Métodos de esterilización en el laboratorio químico

1. Objetivos
2. La
   Esterilización
3. Métodos
   físicos
4. Calor húmedo –
   Autoclave Chamberland
6. Métodos
   químicos
7. Radiación
8. Bibliografía

OBJETIVOS DE LA
ESTERILIZACIÓN:

No se puede hablar de esterilización sin
considerar el concepto de
microorganismo. Un microorganismo es un agente
microscópico vivo e imperceptible a los sentidos que
generalmente está agrupado en colonias, aunque bien puede
estar como una unidad formadora de colonias (U.F.C.), la que se
desarrolla en un medio apropiado para formar colonias
perceptibles. Los microorganismos pueden ser patógenos
(productores de ciertas enfermedades) o banales (los
habitualmente hallados en los alimentos, el
aire, el polvillo
ambiental, que no perjudican al hombre.

El hecho de que existan distintos tipos de
gérmenes en el medio
ambiente, crea grandes dificultades en los estudios
bacteriológicos, cuando es necesario obtener las especies
microbianas en estado de
pureza, ya que tanto el instrumental como los medios de
cultivo son invadidos con suma facilidad por los microbios del
medio ambiente.

Con el fin de subsanar éstos inconvenientes se practica
la esterilización, procedimiento que
consiste en destruir todos los gérmenes vivos que existan
sobre los objetos o sustancias que se desean libre de ellos
(asépticos).

Los Microorganismos pueden clasificarse en criorresistentes,
que son los resistentes al frío y termorresistentes o
resistentes a las altas temperaturas, aunque la
clasificación más común es por la temperatura a
la que se reproducen. Así se los puede clasificar en
Criófilos (-5 a 14 °C); Mesófilos (25 a 47
°C) y Termófilos (50 hasta 113 °C). Por ejemplo,
muchos hongos se
destruyen con la temperatura, pero sus esporas aún son
viables y cuando encuentran un medio apropiado, rico en
nutrientes y humedad, se reproducen. Por tal motivo la tecnología para su
destrucción debe considerar éstas variables.

LA
ESTERILIZACIÓN

Esta operación comprende todos los procedimientos
físicos, mecánicos y químicos, que se
emplean para destruir, inactivar o retener gérmenes en
general y patógenos en particular. A través de
esta, los materiales de
laboratorio para determinados diagnósticos y los elementos
quirúrgicos y la piel del
enfermo alcanzan un estado de desinfección que evita
la
contaminación operatoria.

CAPÍTULO 2

2.
MÉTODOS FÍSICOS:

Calor
La utilización de este método y
su eficacia depende
de dos factores: el tiempo de
exposición y la temperatura.
Todos los microorganismos son susceptibles, en distinto grado, a
la acción
del calor. El
calor provoca desnaturalización de proteínas,
fusión
y desorganización de las membranas y/o procesos
oxidantes irreversibles en los microorganismos.

2.1 Fuego Directo: Este procedimiento consiste en
exponer a la llama de un mechero de Bunsen el objeto que se desea
esterilizar. Cuando éste es de metal se deja permanecer en
el área de reducción de la llama hasta que se ponga
al rojo (asas de cultivo; algunas agujas, etc) . Si es de
vidrio se deja
un tiempo prudencial, procurando que la llama llegue a todos
lados. Antes de utilizar el objeto esterilizado es necesario
dejarlo enfriar en un sitio aséptico. Este procedimiento
tiene limitaciones debido a que deteriora los objetos y si son de
gran volumen, la
esterilización nunca es perfecta.

2.2 Calor Seco: El calor seco produce desecación
de la célula,
esto es tóxico por niveles elevados de electrolitos y
fusión de membranas, residuos que quedan adheridos al
objeto estéril. Estos efectos se deben a la transferencia
de calor desde los materiales a los microorganismos que
están en contacto con éstos.

Aún así se sigue utilizando el calor seco en
todos los laboratorios para la esterilización de placas de
petri y pipeteros (recipientes metálicos para alojar
pipetas para la siembra de sustancias líquidas).

La acción destructiva del calor sobre proteínas
y lípidos
componentes o nutrientes de los microorganismos, requiere mayor
temperatura cuando el material está seco o la actividad de
agua del medio
es baja.

2.3 Estufas: Para esterilizar por intermedio del aire
caliente es necesario colocar los objetos

en aparatos especiales llamados ESTUFAS. Y llevar el aire
interior a una temperatura entre 150 y 190 °C. Uno de los
primeros aparatos utilizados para este fin fué el horno de
Pasteur, que luego se sustituyó por estufas de aire
caliente. Estas constan de una doble cámara, el aire
caliente generado por una resistencia
eléctrica circula por la cavidad principal y por el
espacio entre ambas cámaras, a temperaturas vatriables,
siendo la más aconsejadas 170º C para el instrumental
metálico y a 140º C para el contenido de los
tambores. Se mantiene una temperatura estable mediante
termostatos de metal denominados de par bimetálico,
consistente en dos metales de
distinto coeficiente de dilatación. Cuando uno se dilata,
el otro no lo hace y se arquea. Uno de los extremos de
éste dispositivo se halla en contacto con un interruptor
que corta la alimentación de la
resistencia calefactora.

UN AVANCE EN EL CONTROL DE
TEMPERATURA: En la actualidad la mayoría de las
estufas de esterilización o de cultivo se termorregulan
por medio de un termostato hidráulico que consiste en una
ampolla metálica con gas en su
interior, hermética, unida por medio de un capilar de
metal a un tambor que varía su volumen cuando aumenta la
temperatura. Este tambor está en contacto con una llave
interruptora, de manera que si el gas interior del tambor se
dilata por el calor, la llave a la que está unido
interrumpe el fluido eléctrico a la resistencia,
manteniendo así la temperatura de la cámara.

MODERNIZACIÓN EN EL DISPOSITIVO DE CONTROL DE
TEMPERATURA: Se ha logrado controlar la temperatura mediante
un circuito electrónico que utiliza el microprocesador
555, utilizando como sensor una termorresistencia. Esta baja la
resistencia a la corriente al aumentar la temperatura y la
señal es enviada al procesador, el
que corta un relé que alimenta la corriente de la
resistencia de calefacción. Tanto éste como otros
dispositivos electrónicos ofrecen extrema sensibilidad de
control, ya apto mas para estufas de cultivo que para
esterilización.

Ventajas del calor seco:

• No es corrosivo para metales e instrumentos.
• Permite la esterilización de sustancias en polvo y
  no acuosas, y de sustancias viscosas no volátiles.

Desventajas:

*Requiere mayor tiempo de esterilización,
respecto al calor húmedo, debido a la baja
penetración del calor.

CAPÍTULO 3

Calor
Húmedo:
El calor húmedo produce
desnaturalización y coagulación de
proteínas. Estos efectos se deben principalmente a dos
razones:
*El agua es una
especie química
muy reactiva y muchas estructuras
biológicas son producidas por reacciones que eliminan
agua.
*El vapor de agua posee un coeficiente de transferencia de calor
mucho más elevado que el aire.

Antecedentes: El primer antecedente fue la marmita de
Papin en 1681, semejante a una olla a presión
que permitía mantener el agua por encima de los 100°
C.

En 1830 William Henry, médico de Manchester; trataba
ropa y otros utensilios provenientes de personas infectadas
exponiéndolos en una vasija a vapor recalentado y aire
caliente obteniendo el material libre de infección.

Pasteur en 1876, Koch y Wolffhugel en 1881 dan los fundamentos
de la esterilización por calor seco y calor húmedo:
30 minutos a 110° – 120° C de exposición al vapor
eran equivalentes a una hora de calor seco a 130° – 150°
C.

En 1884 aparece en París con el nombre de Chamberland
un equipo para usar en laboratorio, el que luego se
masificaría en todos los laboratorios
biológicos.

AUTOCLAVE
Se realiza la esterilización por el vapor de agua a
presión. El modelo
más usado es el de Chamberland.

Esteriliza a 120º a una atmósfera de
presión (estas condiciones pueden variar) y se deja el
material durante 20 a 30 minutos.
Equipo:
Consta de una caldera de cobre,
sostenida por una camisa externa metálica, que en la parte
inferior recibe calor por combustión de gas o por una resistencia
eléctrica.

La caldera se cierra en la parte superior por una tapa de
bronce sujetada por bulones, mariposas o charnelas. Esta tapa
posee tres orificios, uno para el manómetro, otro para el
escape de vapor en forma de robinete (también llamado
espita) y el tercero, para una válvula de seguridad que
funciona por contrapeso o a resorte.

Funcionamiento y método para esterilizar
adecuadamente en Autoclave:
Se coloca agua en la caldera, procurando que su nivel no alcance
a los objetos que se disponen sobre una rejilla o canasta de
metal. Se cierra asegurando la tapa, ajustando los bulones y se
da calor, dejando abierta la válvula de escape hasta que
todo el aire se desaloje y comience la salida de vapor en forma
de chorro continuo y abundante.

Se cierra la espita de vapor y se espera hasta que llegue a la
temperatura adecuada. A partir de allí se cuenta el tiempo
de esterilización, luego del cual se debe esperar al
descenso de la temperatura para abrir la espita de purga y la
tapa del autoclave nuevamente.

Este proceso de
esterilización es el que mejor resultados dá en
microbiología. El vapor de agua a fuerte
presión actúa a mayores temperaturas:

Tiempos de esterilización en autoclave:

Del tiempo, temperatura y presión usados en la
esterilización depende el éxito
alcanzado. Generalmente los datos
presión y temperatura son fijados, y el único
factor que se varía es el tiempo. Los materiales necesitan
diferentes tiempos de esterilización dependiendo de su
textura, porosidad, y otras características propias de
cada material. Algunos materiales como el hule, necesitan poco
tiempo, mientras otros como el metal quirúrgico necesitan
más. Los siguientes datos han sido tomados para una
temperatura de esterilización de 250ºF (121ºC) a
15-20 PSI.

• Guantes de Caucho (Hule)
15 minutos

• Sondas (base tejida) 15 minutos

• Sondas (látex) 15 minutos

• Frascos de Vidrio, Cristalería en General 20
minutos

• Agua en frascos 20 minutos

• Jeringas de Vidrio 20 minutos

• Bandeja 30 minutos

• Equipo de transfusión 30 minutos

• Paquetes de maternidad 30 minutos

• Ropa 30 minutos

• Torundas 30 minutos

• Paquete quirúrgico 45 minutos

• Instrumental de acero inoxidable
45 minutos

*Cuando se esteriliza se deben hacer paquetes bien cerrados y
bien ordenados, para que haya

buena penetración de vapor en el material.

No incluir dentro del mismo paquete material con diferentes
tiempos de esterilización. Ej. : Lencería y
Vidrio.

El método utilizado para envolver los paquetes
deberá garantizar el mantenimiento
de las condiciones de esterilidad de los materiales durante su
almacenamiento.

Como Cargar el Autoclave

a) Se deben acomodar los bultos o paquetes de tal forma que
haya una libre circulación de vapor entre ellos (no tratar
de llenar el autoclave hasta sobrecargarlo).

b) Colocar de lado las botellas, frascos y cualquier clase de
recipiente no poroso de material seco. Esto permite un pronto
desplazamiento del aire y un rápido contacto del vapor con
las superficies de las vasijas y su contenido. También
facilita el secado.

c) Esterilizar los líquidos separándolos de
otros materiales.

d) Cuando se esterilizan líquidos, debe hacerse con los
recipientes destapados.

e) La cristalería deberá esterilizarse colocando
los recipientes boca abajo u horizontales (nunca con la boca
hacia arriba).

CAPÍTULO 4

Tyndalización:

Esterilización por acción discontinua del vapor de
agua, se basa en el principio de Tyndall Las bacterias que
resisten una sesión de calefacción, hecha en
determinadas condiciones, pueden ser destruidas cuando la misma
operación se repite con intervalos separados y en varias
sesiones.
Se efectúa por medio del autoclave de Chamberland, dejando
abierta la válvula de escape, o sea funcionando a la
presión normal. Puede también realizarse a
temperaturas más bajas, 56º u 80º para evitar la
descomposición de las sustancias a esterilizar, por las
temperaturas elevadas.

Ventajas del calor húmedo:

• Rápido calentamiento y penetración
• Destrucción de bacterias y esporas en corto
  tiempo
• No deja residuos tóxicos
• Hay un bajo deterioro del material expuesto
• Económico

Desventajas:

• No permite esterilizar soluciones
  que formen emulsiones con el agua
• Es corrosivo sobre ciertos instrumentos
  metálicos.

Ebullición: Durante mucho tiempo se "hirvieron"
los utensilios y materiales quirúrgicos o jeringas
hipodérmicas para esterilizarlas. El agua a 100 °C no
garantiza una adecuada esterilización, no obstante posee
la propiedad de
desprender las colonias o los microorganismos y destruir aquellos
que son susceptibles a ésta temperatura.

Un claro ejemplo de ello fue el sistema utilizado
hasta hace pocos años para esterilizar jeringas de vidrio
y agujas hipodérmicas de níquel con embocadura de
bronce ó en el mejor de los casos, platino,
hirviéndolos en agua.

FILTRACIÓN: Este procedimiento es aplicable a la
esterilización de líquidos y gases,
especialmente los primeros. Cuando el líquido a filtrar no
puede resistir, sin descomponerse , la acción del calor,
se aplica la técnica de filtración, la que puede
efectuarse mediante presión o aspiración.

Se basa en el pasaje de líquidos a través de
sustancias porosas que detienen a los microbios. Los antiguos
filtros se fabricaban en forma de bujías que son cilindros
huecos abiertos por una extremidad y cerrados por otra, de
paredes de espesor variable.

La filtración se reconoció como técnica
de esterilización a partir de las observaciones de Koch en
1893, con la epidemia de cólera
y la presencia del vibrión en el agua. Esta observación fue ilustrada en la epidemia
Hamburgo-Altona en 1892. El agua del río Elba, que
contenía Vibrio comma pasaba a las cañerías
de agua de Hamburgo. Solo aparecieron unos pocos casos de
cólera en el suburbio de Altona, donde el agua del Elba
era filtrada por arenas (nótese el plural,
refiriéndose tal vez a varios grados de arena), antes de
su distribución.

Los filtros de porcelana se llaman "de Chamberland" y los de
tierras infusorias calcinadas se denominan "Berkefield"

En la actualidad se usan membranas filtrantes con poros de un
tamaño determinado. El tamaño del poro
dependerá del uso al que se va a someter la muestra. Los
filtros que se utilizan no retienen virus ni
micoplasmas, estos últimos están en el
límite de separación según el
diámetro de poro que se utilice. La filtración se
utiliza para emulsiones oleosas o soluciones termolábiles.
Su usa para esterilizar aceites, algunos tipos de pomadas,
soluciones oftálmicas, soluciones intravenosas, drogas
diagnósticas, radiofármacos, medios para cultivos
celulares, y soluciones de antibióticos y vitaminas.

Existen tres tipos básicos de filtros:
a- Filtros profundos o Filtros de profundidad:
Consisten de un material fibroso o granular prensado, plegado,
activado, o pegado dentro de los canales de flujo. En este tipo
de filtros la retención de las partículas se
produce por una combinación de absorción y de
retención mecánica en la matriz.

b- Membranas filtrantes:
Tienen una estructura
continua, y la retención se debe principalmente al
tamaño de la partícula. Partículas
más pequeñas al tamaño del poro quedan
retenidas en la matriza del filtro debido a efectos
electrostáticos.

La firma Millipore ha desarrollado membranas de 0,45
 y 14 cm de diámetro, con un soporte de
papel siliconado para su protección debido a la fragilidad
de la misma, la ue debe ser monada en un soporte estéril y
que permita el ingreso del líquido a esterilizar a
presión.

c- Filtros de huella de nucleación
(Nucleoporo):
Son películas muy delgadas de policarbonato que son
perforadas por un tratamiento conjunto con radiación
y sustancias químicas. Son filtros con orificios muy
regulares que atraviesan la membrana verticalmente. Funcionan
como tamices, evitando el paso de toda partícula con un
tamaño mayor al del poro.

CAPÍTULO 5

MÉTODOS
QUÍMICOS:

Estos métodos
provocan la perdida de viabilidad de los microorganismos.

En comparación con los procedimientos físicos,
éstos métodos tienen una importancia secundaria.
Los antisépticos son considerados venenos
protoplasmáticos que, al actuar sobre los gérmenes,
los destruyen. Algunos de ellos ejercen su acción nociva
sobre todas las células,
por lo cual se les considera venenos generales, por el contrario
otros actúan sobre algunas especies bacterianas,
mostrándose como venenos específicos. Este
método es óptimo para la antisepsia de las manos
del operador, de locales, de mesas de trabajo, de
jaulas de animales, y para
destruir gérmenes que puedan caer en lugares de
trabajo.

AGENTES QUÍMICOS

La Iodopovidona (pervinox), el Cloruro de Benzalconio (sal de
amonio cuaternario o Cloruro de Zefirano) son ejemplos de
antisépticos útiles para desinfectar manos y
superficies. Cuando la superficie es resistente, el mejor agente
biocida es el Hipoclorito de Sodio (agua lavandina).

ESTUFAS DE ESTERILIZACION POR OXIDO DE ETILENO
Destruye todos los organismos y microorganismos conocidos,
incluso esporas y virus. Esteriliza sin deterioro
artículos de goma, plástico,
metal, madera, lana,
piel, papel, productos
farmacéuticos.
Esterilización con embalajes: a este gas son permeables
sustancias como polietileno, nylon, celofán, etc.
En 1928, autores americanos: Bac, Cotton y Ellington; Schrader y
Bossert y Autores alemanes: Gassner y Hase, descubrieron las
propiedades del óxido de etileno.
En 1933 fueron certificadas las propiedades del óxido de
etileno en un laboratorio de La Sorbona y en 1939 se
estudió en un laboratorio de investigación del Ejercito de U.S.A.
El óxido de etileno era bactericida, esporicida, con gran
poder de
penetración, efectivo a bajas temperaturas y penetra
sustancias porosas; para evitar su poder explosivo y su alto
potencial inflamable se mezcló con CO2 en una
proporción de 7,15 veces el volumen de óxido de
etileno.
Trabajo de Phillips y Kaye.
El tiempo de esterilización que requiere el material
depende de múltiples variables, el vacío que se
produce, la humedad, la concentración del gas expresado en
gs./l y la temperatura, es decir que reduciendo la temperatura
aumenta el tiempo de exposición requerido.
El gas se adquiere en botellas metálicas o cartuchos que
se vaporizan, cambian de líquido a gas a 10º C.
Todos los artículos deberán airearse por 6 hs.
después de una esterilización.
El Oxido de etileno es un agente alquilante que se une a
compuestos con hidrógenos lábiles como los que
tienen grupos
carboxilos, amino, sulfhidrilos, hidroxilos, etc.
Es utilizado en la esterilización gaseosa, generalmente en
la industria
farmacéutica. Destruye todos los microorganismos incluso
virus. Sirve para esterilizar material termosensibles como el
descartable (goma, plastico, papel,
etc.), equipos electrónicos, bombas
cardiorrespiratorias, metal, etc. Es muy peligroso por ser
altamente inflamable y explosivo, y además
cancerigeno.

Con aldehídos
Son agentes alquilantes que actúan sobre las
proteínas, provocando una modificación irreversible
en enzimas e inhiben
la actividad enzimática. Estos compuestos destruyen las
esporas.

Glutaraldehído:
Consiste en preparar una solución alcalina al 2% y
sumergir el material a esterilizar de 20 a 30 minutos, y luego un
enjuague de 10 minutos.
Este método tiene la ventaja de ser rápido y ser el
único esterilizante efectivo frío. Puede
esterilizar plástico, goma, vidrio, metal, etc.

Formaldehído:
Se utilizan las pastillas de paraformaldehido, las cuales pueden
disponerse en el fondo de una caja envueltas en gasa o algodón, que después pueden ser
expuesta al calor para un rápida esterilización
(acción del gas formaldehído). También
pueden ser usadas en Estufas de Formol, llamadas también
de formalina, que son cajas de doble fondo, en cuya base se
colocan las pastillas y se calienta hasta los 60° C y pueden
esterilizar materiales de látex, goma, plásticos,
etc.
Las pastillas de formalina a temperatura ambiente esterilizan en
36 hs.

CAPÍTULO 6

RADIACIÓN:
Su acción
depende de:

• El tipo de radiación
• El tiempo de exposición
• La dosis

Radiaciones Ionizantes:
Producen iones y radicales libres que alteran las bases de los
ácidos
nucleicos, estructuras proteicas y lipídicas, y
componentes esenciales para la viabilidad de los
microorganismos.
Tienen gran penetrabilidad y se las utiliza para esterilizar
materiales termolábiles (termosensibles) como
jeringas

descartables, sondas, etc. Se utilizan a escala industrial
por sus costos.

Rayos Ultravioleta:
Afectan a las moléculas de DNA de los microorganismos. Son
escasamente penetrantes y se utilizan para superficies, se
utilizan para la esterilización en
quirófanos.

Rayos Gamma:
Su empleo esta
basado en los conocimientos sobre la energia atomica.
Este tipo de esterilización se aplica a productos o
materiales termolábiles y de gran importancia en el campo
industrial. Puede esterilizar antibióticos, vacunas,
alimentos, etc.

Control de calidad: La
correcta esterilización se puede controlar mediante dos
métodos, siendo el segundo el más seguro.
Indicadores: Cintas comerciales que se colocan en el
paquete o caja a esterilizar, que viran de color, cuando se
alcanzan las temperaturas adecuadas para la
esterilización.

Se describe la composición de los llamados
"testigos de esterilización" preparadas por sustancias
químicas.

1- Mezcla de Demande:

Safranina…………… 0,01 g.

Benzonaftol……….. 100,00 g.

Ésta mezcla se colorea de rojo cuando sufre una
temperatura de 110 °C.

2- Mezcla de Gérard:

Fucsina……………. 1 g.

Benzonaftol………..250 g.

Esta mezcla toma un color rojo rubí a 110
°C.

3. Mezcla de Gérard

4. Verde Brillante……… 1 g.

   Acetanilida…………100 g.

   Esta mezcla es azul a la temperatura ordinaria, a
   115 °C toma un color verde oscuro)

5. Mezcla de Gérard

Metil Violeta………..1 g.

Hidrato de Terpina….100 g.

Mezcla violeta pálido que a 117 °C se vuelve
violeta oscuro.

Las mezclas se
colocan en ampollas y se cierran a la lámpara,
colocándose junto con el material a
esterilizar.

Pruebas de cultivo:

También pueden colocarse gérmenes vivos,
especialmente esporulados y los que presentan mayor resistencia
como el bacilus subtilis o el b. Mesentericus de la papa
(también responsable de la filamentación en el
pan), esterilizándose conjuntamente con el material para
luego sembrar una suspensión de los gérmenes para
observarse en agar nutritivo a las 24 Hs. Si existe o nó
desarrollo de
colonias.

Bibliografía:

1-Carlos M. Barzizza – Microbiología – Tomo
1 y 2– Librería Hachette, Bs. As, 1960.

2-Microbiología de ZINSSER. Revisada por Smith y
Martín. UTHEA, 1970.

3-Catálogo Cole – Parmer 2002.

4-Catálogo Sigma, 2002.

5-Téchnique de Sterilisation. (texto en
Francés) Ern. Gérard, Paris, Vigot fréres,
1950.

6- A manual of
Bacteriology – H. Williams- Blakiston’s son & Co,
1919.-

7- Catálogo Cat-Lab. Editorial Elefantre,
2003-2005.

8- Deutsche Gesellchaft fur thechnische. Proyecto de
mantenimiento hospitalario. S. Salvador, Marzo de 1997.-

9- Material publicado en internet.

9-Notas, experiencias y material personales.

Ricardo Botta

Técnico en Electromedicina – Químico.

2004.