Aspectos fundamentales de las fermentaciones en estado sólido (FES)

Resumen
Fermentación en estado
sólido (FES). Antecedentes
Definición
Ventajas y desventajas de la
fermentación en estado sólido comparada con el
cultivo sumergido en líquido
Influencia de factores
ambientales en la fermentación en estado
sólido
Cinética y actividad
metabólica del cultivo batch
Consideraciones acerca de
optimización de medios de cultivo

1.
Resumen.

En el presente trabajo se
realiza una revisión sobre las características
principales de las fermentaciones en estado sólido, los
parámetros fundamentales a tener en cuenta sobre el
desarrollo
exitoso de estos procesos
fermentativos como la humedad, la actividad del agua, pH, temperatura,
concentración y disponibilidad del sustrato,
aireación, tamaño de partícula,
inóculo, etc. Se aborda además algunas
consideraciones sobre la optimización de los medios de
cultivos de los medios de cultivo y las ventajas y desventajas de
este proceso en
comparación con las fermentaciones sumergidas.

Palabras clave: Fermentaciones sólidas, factores
ambientales, cinética, optimización.

Desarrollo

1-. Fermentación en estado sólido
(FES).

1.1-. Antecedentes.

Los procesos de FES existen de manera natural desde el
comienzo de la vida en el planeta y fueron empleados de forma
artesanal en los países del Sudeste Asiático,
África y América
Central desde hace siglos para la elaboración de alimentos a
partir de cereales, yuca, entre otros. El objetivo
fundamental con estas fermentaciones ha sido no solo aumentar el
contenido proteico de estos alimentos, sino mejorar las
posibilidades de conservación, cambiar las
características físicas, el color, el olor o
el sabor de los mismos. Ejemplos de estos productos lo
constituyen el Koji, que se obtiene por el cultivo del hongo
Aspergillus oryzae sobre cereales cocidos, el Shoyu, el
Miso y el Ontjom (Hesseltine, 1972). La producción del queso Roquefort a partir de
leche de
oveja, data de alrededor de 1000 años; sin embargo, no es
hasta aproximadamente 1930 que se conoce el papel de los hongos en la
elaboración de ese alimento, cuando se demostró que
todos los hongos desarrollados en este tipo de queso eran del
mismo organismo Penicillium roqueforti.

No es hasta finales de la década de los 70 que se
promueve con fuerza el
estudio científico, con vistas a aprovechar las ventajas
económicas de este tipo de fermentación (Doelle y
col., 1992).

1.2-
Definición.

Hesseltine (1972) empleó el término de
fermentación en estado sólido a todas las
fermentaciones donde el sustrato no es líquido.
Posteriormente, Raimbault (1980) propuso un término
más preciso: "Las fermentaciones en las cuales el sustrato
no está ni disuelto ni en suspensión en un gran
volumen de
agua". No obstante, Moo-Young y col. (1983), propusieron un
término a todos los procesos que utilizan materiales
insolubles en agua para el crecimiento de microorganismos en
ausencia de agua libre; autores como Mudgett (1986) y Durand. y
col. (1988), han planteado una definición más
general: "Es un método de
cultivo de microorganismos sobre y/o dentro de partículas
sólidas". El líquido ligado a las partículas
sólidas debe estar en una cantidad que asegure la
actividad del agua adecuada para el crecimiento y el metabolismo de
los microorganismos, pero sin exceder el máximo poder de
retención de este líquido en la matriz
sólida.

La definición más general y reciente fue
formulada por Viniegra-González (1997), donde se plantea
que "es un proceso microbiológico que ocurre
comúnmente en la superficie de materiales sólidos
que tienen la propiedad de
absorber y contener agua, con o sin nutrientes solubles". Esta
definición abarca a procesos donde el soporte
sólido es inerte y los sustratos que utiliza el microorganismo
pueden ser sustancias solubles en agua, como el proceso de
bioconversión de etanol y el crecimiento de Candida
utilis sobre amberlita (Christen y col., 1993).

1.3- Ventajas y
desventajas de la fermentación en estado sólido
comparada con el cultivo sumergido en
líquido.

Doelle y col. (1992) consideran como ventajas los
siguientes aspectos:

Los medios de cultivo son simples, generalmente
subproductos agrícolas que presentan un alto contenido
de los nutrientes necesarios.
La baja actividad del agua es de gran ayuda para
evitar las contaminaciones, especialmente de bacterias y
levaduras.
La concentración natural del sustrato permite
utilizar reactores más pequeños en
comparación con los utilizados en otro tipo de
fermentación. Tienen mayor productividad
volumétrica.
La aireación forzada es facilitada por la
porosidad del soporte, lo que permite una alta transferencia de
oxígeno al microorganismo.
Pueden emplearse, frecuentemente conidios como
inóculo en los procesos de crecimiento de hongos, lo
cual disminuye los costos y las
manipulaciones en la preparación del
inóculo.
Los conidios de los hongos que se producen son mucho
más resistentes y tienen mejor adaptabilidad a las
condiciones en las que se aplican como agente de
biocontrol.
El proceso de recobrado es simplificado. Algunos
productos son utilizados integralmente, como alimento animal,
productos para el control
biológico, etc.
Los procesos se consideran generalmente como
tecnologías limpias.

Entre las principales desventajas se
encuentran:

Su aplicación se limita a microorganismos que
crecen en bajos contenidos de humedad.
La extracción del calor
metabólico puede ser un problema, sobre todo cuando se
trabaja a gran escala y no se
controla el proceso.
La naturaleza
sólida del sustrato trae problemas al
medir los parámetros de la fermentación tales
como el pH, la temperatura, el contenido de humedad y la
concentración de sustrato y productos.
Los procesos de transferencia de masa son limitados
por la difusión.
Muchos aspectos ingenieriles como el diseño de reactores y el escalado
están muy poco caracterizados.
El tiempo de
fermentación es mayor debido a que generalmente se
utilizan microorganismos que presentan bajas velocidades
específicas de crecimiento.

Es bueno recalcar que algunas de estas desventajas son
relativas, por ejemplo, el tiempo de fermentación ya que
actualmente se están empleando bacterias en los procesos
de FES.

Se realizan grandes esfuerzos en la búsqueda de
soluciones
parciales a las dificultades antes mencionadas, algunos como
Gervais y Bazelin (1986) experimentaron con un reactor que
permitía la regulación de la humedad relativa del
aire y su
temperatura en circulación, ya que según Ballio y
col. (1964) y Richard-Molard y col. (1985), demostraron que
durante el desarrollo del hongo, la variación de la
actividad del agua (aH2O) en el medio, puede influir
en el crecimiento micelial o en la germinación de las
esporas y esto puede ser útil para optimizar la
producción de conidios en fermentadores con sustrato
sólido, donde la suplementación de oxígeno y
la cosecha de conidios, resulta más fácil que en
fermentaciones líquidas.

Para el caso específico del control
biológico, en la producción de hongos por
fermentación sumergida, en determinados casos, se obtienen
blastosporas, que si bien son estructuras
infectivas, resultan poco resistentes a los cambios de las
condiciones climáticas (temperatura, radiación,
humedad, etc.), a diferencia de los conidios que se producen en
las fermentaciones en fase sólida. Se caracterizan las
primeras por presentar cubiertas delgadas y lisas, que influyen
negativamente en cuanto a su eficiencia y
persistencia después de las aplicaciones dificultando,
además, la formación de epizootias.

1.4-
Influencia de factores ambientales en la fermentación en
estado sólido.

Las condiciones ambientales tales como la humedad, la
actividad del agua, el pH, la temperatura, la
concentración y disponibilidad del sustrato, la
aireación, el tamaño de partículas y la
forma de inoculación afectan significativamente tanto el
crecimiento como la formación de productos. En el cultivo
líquido agitado el control de las condiciones ambientales
es relativamente simple, ya que estos sistemas son
homogéneos desde el punto de vista de la
concentración celular, nutrientes y productos. Sin embargo
se presentan serios problemas en los sistemas sólidos con
el mezclado, la transferencia de oxígeno, el intercambio
de calor y el control de la humedad y el pH, debido,
principalmente, a la heterogeneidad y la consistencia del
sistema
(Doelle y col., 1992).

1.4.1- La Humedad y la actividad del agua
(aH2O).

El por ciento de humedad en la fermentación
sólida puede variar entre 30 y 80% (Oriol y col., 1988),
en dependencia del sólido utilizado, el microorganismo y
el objetivo del proceso (formación de producto,
crecimiento de la biomasa). Aunque el por ciento de humedad es
una de las variables que
comúnmente se optimiza en los sistemas de
fermentación sólida, (Kim y col., 1985,
Rodríguez y col., 1986), hoy se reconoce que no es solo la
cantidad de agua presente en el sistema la que ejerce su
influencia sobre la eficiencia del proceso, sino el carácter de las interacciones entre
el agua y el
medio sólido. Por eso no es contradictorio observar que un
mismo microorganismo se desarrolle plenamente en dos sustratos
diferentes con por cientos de humedad bastante disímiles.
La actividad del agua (aH2O) es el parámetro
que se ha utilizado para caracterizar cuantitativamente esas
interacciones físicas y/o químicas del agua en el
sistema.

La actividad del agua se define como la humedad relativa
de la atmósfera gaseosa en equilibrio con
el sustrato (Oriol E. y col., 1988). La humedad relativa de un
sistema gas – vapor de
agua se determina por %H. R. = (p H2O /
p°H2O) 100, de manera que la actividad del agua es
igual a la relación entre la presión
parcial del vapor de agua en la solución gaseosa (p
H2O ) en el estado de
equilibrio con el agua adsorbida en el sólido y la
presión de vapor del agua pura (p°H2O ) a
esa misma temperatura .

Se demostró que la actividad del agua no
sólo ejerce influencia sobre el crecimiento, sino
también sobre la formación de productos y, en
muchos casos, el valor
mínimo requerido de aH2O para la
formación del producto difiere del necesario para el
crecimiento (Troller, 1980, Gervais y col., 1988).

Gervais y Bazelin (1986) diseñaron un fermentador
para controlar el valor de la actividad del agua durante el
desarrollo del proceso a través de la humedad relativa del
aire que circula por el equipo. No obstante, el tiempo necesario
para alcanzar el estado de equilibrio deseado era como
mínimo 4 horas, y aunque los autores comparan ese tiempo
como pequeño para procesos de fermentación con
hongos que duran hasta 60 horas, el sistema de control
estaría limitado solo a estas aplicaciones. Por otra
parte, los ensayos
realizados fueron sin la presencia de microorganismos, lo cual
ejerce también influencia en los resultados
experimentales.

1.4.2- El pH.

El pH es otra variable que afecta el desarrollo de los
procesos de fermentación en estado sólido, al igual
que lo hace en los cultivos sumergidos. Sin embargo, en el caso
de la fermentación sólida, su control es
prácticamente imposible, debido a la ausencia de
instrumentos capaces de medir el pH en la capa de líquido
que rodea el sólido (Mitchell y col., 2002). Por otra
parte, el mezclado de sólidos es un proceso complejo por
lo cual se dificulta también el control de esta variable
durante el desarrollo de la fermentación.

El pH cambia por diferentes razones; normalmente
disminuye por la secreción de ácidos
orgánicos como acético y láctico durante el
proceso. No obstante, la fuente de nitrógeno utilizada
influye mucho en la tendencia que sigue el pH (Domenech,
2000).

Estos conocimientos han sido utilizados por algunos
investigadores para formular un medio de cultivo que permita
mantener, de manera natural, el pH en un intervalo deseado
durante el proceso. Así por ejemplo, Raimbault y Alazard
(1980a) propusieron para el crecimiento de Aspergillus
niger en harina de yuca una mezcla de sulfato de amonio –
urea de 3 a 2 (calculado en base al nitrógeno) y se
logró mantener el pH durante el proceso en el intervalo de
5 a 6.2 favorable para el crecimiento del
microorganismo.

1.4.3- La temperatura.

El crecimiento y la formación de productos son
resultados de complejas reacciones
químicas, y al igual que cualquier otra
reacción, están afectados por la temperatura, la
que ejerce una acción
determinante en el conjunto de actividades celulares.

La temperatura es la variable cuyo control, en una
fermentación sólida, se considera el más
crítico debido a la alta concentración de sustrato
por unidad de volumen y a la baja conductividad térmica
del sistema heterogéneo sólido – líquido –
gas, lo que favorece la acumulación del calor
metabólico en el sistema y un aumento de la temperatura
del cultivo. En la fermentación de Tempeh, por ejemplo, se
midieron gradientes de temperatura de 30C por cm
(Bernard y col., 1992).

El aumento de la temperatura favorece tres aspectos
negativos:

La actividad microbiana se desacelera o se
detiene.
Se deshidrata el medio sólido.
El metabolismo se desvía como un mecanismo de
defensa ante el calor o ante la deshidratación
(Gutiérrez y col., 1995).

El control de la temperatura se ha tratado a
través de métodos
convencionales de extracción de calor y de métodos
no convencionales. Los métodos convencionales incluyen el
intercambio de calor por los mecanismos de conducción y
convección forzada. Se demostró que los primeros no
son tan efectivos como los segundos (Saucedo – Castañeda y
col., 1990). Los métodos de extracción de calor por
convección, para ser efectivos, requieren de elevadas
tasas de aireación que con frecuencia deshidratan al
medio. Los métodos no convencionales se refieren a la
utilización del calor latente de vaporización del
agua para eliminar el calor metabólico de manera
rápida y efectiva (Sargantanis y col., 1993).

Sobre esto se han pronunciado diferentes autores, pues
plantean que el control de temperatura es uno de los problemas
que se ha detectado desde siempre en las FES y que, a la fecha,
no tiene una solución clara. En función de
las condiciones de cultivo, se han reportado diversos gradientes
de temperatura dentro del lecho de fermentación:
30C cm-1 (Rathbun y Schuler, 1983);
2.50C cm-1 (Raimbault, 1980);
4-50C cm-1 (Saucedo-Catañeda y col.,
1990; González-Blanco y col., 1990). Poco se conoce sobre
la magnitud del calor metabólico generado en las FES. En
la mayoría de los casos se concretan a un valor constante.
Rathbun y Schuler (1983) proponen que se producen hasta 15.9 J
kg-1 de materia seca,
mientras que la velocidad de
generación de calor es del orden de 3.3 x 105J
h-1 kg-1 de materia seca (Raimbault, 1980).
Esto puede provocar un sobrecalentamiento en la masa del cultivo,
que influye negativamente sobre la actividad
microbiana.

Existe un compromiso entre las soluciones
drásticas y efectivas (métodos no convencionales)
versus las menos efectivas (métodos convencionales) pero
que respeten la integridad del sistema biológico en su
conjunto. Resulta también claro que los sistemas de
control de las FES deberán tomar en cuenta,
simultáneamente, la humedad del medio, la humedad relativa
del aire y la temperatura. También el tipo de reactor
utilizado (con o sin agitación) juega un papel fundamental
en la eficiencia del control de la temperatura.

1.4.4- La concentración y disponibilidad del
sustrato.

El medio de cultivo debe tener todos los nutrientes
necesarios de forma balanceada para favorecer el crecimiento del
microorganismo. Las relaciones entre algunos de sus elementos son
de particular importancia, por ejemplo, carbono-nitrógeno y
fósforo-oxígeno, esta última de manera
relevante en lo referido a la eficiencia de conversión
energética y a la respiración (Cannel y Moo Young,
1980).

La formulación tiene que ver con los aspectos
cuantitativos de los medios, es decir, debe establecer las
concentraciones a ser utilizada de cada componente. Una primera
aproximación con respecto a las cantidades a utilizar de
las diversas fuentes lo da
el
conocimiento de la composición de la biomasa del
microorganismo empleado (Ertola y col., 1994).

Mediante el conocimiento
de los coeficientes de rendimiento para la formación de
biomasa y producto, y los valores de
la energía de mantenimiento
será posible establecer también los requerimientos
de las fuentes de carbono necesarios para formular un medio
(Ertola y col., 1994).

Al igual que en los cultivos sumergidos, la
concentración de sustrato ejerce una influencia sobre el
desarrollo del microorganismo. Hasta el momento, tal influencia
no está caracterizada en términos de
limitación o inhibición como en los cultivos
sumergidos; pero se piensa que los efectos de limitación
sean mayores en las fermentaciones sólidas, debido a la
baja velocidad de difusión de los nutrientes en la fase
líquida (Moo-Young y col., 1983). Si se ha encontrado que
la relación carbono a nitrógeno tiene una gran
importancia y su valor óptimo puede variar en el intervalo
de 10 a 100 en dependencia del proceso de
fermentación.

1.4.5- La aireación.

En la mayoría de los procesos de
fermentación en estado sólido participan
microorganismos aerobios, y resulta la aireación un factor
fundamental para el desarrollo del proceso. La aireación
se utiliza para suministrar el oxígeno necesario, para
extraer el CO2 formado, así como para extraer
el calor metabólico evolucionado, de manera que el flujo
óptimo de aire debe tomar en consideración la
naturaleza del microorganismo utilizado, los requerimientos de
oxígeno para el crecimiento y/o la formación del
producto deseado, la velocidad de generación de calor
metabólico, la concentración crítica
del dióxido de carbono y otros metabolitos
volátiles, el espesor de la masa de sólido, entre
otros. La aireación en las FES es más fácil
que las fermentaciones sumergidas, porque la superficie de
contacto es mayor entre el aire y el líquido que
está absorbido en las partículas (Viniegra y col.,
2003).

1.4.6- El tamaño de
partícula.

El tamaño de partícula está muy
ligado a la transferencia de masa en el sistema de
fermentación en estado sólido, y para considerar
este fenómeno se ha propuesto dividir el análisis en la transferencia de masa
intrapartícula y la interpartícula (Moo-Young y
col., 1983). En el primer caso, influye más el
tamaño y la forma del poro de la partícula,
así como la porosidad, aunque también influye el
tamaño de la partícula (Huerta, S., 1984). En el
segundo caso, el espacio interpartícula es lo más
importante y es afectado por el tamaño de la
partícula, su forma y la humedad (Bernard y col.,
1992).

Otro aspecto que influye en la transferencia de masa
durante el proceso, es el cambio de
estructura de
las partículas de sustrato resultado de la acción
de los microorganismos (Moo-Young y col., 1983).

1.4.7- El inóculo.

Otro factor que influye en los procesos de FES lo
representa el tipo de inóculo y la forma de
inoculación. En la literatura se reconoce el
uso de dos tipos fundamentales de inóculo en la
producción de hongos, tanto a nivel de laboratorio
como industrial: micelio o esporas (Domenech, 2000). El uso de
micelio está reportado por Moore y Prior (1993) y Jenkins
y col. (1998), entre otros. Las principales ventajas del uso de
micelio como inóculo son: una mejor competitividad
del hongo, una reducción de la posible colonización
del sustrato por microorganismos contaminantes y la
colonización más rápida debido a que se
reducen los tiempos de incubación (la fase de latencia o
de adaptación principalmente). Sin embargo, en diferentes
trabajos se reporta el uso de suspensiones de esporas (Bosch y
col., 1995, Dorta y col., 1996 y Booth y Shanks, 1998),
destacándose su principal ventaja en la reducción
de los costos en la etapa de propagación del
microorganismo.

1.5.-
Cinética y actividad metabólica del cultivo
batch.

La cinética de un proceso; representa la
variación de una o más variables de dicho proceso
en el tiempo. En los procesos fermentativos las variables de
mayor importancia y que más se han estudiado son:
contenido de biomasa en el sistema, la naturaleza del sustrato,
la síntesis
de uno o varios metabolitos, el consumo de
oxígeno y la producción de dióxido de
carbono. Dentro de estas variables, la síntesis de biomasa
en el proceso y el consumo de sustrato han permitido establecer
una serie de criterios y parámetros que caracterizan
cualquier proceso fermentativo (Domenech, 2000).

Los estudios cinéticos permiten determinar
aspectos tan importantes como:

La velocidad específica de crecimiento
(m
).
El rendimiento del proceso.
La productividad del sistema.
El calor generado en el sistema.
La estrategia a
seguir en cuanto a la producción de un metabolito
específico.

Una de las principales dificultades encontradas en el
estudio y desarrollo de los procesos de fermentación en
estado sólido viene dada por las características
intrínsecas de estos sistemas heterogéneos, la
imposibilidad del muestreo durante
la fermentación para determinar las concentraciones
correspondientes de biomasa, sustrato y productos. Este hecho se
refleja de manera particularmente aguda cuando se tiene la
necesidad de realizar estudios cinéticos del proceso. No
obstante, existen diferentes alternativas que permiten
desarrollar estos estudios de manera objetiva y
satisfactoria.

La determinación de la biomasa por métodos
indirectos se ha empleado por diferentes investigadores. Entre
ellos, Sato y col. (1983), Rodríguez y col. (1988),
Desgranges y col. (1991) han basado su metodología en el metabolismo respiratorio.
El O2 consumido y el CO2 producido son el
resultado de los procesos metabólicos a través de
los cuales los microorganismos aeróbicos obtienen la
energía necesaria para su crecimiento. Por tanto, estas
actividades metabólicas están asociadas al
crecimiento del microorganismo y pueden usarse para estimar la
biomasa sintetizada. Entonces es posible relacionar en
términos diferenciales el O2 consumido
(dO2/dt) y el CO2 producido
(dCO2/dt) tanto al crecimiento celular como al
mantenimiento según se expresa en las ecuaciones 4 y
5 (Sato y col.,1983):

(1)

(2)

Estos modelos de
correlación son resueltos con el uso de técnicas
numéricas para la solución de ecuaciones
diferenciales. Con el empleo de
computadoras y
software
adecuados y cromatógrafos o
analizadores de gases
(CO2 y O2) acoplados a la salida de los
gases del fermentador, es posible estimar de forma continua la
biomasa sintetizada y, de esta manera, estimar el calor
metabólico generado. Esta metodología pudiera
aplicarse en el control de parámetros de la
fermentación como, por ejemplo, para la
temperatura.

1.6-.
Consideraciones acerca de optimización de medios de
cultivo.

Pueden ocurrir situaciones en las cuales sea imperativa
la optimización de los medios de cultivo (Ertola y col.,
1994). Entre ellas podemos mencionar las siguientes:

La no existencia de información respecto a coeficientes de
rendimiento de macro y micro elementos para el cultivo del
microorganismo determinado.
La existencia de limitaciones nutricionales ocultas,
especialmente de microelementos y factores de
crecimiento.
El uso de medios de cultivo conteniendo elementos en
exceso respecto de los requerimientos nutricionales del
microorganismo en cuestión, que pueden causar
inhibición del crecimiento.
El ensayo de
sustancias estimulantes, activadoras e inhibidoras del
crecimiento y formación del producto.
El empleo de fuentes nutricionales no
convencionales.

Acerca de esto existen en la literatura diferentes
ejemplos sobre técnicas que hacen posible la
optimización de los medios de cultivo. La mayoría
de estas, basan la formulación de los mismos en la
composición elemental del microorganismo a estudiar o de
otros similares que puedan servir de referencia para realizar un
balance de materia apropiado. (Dreyer y col., 2000).

La optimización de los medios de cultivo con
fines industriales, en la mayoría de los casos ha sido
efectuada mediante procedimientos
empíricos de ensayo y error, no solo en la
formulación del medio de cultivo, sino también en
las condiciones de operación. De cualquier manera es
probable que el medio de cultivo original pueda ser optimizado,
modificando el porcentaje de los componentes del mismo y las
materias primas utilizadas, siendo factible en muchos casos
optimizar un medio de tal manera que no sea solamente más
productivo, sino de menor o igual costo que el
original, para lo cual se requiere del uso de varios
métodos de optimización (Dreyer y col.,
2000).

Un aspecto relevante en la optimización de un
medio de cultivo de interés
industrial no es sólo el logro de una formulación
racional del mismo, sino también la posible
inclusión de materias primas de bajo costo que hagan
rentable el proceso. Ello ha llevado a la búsqueda de
subproductos de bajo valor comercial que puedan sustituir
componentes costosos y que puedan ser utilizados como fuentes de
carbono o nitrógeno (Dreyer y col., 2000).

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Ing. Hector Correa Rivero MSc.

Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA)
Autopista Nacional y Carretera de Tapaste
Apartado 10. San José de las Lajas
La Habana. Cuba

Categoría: Ingeniería