Aspectos bioquímicos de la fitohemaglutinina. Aplicaciones en terapéutica médica
- Fitohemaglutinina. Propiedades
biológicas. Características
estructurales - Localización y
función de la fitohemaglutinina en la
planta - Genética y
biosíntesis de la fitohemaglutinina - Bases estructurales del
reconocimiento e interacción de la fitohemaglutinina con
los carbohidratos - Aplicaciones prácticas
de la fitohemaglutinina - Potencialidades
terapéuticas de la fitohemaglutinina - Efecto inmunomodulador de la
fitohemaglutinina - Posibles beneficios del uso de la
fitohemaglutinina en algunas afecciones
específicas - Conclusiones
- Referencias
bibliográficas
Desde hace algún tiempo existe
la certeza, al menos teórica, de que algunos
mitógenos derivados de plantas
podrían actuar sobre el sistema
inmunológico modulando su respuesta (Wimer, 1996, 1998).
Estos mitógenos pertenecen a las lectinas, una clase de
proteínas bastante heterogéneas en
cuanto estructura
cuaternaria, que poseen como rasgos comunes la capacidad para
unirse específica y reversiblemente a determinados
carbohidratos
y la posibilidad de aglutinar células.
Algunas pueden ser agrupadas en familias sobre la base de
determinadas características. Así aparecen, por
ejemplo, las lectinas de las legumbres o los cereales,
estructuralmente bastante parecidas a las lectinas tipo C
(Ca2+ dependientes) de los animales y que
contienen dominios homólogos de reconocimiento a
carbohidratos (Sharon, 1993).
Dentro de las fitolectinas o lectinas de las legumbres o
los cereales, que como familia muchas de
ellas comparten también la propiedad de
inducir mitosis en
algunos tipos de células; se encuentra la lectina de la
semilla del guisante, la lectina de la lenteja, la aglutinina del
frijol de soya, la aglutinina del germen del trigo, el
mitógeno de la hierba carmín, la aglutinina del
maní, la concanavalina A y la fitohemaglutinina (PHA,
siglas en inglés), entre otras (Sharon, Lis &
Lotan, 1974). De todas ellas una de las más estudiadas y
una de las que mayor interés
despierta en investigaciones
es la fitohemaglutinina por la amplia gama de aplicaciones que se
le atribuyen.
FITOHEMAGLUTININA.
PROPIEDADES BIOLÓGICAS. CARACTERÍSTICAS
ESTRUCTURALES.
La PHA integra la fracción proteica de las
semillas del frijol colorado común Phaseolus vulgaris,
aglutina tanto hematíes como leucocitos, se une a
determinados oligosacáridos y estimula la mitosis en
diferentes estirpes celulares, dentro de ellas los linfocitos
(Hamelryck et al, 1996). Es la lectina más abundante en
estas semillas, donde alcanza entre el 5 y el 10% del contenido
proteico total (Staswick & Chrispeels, 1984) y comprende
cinco glicoproteínas tetraméricas (isolectinas)
(PM=115000±4130 D, por ultracentrifugación), muy
estables sobre todo en medio ácido (Biswas & Kayastha,
2004) y formadas por dos polipéptidos (L=leucocito y
E=hematíe) (Leavitt, Felsted & Bachur, 1977) en las
combinaciones (L4, L3E1,
L2E2, L1E3,
E4) (Hamelryck et al, 1996). Las subunidades E
(PM=31700±600 D) son responsables de la
eritroaglutinación, pero muestran poca o ninguna actividad
mitogénica, mientras que las subunidades L
(PM=29900±200 D) confieren propiedades leucoaglutinantes a
la proteína nativa y tienen la máxima actividad
estimulante de la mitosis (Felsted, Leavitt, Chen & Bachur,
1981; Monsigny, Jeune-Chung & Perrodon, 1978).
Las dos subunidades difieren en la secuencia de
aminoácidos desde el residuo 1 al 7, pero son
idénticas en las posiciones 8 a la 24. Los residuos 12 y
60 de cada subunidad son una asparagina glicosilada con igual
composición en. Los últimos tres residuos de las
subunidades son también semejantes (Millar, Hsu,
Heinrikson & Yachnin, 1975).
Las isolectinas tienen una composición
aminoacídica muy semejante; sólo difieren en los
aminoácidos treonina, lisina y arginina y carecen de
aminoácidos azufrados (Leavitt et al, 1977). Los
oligosacáridos presentes en la proteína tienen un
alto contenido de manosa (4 %) y N-acetil-D-glucosamina (2,2 %)
(digestión con a -manosidasa y endo-b -N-acetilglucosaminidasa H). Aparecen
también otros carbohidratos como fucosa y xilosa (Staswick
& Chrispeels, 1984; Vitale, Ceriotti, Bollini &
Chrispeels, 1984).
En todas las lectinas derivadas de
plantas existen dos iones metálicos por monómero
(un ión Ca2+ y un ión de un metal de
transición, fundamentalmente Mn2+) situados en
la vecindad del sitio de unión a los carbohidratos. La PHA
posee estos mismos iones y su presencia es esencial tanto para la
unión a los carbohidratos como para la mitogenicidad de la
proteína. Los dos iones metálicos están
ligados por cuatro moléculas de agua y seis
residuos de aminoácidos (una histidina, un
glutámico, una asparagina, dos aspártico
y un residuo hidrofóbico) (Hamelryck et al,
1996).
Además del sitio de unión a los
carbohidratos, un grupo de
lectinas, dentro de ellas también la PHA, poseen sitios
hidrofóbicos de unión, que pueden ser divididos en
tres grupos. El
primero está adyacente al sitio de unión a los
carbohidratos y es el responsable de la afinidad 10 veces mayor
de estas lectinas por los monosacáridos que contienen
sustituyentes hidrofóbicos, que por aquellos que no los
poseen. El segundo, situado a una distancia aproximada de 30
Å del sitio de unión a los azúcares, tiene
una baja afinidad por los ligandos hidrofóbicos. Y el
tercero es un sitio de alta afinidad por la adenina y sus
derivados N-6 (incluidas un número de hormonas
derivadas de adenina, presentes en las plantas) (Hamelryck et al,
1996).
LOCALIZACIÓN Y
FUNCIÓN DE LA FITOHEMAGLUTININA EN LA
PLANTA.
La PHA se acumula, sobre todo, en las vacuolas de
almacenamiento
del parénquima de los cotiledones de las semillas, pero
también se concentra en las raíces de la planta,
específicamente en las vacuolas de los meristemas de las
raíces primarias y en las paredes celulares de las
raíces elongadas. Mediante PCR reversotranscriptasa se ha
demostrado la existencia casi exclusiva de ARNm de la isoforma
PHA-E en estos últimos sitios (Chrispeels,
1995).
Se presume que la PHA junto con la arcelina y el
inhibidor de la a
amilasa participa en mecanismos de defensa en la planta.
Estas últimas dos proteínas son consideradas formas
truncadas de la PHA en las cuales se han perdido, una y dos de
las vueltas o lazos necesarios para unirse a carbohidratos,
respectivamente, aboliendo de ellas esta propiedad (Hamelryck et
al, 1996; Mirkov et al, 1994).
La PHA actúa protegiendo las semillas contra
virus,
bacterias,
hongos y
herbívoros invertebrados, papel determinado en gran
medida, por la capacidad de reconocer y unirse a glicanos
extraños a la planta (Peumans & Damme, 1995; Rudiger,
1998).
GENÉTICA Y
BIOSÍNTESIS DE LA
FITOHEMAGLUTININA.
Las subunidades E y L son miembros de una familia de
cuatro polipéptidos codificados por igual número de
genes estrechamente relacionados y a los que se hace referencia
como familia de la PHA del frijol. Esta familia, además de
la PHA-E y la PHA-L, también contiene a la arcelina y al
inhibidor de la a
amilasa (Hamelryck et al, 1996).
Durante el desarrollo de
las semillas, no todas las variedades de Phaseolus vulgaris,
sintetizan PHA en la misma proporción. Se han encontrado
reducidos niveles de ARNm para PHA en aquellas plantas que
producen la proteína en menor medida (Staswick &
Chrispeels, 1984). Se responsabiliza de este hecho a la presencia
de codones de terminación prematuros que desestabilizan el
ARNm. Estos ARNms desestabilizados son reconocidos y
rápidamente degradados como mecanismo que le evita a la
planta la producción de moléculas de
proteína truncadas, hipo o afuncionales. La
desestabilización es dependiente de la posición de
los codones sin sentido. Hay indicios de que los transcriptos con
codones sin sentido situados en aproximadamente el 20, el 40
ó el 60 % de la secuencia a lo largo de la región
codificante normal, producen ARNms altamente inestables, mientras
que un transcripto con un codón sin sentido al 80 % es tan
estable como el tipo salvaje (van Hoof & Green,
1996).
En la biosíntesis los glicopéptidos sufren
modificaciones tanto cotraduccionales como postraduccionales. Los
polipéptidos se sintetizan mediante polisomas unidos al
retículo endoplásmico. La glicosilación va
sucediendo al mismo tiempo de la traducción y en este proceso cada
cadena polipeptídica adquiere las dos cadenas laterales de
oligosacáridos. La de la posición asparagina 12
tiene un alto contenido de manosa, mientras que la de la
asparagina 60 contiene mucho menos manosa pero adicionalmente
posee fucosa y xilosa (Faye, Sturm, Bollini, Vitale &
Chrispeels, 1986).
El transporte de
la proteína hacia las vacuolas de almacenamiento es
mediado por el aparato de Golgi, donde al menos una
porción de las cadenas de oligosacáridos sufre
modificaciones. Estas modificaciones producen un gradual
acortamiento de las cadenas de carbohidratos hasta alcanzar el
pequeño tamaño que tienen cuando ya las
glicoproteínas están en las vacuolas (Vitale et al,
1984).
Se ha llegado a la conclusión de que las dos
cadenas de carbohidratos adicionadas a los residuos 12 y 60
tienen un alto contenido de manosa cuando son recién
sintetizadas; pero la unida a la posición 60 es la que
sufre fundamentalmente las transformaciones, lo cual puede
deberse a que las enzimas
responsables de este proceso tienen un mayor acceso a esta cadena
que a la de la posición 12 (Faye et al, 1986). La
importancia biológica de este procesamiento no está
muy clara, aunque sí se conoce que no está
relacionado con las señales
que marcan a la molécula como una proteína
vacuolar, sino que tal información está contenida en el
dominio
polipeptídico de la proteína (Voelker, Herman &
Chrispeels, 1989), entre los residuos 14 y 23 de la PHA madura,
más específicamente cerca de la posición 19.
No se descarta la posibilidad de un segundo dominio que puede
funcionar conjuntamente con el primero para un correcto marcaje
de la proteína (Tague, Dickinson & Chrispeels,
1990).
BASES ESTRUCTURALES
DEL RECONOCIMIENTO E INTERACCIÓN DE LA FITOHEMAGLUTININA
CON LOS CARBOHIDRATOS.
La gran mayoría de las propiedades
biológicas de las lectinas estudiadas hasta el momento se
basan en la capacidad para reconocer e interactuar con diferentes
carbohidratos (Sharma & Surolia, 1997). La especificidad para
estas moléculas varía ampliamente entre las
diferentes lectinas (Sharma & Surolia), condicionado por la
variabilidad estructural de los sitios de unión (Sharon,
1993), donde las interacciones hidrofóbicas, las
modificaciones postraduccionales y la oligomerización
juegan un papel esencial (Vijayan & Chandra, 1999). Los
análisis extensivos de las secuencias y
estructuras de
varias lectinas muestran que a pesar de la hipervariabilidad de
sus regiones de combinación ellas exhiben un significativo
patrón de uniformidad (Sharma & Surolia) y la
especificidad por los diferentes monosacáridos parece
depender de un núcleo conservado de residuos que forma
puentes de hidrógeno con el azúcar
y una vuelta o lazo variable que determina la forma exacta del
sitio de unión. La alta afinidad por oligosacáridos
y monosacáridos particulares que contienen sustituyentes
hidrofóbicos resulta fundamentalmente de la existencia de
distintos subsitios próximos al sitio de unión a
los carbohidratos; subsitios que tienen un pequeño
número de residuos y se encuentran tanto en sitios
específicos para manosa como para galactosa (Loris,
Hamelryck, Bouckert & Wyns, 1998).
Específicamente para la PHA-L, el cambio de la
asparagina de la posición 128 por ácido
aspártico, elimina completamente la capacidad de
unión a los carbohidratos y con ello las actividades
leucoaglutinantes y mitogénicas características.
Esta mutación, sin embargo, no impide que los
polipéptidos formen los tetrámeros normales y sean
transportados hacia las vacuolas de almacenamiento de la célula
(Mirkov & Chrispeels, 1993). El determinante estructural
mínimo, altamente afín para la PHA-L es el
pentasacárido Gal b 1® 4 GlcNAc b 1® 2 [Gal b 1® 4 GlcNAc b 1® 6] Man (Hamelryck et al, 1996).
APLICACIONES
PRÁCTICAS DE LA FITOHEMAGLUTININA.
Dadas las propiedades de aglutinar células
sanguíneas, la PHA se utilizó inicialmente como
medio para separarlas de la sangre total (Li
& Osgood, 1949). Al demostrarse posteriormente el efecto
mitogénico, el espectro de aplicaciones se
incrementó y actualmente se usa como factor estimulante de
la proliferación en cultivos de diferentes estirpes
celulares, incluidos los linfocitos (Buhring et al, 1999; Fukao
et al, 1999; Kenan et al, 1992); en los que también
actúa sobre los procesos
bioquímicos relacionados con la respuesta inmune
(Kawashima, Kawasaki, Kitamura Tnojima & Morimoto, 1998;
Kunikata et al, 1998; Ohbo et al, 1995; Ryan, Vadas &
Shannon, 1994). Otras aplicaciones incluyen el estudio in
vitro de los mecanismos bioquímicos de la apoptosis
(Posmantur, Wang & Gilbertsen, 1998; Wakamatsu, Makino, Tei
& Baba, 1999) y de la proliferación celular en
linfocitos (Emamghoreishi et al, 1997; Forcic & Mazuran,
1999; Jensen, Odum, Jorgensen, Christophersen & Olesen,
1999), su empleo como
marcador histoquímico en estudios de
neurofisiología, neuroanatomía y en el proceso de
envejecimiento del SNC (Lanciego, Mengual, Erro &
Gimenez-Amaya, 1999; Wouterlood & Groenewegen, 1991), como
marcador farmacológico para el seguimiento de la respuesta
al tratamiento y toxicidad de medicamentos (Stein
Murray & Word, 1999) y
en la producción y mejora de medios
diagnósticos y métodos
analíticos (Delves, 2001; Hampel, Kottgen, Dudenhausen
& Kottgen, 1999; Ijima, Kimura & Shiba, 1999). Todas
estas aplicaciones se basan esencialmente en la propiedad de
combinarse específicamente con determinados
sacáridos.
POTENCIALIDADES
TERAPÉUTICAS DE LA FITOHEMAGLUTININA.
Los resultados in vitro avalan el posible uso
terapéutico de la PHA, sobre todo de la isoforma
mitogénica L4. Se reconoce en esta
proteína a un ideal modificador de la respuestas
biológicas a causa de su extensivo estudio, su
disponibilidad en forma pura y estable, convenientemente
administrable por múltiples vías, aparentemente no
sensibilizante, poco tóxica, con máxima efectividad
a dosis relativamente bajas, no inductora de estrés, no
oncogénica, no infecciosa, compatible con otras
modalidades terapéuticas, probablemente compatible con el
embarazo y con
una adecuada relación costo-efectividad
(Wimer, 1990).
La inmunoterapia sería uno de los campos
más beneficiados con su uso debido a la capacidad de
interacción rápida e irreversible
con los linfocitos, uno de los principales efectores de la
respuesta inmune (Wimer, 1990). Su potencial terapéutico
también podría incluir áreas como la
oncología, las infecciones críticas, los
transplantes, las quemaduras extensivas, las aplasias medulares e
incluso, ser utilizada como agente adyuvante en la
producción de vacunas, pues
ha resultado más efectiva de esta manera que como agente
de inducción (Wimer, 1990, 2002).
EFECTO
INMUNOMODULADOR DE LA FITOHEMAGLUTININA.
La evaluación
de las posibilidades de la PHA como modulador del sistema inmune
ha estado
comprometida debido al empleo de excesivas dosis de PHA
eritroaglutinante, nocivas para el sistema
circulatorio de los pequeños animales de laboratorio;
mientras que en humanos el factor limitante ha sido la
restringida disponibilidad del mitógeno en forma no
aglutinante. Como consecuencia, la subestimación de su
eficacia ha
conspirado contra la producción industrial de las
cantidades adecuadas para ensayos
clínicos. No obstante, se han empleado los datos
experimentales que existen para pronosticar a priori los
efectos de la modulación
mitogénica in vivo (Wimer, 1996).
La transformación linfocítica
(blastogénesis) fue descrita por vez primera por Nowell en
1960. Usando PHA para separar las fracciones sanguíneas
por aglutinación de glóbulos rojos y blancos, este
autor observó que la PHA también estimulaba los
linfocitos a una transformación tipo blastocito y
división celular. Esta observación se aplicó
rápidamente al estudio de los cromosomas
humanos y se usó para medir el potencial de
proliferación de los linfocitos, propiedad esencial para
la inmunidad mediada por células. Se considera que la
estimulación no específica y no inmunológica
por la PHA, hace que del 65 al 90 % de los linfocitos presentes
en el cultivo experimenten blastogénesis y división
celular después de 2-3 días en cultivo (Cohen,
1983).
La mayoría de las observaciones apoyan la
tesis de que
la estimulación ocurre fundamentalmente sobre los
linfocitos T (Bohnlein et al, 1989; Cohen, Ichikawa, Lavastida,
Gonzalez & Daniela, 1983; Hernandez & Leavitt, 1984;
Wimer, 1997), otros plantean que las poblaciones de linfocitos B
también son estimuladas a proliferar y diferenciarse,
aunque en menor proporción (Shankey, Daniele &
Novell, 1981).
Utsinger et al. (1977) encontraron incrementos en el contenido de
ADN entre
aproximadamente el 4 y el 8 % de las células B altamente
purificadas, mientras que Knuutila y Kovanen (1987), hallaron una
frecuencia de mitosis entre el 6 y el 20 % en estas
células. No obstante, se considera que la
proliferación y diferenciación de los linfocitos B
necesita, en última instancia, de la presencia de
subpoblaciones de linfocitos T auxiliadores que serían
inducidos por la PHA (Clement, Dagg, Lehmeyer & Kiyotaki,
1983).
Otro aspecto relacionado con la acción
inmunomoduladora de la PHA y que tendría un fuerte impacto
en terapéutica es la también señalada
posibilidad de suprimir la capacidad de respuesta del sistema
inmune. Aunque no está muy claro aún el mecanismo
por el cual se produce la inmunosupresión, ya desde los
años 70s se plantea como posibilidad el hecho de que la
PHA fuese capaz de activar células supresoras que
secundariamente podrían inhibir la proliferación
linfocitaria (Kurnick, Bell & Grey, 1976). También se
señala como probable el hecho de que los linfocitos
estimulados podrían liberar productos
solubles capaces de activar las células supresoras y de
esta manera inducir la inmunosupresión (Larsson &
Blomgren, 1978;Mawas, Charmot, Comoy & Sasportes,
1977).
Sobre este tópico Wimer (1998) señala que
además del efecto supresor inherente, esta sustancia
también potencia la
supresión generada por los agentes convencionales, tanto a
nivel de la respuesta inmune celular como de la humoral.
Borrebaeck y Schon (1987) en su estudio con diferentes
líneas de células T de leucemia linfocítica
humana, encontraron inhibición de la proliferación
y la síntesis
de ADN. Estos autores emplearon PHA-L y PHA-E y observaron que el
grado de inhibición era dependiente de la dosis de la
isolectina y que se necesitaban concentraciones considerablemente
mayores (hasta 10 veces más) de la isolectina E que la
necesaria para inducir la misma respuesta con la
PHA-L.
POSIBLES BENEFICIOS
DEL USO DE LA FITOHEMAGLUTININA EN ALGUNAS AFECCIONES
ESPECÍFICAS.
Wimer es uno de los autores que más ha especulado
sobre el posible uso de la PHA en terapéutica, tomando
como base, principalmente, los hallazgos experimentales de otros
investigadores. Según su parecer hay tres enfermedades que pueden
recibir los supuestos beneficios de la PHA directamente: la
anemia
aplástica, el cáncer
y la infección por VIH (Wimer, 1990, 1997, 1998, 2000,
2002).
En la anemia aplástica el mitógeno
podría ser utilizado en tres formas diferentes: (1) En los
tipos de anemias por citotoxicidad directa más benignos,
se podría aplicar un régimen estimulante para
incrementar la producción de factores de crecimiento y de
esta manera acelerar la recuperación de la aplasia, (2)
Donde es necesario un aloinjerto de células madres
hematopoyéticas para reemplazar la médula
ósea severamente dañada, se podría incluir
el mitógeno en el régimen preparatorio, (3) En las
anemias aplásticas de causa inmunológica en las que
es necesario instaurar un protocolo de
supresión, la PHA adicionada a un régimen de
drogas como la
ciclosporina y la globulina antilinfocito, podría, no
sólo incrementar la supresión, sino también
prevenir la reemergencia tardía del desorden clonal
(Wimer, 1998).
En el tratamiento del cáncer, la PHA
podría ser efectiva por la posibilidad de ayudar a la
inducción de la remisión en ciertos tumores, por
tener un efecto citotóxico antitumoral directo, por
mejorar el efecto antineoplásico de las radiaciones y la
quimioterapia, por disminuir el riesgo de
transformación maligna, por promover la
diferenciación y restaurar la respuesta de crecimiento
normal en las células malignas, por manifestar un riesgo
mínimo de suprimir la actividad citotóxica
antitumoral, así como por amplificar la inmunogenicidad de
las células tumorales (Wimer, 1990).
En la infección por VIH, administrada
sistemáticamente, la PHA podría interferir con la
invasión del virus a las células CD4+ al bloquear
las moléculas de la glicoproteína 120 en la
cubierta viral necesarias para este proceso; al mismo tiempo que
activaría los linfocitos T como consecuencia de su
unión a las proteínas CD2 y al receptor de los
linfocitos T para antígenos. La naturaleza no
específica de las células efectoras antivirales
generadas por esta activación, impediría las
mutaciones a la vez que se recuperarían las células
T depletadas, se estimularía la mielopoyesis y se
reforzaría la resistencia a las
malignizaciones y las infecciones prevalentes en el estado de
inmunodeficiencia. Estos efectos adecuadamente coordinados con
una apropiada combinación de inhibidores de la proteasa y
la reversotranscriptasa, podrían teóricamente,
acelerar la completa eliminación del VIH, acortando
así la duración del tratamiento requerido y
eliminando los perjudiciales efectos de las mutaciones del virus
en estos pacientes (Wimer, 1998, 2000, 2002).
Son evidentes las potencialidades de la PHA y su
aplicación en terapéutica médica, avaladas
por sus bien documentadas propiedades biológicas y una
vasta utilización en estudios in vitro. Esto, unido
a la posibilidad de su empleo en el tratamiento de enfermedades,
hasta el momento incurables, como el SIDA y el
cáncer, justificaría cualquier esfuerzo de la ciencia en
investigaciones in vivo en este campo.
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Autor:
Vladimir Ruiz Álvarez, MD, MSc.
Especialista de Primer Grado en Laboratorio
Clínico. Master en Bioquímica
General. ProfesorAsistente de Bioquímica y
Laboratorio Clínico, Dirección: Instituto de Nutrición e Higiene de los
Alimentos,
Laboratorio de Bioquímica y Fisiología, Calzada de Infanta 1158, Entre
Clavel y Llinás, CP. 10300, Ciudad de La Habana, Cuba. Teléfono: (537) 879 5183
Manuel Hernández-Triana, MD,
PhD.
Doctor en Ciencias
Médicas, Especialista de Segundo Grado en
Bioquímica Clínica, Profesor
Auxiliar de Bioquímica, Investigador Titular,
Dirección: Instituto de Nutrición e Higiene de los
Alimentos, Laboratorio de Bioquímica y Fisiología,
Calzada de Infanta 1158, Entre Clavel y Llinás, CP. 10300,
Ciudad de La Habana, Cuba. Teléfono: (537) 879
5183