga con el solvente seleccionado los pigmentos separados. Para ello recorte la zona de la tira de papel cromatográfico deseada y colóquela en un tubo de ensayos que contiene 2 ml del solvente.
2. Coloque en el espectrofotómetro visible un tubo blanco con una muestra del solvente utilizado, y seleccione la longitud de onda de 400 nm. Ajuste la lectura a 0 de absorbancia con el blanco.
3. Coloque en el espectrofotómetro el tubo con la solución del pigmento y lea su absorbancia. Si el extracto está muy concentrado, dilúyalo con el mismo solvente hasta que el valor de absorbancia se encuentre entre 0,05 y 0,1.
4. Realice el espectro de absorción del pigmento dado, leyendo los valores de absorbancia registrados en el equipo al ir variando la longitud de onda utilizada en 10 unidades cada vez, hasta llegar a 700 nm. Tenga cuidado de ajustar con el blanco antes de cada lectura.
5. Realice un gráfico de absorbancia (en el eje ordenado) contra longitud de onda utilizada (en el eje de abscisas) para cada uno de los pigmentos. Compare los máximos de absorción obtenidos para cada uno.

REPORTE DE LABORATORIO.

1. Represente esquemáticamente lo observado al microscopio. ¿Qué conclusiones puede dar sobre el número y la ubicación de los pigmentos dentro de las células de Elodea examinadas?

2. Dibuje un esquema del cromatograma y analice el cromatograma obtenido. Identifique, atendiendo a su coloración, los diferentes pigmentos separados por este método. ¿Por qué la extracción no se realiza con agua? (Anexe el cromatograma obtenido por su equipo)

3. Realice los gráficos de Absorbancia contra longitud de onda para cada uno de los pigmentos analizados. Señale los máximos de absorbancia para cada pigmento y relaciónelos con el color característico de los mismos.

¿Qué papel juega la presencia de diferentes pigmentos captadores de energía luminosa, además de las clorofilas, en los fotosistemas del cloroplasto?

BIOQUIMICA.

PRACTICA DE LABORATORIO # 3.

ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD DE LAS PEROXIDASAS.

INTRODUCCIÓN.

Un numeroso grupo de enzimas oxidorreductasas pueden transferir directamente el hidrógeno separado de diferentes sustratos al oxígeno molecular, obteniéndose como resultado peróxido de hidrógeno. Este compuesto constituye un tóxico poderoso para las células, razón por la cuál tienen necesidad de eliminarlo, disponiendo para ello de otras oxidorreductasas entre las cuales se encuentran las peroxidasas.

Estas enzimas catalizan la oxidación de fenoles y otra gran cantidad de sustancias mediante la reducción del peróxido a agua, como ocurre con la hidroquinona, uno de sus posibles sus-tratos:

Para ver la fórmula seleccione la opción "Descargar" del menú superior

La quinona obtenida es un compuesto de color pardo cuya concentración es directamente proporcional a la absorbancia medida a 400 nm, la cual puede utilizarse como medida de su concentración. Además, la variación de la absorbancia con el tiempo se puede tomar como medida de la velocidad de la reacción.

En los vegetales la peroxidasa, con sus diferentes formas isoenzimáticas, parece estar relacionada con la oxidación de numerosos compuestos, proceso que tiene lugar con mayor intensidad durante la maduración de los frutos. Estas isoenzimas se encuentran en el interior de vacuolas celulares que pueden ser detectadas y localizadas histológicamente con sencillos ensayos de fijación del enzima en membranas de nitrocelulosa (blotting).

BIBLIOGRAFIA : BIOQUIMICA LEHNINGER, A. CAP. 8 Y 9

Chechetkin, A.V. Prácticas del ganado y las aves de corral. Editorial Mir, 1984.

- Pequeño Pérez, J. Prácticas de Fisiología Vegetal. Editorial Pueblo y Educación, 1972.

PARTE EXPERIMENTAL.

MATERIALES Y REACTIVOS

• pimientos en diferentes estados de maduración con sus pedúnculos
• disolución acuosa de hidroquinona al 0,5 % (recién preparada)
• disolución acuosa de diaminobencidina o m-fenilendiamina (recién preparada)
• disolución acuosa de peróxido de hidrógeno al 1,5 % (recién preparada)
• disolución acuosa de ácido sulfúrico 2 mol/L
• disoluciones buffer de pH 5,0; 6,0; 7,0; 8,0 y 9,0.
• membranas de nitrocelulosa 0,45 um
• portaobjetos
• cuchillas o bisturís

PROCEDIMIENTO:

Preparación del extracto enzimático de peroxidasa.

Prepare 20 ml de un extracto acuoso con 5 g de material vegetal.

Para ello tome de la masa del pimiento y utilice arena para triturar la misma. Se deja en reposo durante 10 min y luego se centrifuga a 4 500 rpm durante 5 minutos o se filtra. El filtrado obtenido se usará como extracto enzimático.

EXPERIMENTO # 1.ESTUDIO DEL pH ÓPTIMO DE ACCIÓN DE LA PEROXIDASA.

1. Debe conocerse cuál es el pH óptimo de trabajo de este enzima. Para ello prepare 4 tubos de ensayo y añada en ellos 1 ml de una disolución buffer de pH 5.0,7.0,8.0 y 9.0 respectivamente.
2. Añada a cada tubo 0.5 ml del extracto enzimático, 1 ml de hidroquinona y 2 ml de peróxido de hidrógeno.
3. Observe los tubos durante 20 minutos para determinar por los cambios de coloración cuál es el pH óptimo de la enzima.

EXPERIMENTO # 2.

LOCALIZACIÓN HISTOQUÍMICA DE LAS ISOENZIMAS DE PEROXIDASA EN PEDÚNCULOS DE PIMIENTOS.

1. La localización histoquímica de la peroxidasa en los pedúnculos de pimientos será estudiada imprimiendo una huella de un corte del tejido en membrana de nitrocelulosa. Para ello deposite cuidadosamente (sin tocar con los dedos) un pedazo de membrana seca sobre un portaobjetos.
2. Imprima sobre ella la huella de un corte de pedúnculo de pimiento realizado con ayuda de una cuchilla. Presione suavemente durante 30 segundos antes de remover el tejido y dejar secar nuevamente la membrana. Realice esta operación tres veces con muestras diferentes de tejido.
3. Una vez seco el pedazo de membrana, realice su revelado sumergiéndolo en una mezcla de solución de diaminobencidina, solución de peróxido de hidrógeno y el buffer elegido para la máxima actividad enzimática de la peroxidasa, según el ensayo anterior, durante l0 minutos.
4. Después de revelada, la membrana se lava con agua destilada y se seca finalmente al aire.

REPORTE DE LABORATORIO.

Experimento # 1.

- Informe cuál es el pH óptimo del enzima peroxidasa y explique por qué lo escogió.

Experimento # 2.

- Dibuje un esquema con lo observado en el blotting al pedúnculo de pimiento. Concluya sobre la localización del enzima en el corte de tejido analizado (interior cercano a la placenta, exterior cercano a la capa epidérmica o en todo el tejido).

- Si ha utilizado cortes de pimiento en diferentes estados de maduración concluya sobre la presencia del enzima en ellos.

BIOQUIMICA

PRACTICA DE LABORATORIO # 4.

ESTUDIO CINETICO DEL ENZIMA ALFA-AMILASA.

INTRODUCCION.

La cinética enzimática tiene por objeto el estudio de la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas, así como los factores que en ella influyen y los mecanismos por los cuales transcurren.

La velocidad de las reacciones enzimáticas se puede medir:

- por la cantidad de sustrato que desaparece en la unidad de tiempo

- por la cantidad de producto que aparece en la unidad de tiempo

En esta práctica de laboratorio se comprobará la influencia de la concentración del sustrato (S), del enzima (E), el pH y la temperatura (T) en la cinética del enzima alfa-Amilasa salival en su acción sobre los enlaces alfa 1-4 del almidón. Para ello nos basaremos en la desaparición del almidón en la unidad de tiempo mediante el seguimiento de la reacción de color que produce el mismo, así como sus productos de hidrólisis con el Iodo en disolución de Ioduro de potasio (Reactivo de Lugol).

Dado que el almidón está integrado por dos fracciones, la amilosa y la amilopectina, debe tenerse en cuenta las reacciones que ambas producen (así como sus respectivos productos de hidrólisis) con el reactivo de Lugol:

AMILOSA AMILOPECTINA

Amilasa Salival

AMILODEXTRINAS

(+IODO Color azul violeta)

ERITRODEXTRINAS

(+IODO Color rojo pardo)

|

MALTOSA + GLUCOSA DEXTRINAS LIMITES

(+IODO No dan coloración)

Basándonos en las reacciones anteriores podemos estudiar

Basándonos en las reacciones anteriores podemos estudiar el efecto que provocan en la cinética enzimática la variación de los factores que en ella influyen: c(S), c(E), pH y T, fundamentalmente. La influencia de la c(E) podremos estudiarla midiendo la velocidad de la reacción de la forma ya descrita pero utilizando diferentes c(E), manteniendo constante los demás factores. De forma similar se procede con el estudio de la influencia de la c(S). En el caso del estudio de la influencia del pH y la temperatura se ensayara la actividad del enzima a diferentes valores de ambos con la reacción del Lugol.

SUGERENCIA AL ESTUDIANTE:

Responda las siguientes preguntas (si es necesario consulte y busque en la bibliografía):

1.¿ Cuáles son las características estructurales del almidón?

2.¿ Qué tipo de enzima es la alfa-Amilasa salival?

3.¿ Cuáles son los productos que origina la acción de este enzima sobre el almidón?

4. Explique cómo influyen en la velocidad de las reacciones enzimáticas una variación en la concentración del enzima presente, en la concentración del sustrato, el pH y la temperatura.

BIBLIOGRAFIA.

Lehninger. Bioquímica. Págs. 270-272. y notas de clase.

REACTIVOS.

• Solución del enzima: Se prepara colectando 1 ml de saliva (previo enjuague de la boca con agua destilada) y diluyéndolo hasta 20 ml con agua destilada.
• Disolución de almidón al 0,5 %.
• Disolución de Lugol: Se prepara disolviendo 1 g de iodo, 2 g de KI en 200 ml de agua destilada.
• Disoluciones tampón de pH 5,0; 6,8 y 8,0.
• Tubos de ensayo, placa de porcelana con excavaduras, vasos de precipitado, baño de agua termostatado, cronómetro.

EXPERIMENTO # 1:

ESTUDIO DE LA INFLUENCIA DE c(E).

PROCEDIMIENTO:

1. Tome 4 tubos de ensayo y añada a cada uno 2 ml de disolución de almidón al 0,5 %.
2. Añada a cada tubo 0,1; 0,2; 0,3 y 0,4 ml de disolución del enzima respectivamente, y complete hasta un volumen de 0,5 ml con agua. Añada primero el agua y luego la disolución del enzima, pues de lo contrario la reacción comenzará a verificarse y usted no tendrá en cuenta el tiempo transcurrido. Inmediatamente después de adicionar la solución del enzima al último tubo ponga en marcha el cronómetro y comience a medir el tiempo del experimento.
3. En cada intervalo de 1 minuto ensaye en la placa con excavadura la reacción de la solución experimental con el Lugol: para ello sólo tiene que extraer con el gotero pequeñas cantidades de cada tubo de ensayo en reacción a una excavadura de la placa y luego adicionar una gota del reactivo de Lugol. Observe y anote el color para cada tiempo y cada tubo ensayados.
4. Determine por el procedimiento anterior el tiempo que tarda cada uno de los tubos en no dar reacción alguna con el reactivo de Lugol, la mezcla de las dos gotas debe quedarse del color original del Lugol. Si desea puede adicionar en una excavadura unas gotas de agua y Lugol para tenerlo como solución de control.
5. Con los datos obtenidos construya la siguiente tabla:

TUBOS 1 2 3 4

Volumen de enzima (ml)

Tiempo total de reacción (min)

Velocidad de la reacción (1/t)

6. Con estos datos construya un gráfico de c(E) en el eje ordenado contra velocidad de reacción (1/t) en el eje de abscisas.

EXPERIMENTO # 2: ESTUDIO DE LA INFLUENCIA DEL pH.

PROCEDIMIENTO:

1. En 3 tubos de ensayo vierta respectivamente 2 ml de las soluciones tampones de pH 5,0; 6,8 y 8,0.
2. Añada a cada tubo 2 ml de la solución del almidón al 0,5% y 2 ml de la solución del enzima. Incube a 40 grados Celsius y ensaye la reacción con el Lugol según se indica en el trabajo experimental # 1.
3. Con los datos obtenidos extraiga las conclusiones sobre el rango de pH en el cual el enzima muestra su actividad óptima.

EXPERIMENTO # 3: ESTUDIO DE LA INFLUENCIA DE c(S).

PROCEDIMIENTO:

1. Tome 4 tubos de ensayo y añada a cada uno 0,5; 1,0; 1,5 y 2,0 ml de solución de almidón. Complete el volumen de cada tubo hasta 2,0 ml con agua destilada.
2. Adicione a cada tubo 0,5 ml de disolución del enzima Alfa amilasa e incúbelos a 40 grados Celsius.
3. A intervalos de 1 minuto ensaye la presencia de almidón mediante la reacción con Lugol de forma similar a como se describe en el trabajo experimental # 1.

   TUBOS 1 2 3 4

   Volumen de sustrato (ml)

   Tiempo total de reacción (min)

   Velocidad de reacción (volumen / tiempo)

4. Con los datos obtenidos construya la siguiente tabla:
5. Con los datos de la tabla construya un gráfico de velocidad de reacción (volumen / tiempo) en el eje ordenado contra volumen de sustrato en el eje de abscisas (que representa concentración de sustrato creciente en nuestro experimento).

EXPERIMENTO # 4: ESTUDIO DE LA INFLUENCIA DE LA TEMPERA TURA.

PROCEDIMIENTO:

1. En 5 tubos de ensayo añada 5 ml de disolución de almidón al 0,5% y 1 ml de solución de enzima.
2. Hierva durante 5 min y reponga el volumen de agua perdida por evaporación en uno de los tubos. Incúbelo a 40 grados Celsius y ensaye de la forma estudiada la presencia de almidón en él a diferentes intervalos de tiempo.
3. Incube un segundo tubo a 40 grados Celsius y un tercero a 50 grados Celsius, y ensaye en ellos la reacción con Lugol a intervalos de 1 minuto. Anote el tiempo que se demora en desaparecer la coloración azul.
4. Un cuarto tupo incúbelo en un baño de hielo y ensaye también la reacción con Lugol.
5. El último tubo déjelo a temperatura ambiente del laboratorio y ensaye con el Lugol hasta la desaparición de la reacción positiva en intervalos de 1 minuto.
6. Con los datos obtenidos en el ensayo complete la siguiente tabla, y extraiga sus conclusiones:

Color observado a diferentes tiempos (min)

5 10 15 20 25 30

Tubos

1

2

3

4

5

REPORTE DE LABORATORIO.

Experimento # 1: Estudio de la influencia de la concentración del enzima.

1. Describa qué características estructurales del almidón permiten su identificación mediante las disoluciones de yodo, y el efecto de la amilasa salival sobre los enlaces del almidón.

2. Anexe la tabla y el gráfico de velocidad de reacción contra c(E), tomando como concentración del enzima el volumen de la solución utilizado en cada tubo. ¿Por qué se puede tomar como velocidad de reacción el inverso del tiempo?

3. Plantee las conclusiones a que puede arribar de los resultados del experimento.

4. Resuma las dificultades encontradas en el ensayo.

Experimento # 2: Estudio de la influencia del pH.

1. Describa lo observado al realizar el estudio de la influencia del pH en la velocidad de reacción del enzima alfa-Amilasa. ¿A qué conclusión llega acerca del pH óptimo de este enzima?

2.¿ Qué efecto tendría la utilización del medio con pH muy ácido o muy básico en la realización de este ensayo?

Experimento # 3: Estudio de la influencia de la concentración del sustrato.

1. Anexe la tabla y el gráfico elaborados según las indicaciones del trabajo práctico, tomando como valor de c(S) el del volumen del mismo medido en cada tubo. ¿Por qué en este caso para calcular la velocidad de la reacción es necesario dividir el volumen de sustrato entre el tiempo?

2. Analice el gráfico y plantee las conclusiones a que puede llegaren este caso.

3. Describa las dificultades presentadas en este ensayo.

Experimento # 4: Estudio de la influencia de la temperatura.

1. Anexe la tabla resumen de los resultados del experimento según las indicaciones del trabajo práctico.

2. Explique qué le sucede al enzima del tubo que se hierve antes de incubarlo a 40 grados Celsius.

3. Plantee las conclusiones a que pudo arribar en este ensayo. ¿Por qué no se debe emplear el término de temperatura óptima?

BIOQUÍMICA

PRACTICA DE LABORATORIO # 5.

ACCION HIDROLITICA DE LAS AMILASAS DE SEMILLAS DE GRAMINEAS

INTRODUCCION

Las fuentes más importantes como materia prima para la obtención de energía son los polisacáridos, el almidón y el glucógeno. En los vegetales el almidón constituye el polisacárido de reserva más abundante, sintetizándose en los cloroplastos de las células fotosintéticas y en los amiloplastos de las células del parénquima de almacenamiento.

El camino típico para la movilización del almidón de reserva es a través de la actividad hidrolítica de las alfa y beta amilasas, cuya acción conduce a la formación de maltosa. El desdoblamiento de la maltosa hasta glucosa está a cargo de la maltasa, que se encuentra junto con las amilasas.

Las amilasas pueden extraerse de los granos de cereales en germinación mediante maceración con agua. Su acción hidrolítica puede seguirse mediante los reactivos de Lugol y de Fehling.

BIBLIOGRAFIA PARA LA AUTO PREPARACIÓN:

LEHNINGER. ALBERT. BIOQUIMICA. Capítulos 8 Y 10 Páginas 189, 270 - 272.

PARTE EXPERIMENTAL

REACTIVOS:

- Semillas de gramíneas en germinación

- Mortero.

- Cristalería.

- Termostato.

- Reactivos de Lugol, Fehling, Tollens y Benedict.

- Mechero.

PROCEDIMIENTO:

1. Prepare 30 mL de un macerado acuoso con 10 g de semillas de gramíneas germinadas teniendo en cuenta que el agua debe estar caliente (50 grados). Añada 5 gotas de glicerina para extraer lo más posible los enzimas.
2. Deje reposar de 15 - 20 minutos de 30 - 45 grados Celsius y filtre el extracto.
3. En un tubo de ensayo, introduzca 5 ml de disolución de almidón y de 1 - 2 ml del extracto. A intervalos de 5 minutos, comprobar la degradación del almidón por las amilasas ensayando una muestra del sistema de reacción en una placa con excavaduras con el reactivo de Lugol. Para reconocer la presencia de azúcares reductores (maltosa y glucosa), realizar la reacción con los reactivos de Fehling, Tollens o Benedict de una muestra de 1 - 2 ml del sistema de reacción.

REPORTE DE LABORATORIO

1- Represente a través de una ecuación la acción hidrolítica de las amilasas del almidón (amilosa).

Nota : Utilice las estructuras químicas.

2- Clasifique las amilasas de acuerdo con el Sistema Internacional.

3-¿ Qué objetivo persigue realizar la reacción con el reactivo de Lugol cada cierto intervalo de tiempo?

4-¿ Qué objetivo persigue realizar al final del experimento la reacción con el reactivo de Fehling? Represente la ecuación.

BIOQUÍMICA

PRACTICA DE LABORATORIO # 6.

ACCION HIDROLITICA DE LAS LIPASAS DE SEMILLAS DE OLEAGINOSAS

INTRODUCCION

Las grasas, al igual que el almidón son sustancias de reserva de las plantas y se almacenan principalmente en las semillas.

Cerca del 20 % de las plantas contienen grasas en las semillas como principal sustancia de reserva. Entre estas se encuentran el girasol, maní, palmiche, soja, en las cuales puede acumularse del 20 al 60 % del peso seco.

Para su utilización como fuente de energía, los mismos deben experimentar hidrólisis por acción de las lipasas presentes en las semillas por cuya acción se convierten en ácidos grasos y glicerol, siendo su pH óptimo entre 4,7 y 5,0.

H 2 O

triacilglicérido ácido graso + glicerol

lipasa

La actividad de las lipasas se puede determinar por la valoración con alcohol de los ácidos grasos producidos.

BIBLIOGRAFIA PARA LA AUTO PREPARACIÓN:

LEHNINGER. ALBERT A. BIOQUIMICA.

PARTE EXPERIMENTAL

Represente mediante una ecuación química la hidrólisis de los triacilglicéridos.

REACTIVOS:

• Semillas de higuereta, maní o soja.
• HAc 0,1 mol/L.
• Etanol.
• NaOH 0,1 mol/L.
• Fenolftaleína.
• Cristalería.

PROCEDIMIENTO:

1. Disponga de tres frascos Erlenmeyer numerados e introduzca en cada uno 3 g de semillas oleaginosas desprovistas de sus cubiertas y trituradas. Añada a cada uno 10 ml de agua destilada.
2. En el frasco 1 añada 2 ml de HAc 0,1 mol/L. En el frasco 2 hierva su contenido durante 5 minutos y luego agregue 2 ml de HAc.
3. Para eliminar los procesos de putrefacción añada 2 gotas de tolueno en los tres frascos, tape y coloque en un termostato a 35 - 37 grados hasta el día siguiente.

4. Al día siguiente añada a cada frasco 10 ml de etanol para eliminar la disociación hidrolítica del jabón que se forma durante la valoración y en el frasco 3 agregue 2 ml de HAc 0,1 mol/L para igualar las condiciones del ensayo.
5. Valore con NaOH 0,1 mol/L los ácidos grasos producidos en los tres frascos por acción de las lipasas. Anote el volumen gastado en cada caso y analice lo ocurrido.

REPORTE DE LABORATORIO:

BIOQUIMICA

PRACTICA DE LABORATORIO # 7

REACCIONES DE TRANSAMINACION

INTRODUCCIÓN

La reacción de transaminación es probablemente una de las más difundidas en el metabolismo de los aminoácidos, su descubrimiento se debe a los científicos Braunstein y Kritzmann en el año 1938.

En esta reacción el grupo alfa-amino de un aminoácido es transferido al átomo de carbono alfa de un alfa cetoácido, dando lugar al correspondiente alfa cetoácido análogo al aminoácido y el aminoácido análogo al cetoácido correspondiente.

Se conocen un gran número de transaminasas. En la práctica de laboratorio se comprobará la transaminasa glutámico - pirúvica (GAT), la que cataliza la siguiente reacción:

O

_ _ _

OOC- (CH 2) 2- CH-COO + H 3 C-C-COO

NH 3 +

glutamato l piruvato

/

H

_ _ _

OOC- CH 2-CH 2 - C - COO + H 3 C- C - COO

O NH 3 +

alfacetoglutarato alanina

En la práctica el arsenito de sodio se utilizará para evitar la descarboxilación oxidativa del piruvato. El ácido tricloroacético y el etanol actúan como agentes desnaturalizantes.

BIBLIOGRAFIA: LEHNINGER. ALBERT L. BIOQUIMICA. CAP 21. págs 574-577.

MATERIALES Y REACTIVOS:

• Arsenito de sodio 0,1 mol/L.
• Buffer fosfato pH = 7,4.
• Alanina 0,01 mol/L.
• Ninhidrina 0,2 % en etanol al 95 %.
• Glutamato de sodio 0,2 mol/L y 0,01 mol/L.
• Alfacetoglutarato 0,01 mol/L.
• Solución semisaturada de 2,4 dinitrofenilhidracina en HCL 0,1 mol/L.
• Solvente para cromatografía de cetoácidos:
• 7 ml de N-Butanol.
• 2 ml de NH4OH.
• 1 ml de Etanol.
• Solvente para cromatografía de aminoácidos:

Fenol-agua 80 %.

PROCEDIMIENTO:

OBTENCIÓN DE LOS EXTRACTOS DE ENZIMAS:

1- Prepare un extracto de hígado en la proporción 1:5 en masa volumen con buffer fosfato pH 7,4. Utilice baño de hielo para realizar la operación.

2- Centrifugue a 2500 rpm durante tres minutos o filtre a través de una gasa doble o algodón.

3- Guarde el sobrenadante en un tubo sumergido en baño de hielo y rotúrelo como extracto de hígado (E.H-1).

4- Tome la mitad del extracto y páselo a un tubo y colóquelo en un baño de agua hirviendo durante 5 minutos. Rotúrelo como extracto de hígado calentado (E.H.C-2).

DESARROLLO DE LA REACCION:

Con los extractos anteriores prepare dos tubos de ensayo de la siguiente forma:

 Tubo 1 Tubo 2

______________________________________________________________

Arsenito de sodio 0,1 mol/L. 0,2 0,2

Glutamato de sodio 0,2 mol/L. 0,15 0,15

Piruvato de sodio 0,2 mol/L. 0,15 0,15

Extracto de hígado (1). 0,5 -

Extracto de hígado calentado (2). - 0,5

________________________________________________________________

1. Incube los tubos a 37 grados durante 30 minutos para el transcurso de la reacción.
2. Una vez transcurrido el tiempo añádale 4 ml de etanol a cada tubo.
3. Centrifugue a 2500 rpm durante 3 minutos. Guarde el sobrenadante para su identificación cromatográfica.

CROMATOGRAFIA DE AMINOACIDOS:

1. Prepare el papel cromatográfico y aplique con un capilar las muestras del tubo 1 y 2 y los patrones de ácido glutámico y alanina, identificando a cada una en el borde superior del papel.
2. Coloque el papel en la cámara cromatográfica y deje correr la cromatografía hasta una altura de 5 cm como mínimo.
3. Extraiga el papel y séquelo al aire. Rosee el mismo con ninhidrina y colóquelo en la estufa hasta la aparición de las manchas.
4. Calcule los Rf de las muestras y patrones y analice comparativamente los resultados de los tubos 1 y 2.

CROMATOGRAFIA DE CETOACIDOS:

1. Primeramente se formarán las dinitrofenilhidrazonas de los cetoácidos y luego se realizará la cromatografía.

   1 2 3 4

   ________________________________________________________________

   Disolución de

   2,4 dinitrofenilhidracina. 0,1 0,1 0,1 0,1

   Sobrenadante del tubo 1. 0,1 - - -

   Sobrenadante del tubo 2. - 0,1 - -

   Piruvato 0,2 mol/L - - 0,1 -

   alfa-cetoglutarato 0,2 mol/L. - - - 0,1

   ________________________________________________________________

   Deje en reposo 10 minutos para que transcurra la reacción.

   Aplique en el papel cromatográfico los sobrenadantes de los cuatro tubos anteriores, identificándolos adecuadamente.

   Coloque el cromatograma en la cámara y déjelo correr hasta una altura de 5 cm como mínimo.

   Extraiga el papel y séquelo al aire.

   Calcule los Rf de las muestras y patrones y analice comparativamente los resultados

   REPORTE DE LABORATORIO

   1- Calcule los Rf de los aminoácidos patrones y muestras e identifique los que están presentes en las muestras.

   2- Calcule los Rf de los cetoácidos, identifique los que están presentes en las muestras.

2. Para formar las dinitrofenilhidrazonas prepare cuatro tubos de ensayo de la siguiente forma:
3. Haga un análisis de los resultados comparando los resultados de los tubos 1 y 2 y llegando a conclusiones acerca de los productos obtenidos en la reacción de transaminación.

BIOQUIMICA

PRACTICA DE LABORATORIO # 8

RESPIRACION EN CELULAS VEGETALES

La respiración, proceso metabólico mediante el cuál los organismos aerobios obtienen energía, consta de tres fases:

-ciclo de Krebs, -cadena respiratoria, -fosforilación oxidativa

Durante la misma se produce la formación de dióxido de carbono, agua y parte de la energía liberada se utiliza para la formación de ATP.

Este proceso se alimenta de un importante metabolito, la AcetilCoenzima A, compuesto que puede proceder de la degradación de sacáridos, lípidos y proteínas. Dentro de los glúcidos se destaca el almidón por su abundancia.

El proceso respiratorio es contínuo en todas las células aerobias y en los vegetales se lleva a cabo tanto en raíces como en tallos, hojas, flores y semillas. Estas últimas constituyen un importante reservorio de sustancias oxidables entre las que se destacan el almidón y las grasas.

Cuando las semillas germinan, degradan una importante parte de estas sustancias. El almidón se convierte por la acción de la amilasa y las diastasas en glucosa la cuál se degrada por la combinación de la glucólisis y la respiración hasta dióxido de carbono y agua.

La producción de dióxido de carbono se puede cuantificar mediante su reacción con hidróxido de bario según la ecuación:

Ba(OH) 2 + CO 2 BaCO 3 + H 2 O

El exceso de hidróxido de bario se titula con ácido oxálico y de esta forma se puede calcular la intensidad respiratoria de las semillas.

PARTE EXPERIMENTAL

REACTIVOS:

• semillas germinadas de gramínea
• erlenmeyers de 250 ml y bolsa de tela metálica
• disolución de Ba(OH)2 c(n/z*) 0.1 mol/l
• disolución de Ácido Oxálico c(n/z*) 0.1 mol/l
• disolución de fenolftaleína

PROCEDIMIENTO:

I- COMPROBACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE CO2 DURANTE LA RESPIRACIÓN.

2. En una bolsa de tela metálica se colocan de 5 a 10 g de semillas germinadas y se cuelgan del gancho del tapón como aparece en la figura
3. Anote la masa de semilla pesadas en una balanza técnica y denótelo como "c".
4. En el erlenmeyer se introducen 25 ml de la disolución de Ba(OH)2 y se tapa con el tapón en que están colocadas las semillas germinadas. Se dejan en el puesto de trabajo durante una hora. Periódicamente se agita el mismo para facilitar la reacción del CO2 desprendido.
5. Paralelamente se prepara otro erlenmeyer que contenga 25 ml de Ba(OH)2 y se tapa, el cuál se utilizará como testigo.
6. Después de transcurrida la hora se valoran los dos erlenmeyers con Ácido Oxálico previa adición de 2 ó 3 gotas de fenolftaleína.
7. Anote los volúmenes de ácido consumido en la valoración del erlenmeyer que contenía las semillas (b) y en el erlenmeyer testigo (a).

II-COMPROBACIÓN DE LA DEGRADACIÓN DEL ALMIDÓN EN LASA SEMILLAS EN GERMINACIÓN.

REACTIVOS:

• gramíneas germinadas y sin germinar
• reactivos para la identificación de almidón
• reactivos para la identificación de sacáridos reductores

1. Prepare 30 ml de extractos acuosos de semillas germinadas y sin germinar por separado.
2. Ensaye la presencia de almidón en ambos extractos utilizando el método conocido anteriormente en la asignatura de Bioorgánica.
3. Puede remitirse a la bibliografía orientada.
4. Anote los resultados obtenidos.
5. Ensaye la presencia de sacáridos reductores en ambos extractos de semillas utilizando métodos conocidos anteriormente. Puede remitirse a la bibliografía orientada.
6. Anote los resultados obtenidos.

REPORTE DE LABORATORIO

I- Realice el cálculo de la intensidad respiratoria teniendo en cuenta los datos obtenidos del experimento.

a = ml de ácido oxálico consumidos en la valoración del frasco testigo (sin semillas)

b = ml de ácido oxálico consumidos en la valoración del frasco con las semillas

c = masa de semillas (gramos)

X = Intensidad respiratoria. mg de dióxido de carbono desprendido por gramo de semilla

2,2 (a - b)

X = ----------------

c

2,2 = 1 ml de ácido oxálico c(x/z*) 0,1 mol/l equivale a 2,2 mg de dióxido de carbono desprendido

Explique en que etapas de la respiración se forma el Dióxido de carbono desprendido.

II- Elabore una tabla donde aparezcan los resultados obtenidos en la identificación del almidón y los sacáridos reductores en los extractos de semillas germinadas y sin germinar.

Analice comparativamente los resultados obtenidos para ambos extractos y justifique los mismos.

Proponga un esquema resumen que integre la explicación de lo observado en los experimentos I y II.

BIBLIOGRAFIA

• Brewster, R.Q..Curso práctico de Química Orgánica . 2da edición . Editorial MIR . Moscú 1977.
• Chechetkin, A.V.; Voronianski V.I.; Pokusay, G.G..Práctcas de Bioquímica del ganado y aves de corral. Editorial MIR. Moscú 1984.
• Lehninger, A.. Bioquímica . Editorial Pueblo y Educación . La Habana . 1985.
• Pequeño Pérez , J. Prácticas de Fisiología Vegetal . Editorial Pueblo y Educación , La Habana 1972.

 

Autores

M Sc. Tamahara Fernández Iglesias

Dr C. Armando Roca Serrano

M Sc. Maritza Ulloa Román

M Sc. Pablo Bahr Valcárcel

2002