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Función de la pared celular de Padina gymnospora en la acumulación de cadmio




 

  1. Procedimiento
  2. Resultados
  3. Conclusiones

Introducción:

Padina gymnospora es un alga parda, su hábitat es el mar, presentan además de clorofila a y c un pigmento pardo dorado llamado fucoxantina, su pared contiene abundantes alginatos. Su cuerpo vegetativo es simple sin partes diferenciadas (talo).

El cadmio es un catión metálico divalente que en altas concentraciones en el agua de mar es tóxico.

Se han usado diversas especies de Padina en estudios de polución por metales pesados debido a su alta capacidad por captarlos y retenerlos.

Se han propuesto dos mecanismos para explicar la habilidad de estas algas en la acumulación de metales que están en exceso en el agua:

  1. Presencia de polisacáridos polianiónicos en la pared celular.
  2. Vesículas citoplasmáticas (physodes) en cuyo interior hay polifenoles y tolueno. Se cree que estas vesículas constituyen una defensa ante la herbivoría.

La información que se tiene de trabajos previos sobre P.gymnospora, es la siguiente:

En organismos aislados de zonas contaminadas con Cd y Zn, se vio que el nivel de asociación de estos cationes en los physodes era bajo. Esto sugiere que las altas cantidades de Cd y Zn encontradas en las algas del área contaminada no se debe a la capacidad de fijación por los polifenoles.

En otro trabajo se vio que las algas crecidas en altas concentraciones de Zn, o individuos adultos aislados de zonas contaminadas con Zn, presentaban altas concentraciones de este metal en gránulos dispersados a lo largo de las paredes celulares, de zonas corticales y medulares del talo del alga. Lo mismo se observó para el Cd, ya que algas recolectadas de zonas contaminadas con Cd presentaban concentraciones de dicho metal diez veces mayor que en las algas de áreas no contaminadas.

Los grupos sulfatos y carboxilos de la pared celular (grupos aniónicos) actúan como los principales complejos captadores de iones metálicos.

Cuando hay alta concentración de iones metálicos en el medio acuático, la pared celular del alga previene la entrada de estos al citoplasma, actuando como un mecanismo de exclusión, una barrera iónica.

A concentraciones bajas de iones en el medio, quedó demostrada la alta capacidad de la pared celular de las algas pardas en el intercambio iónico, el cual es 3,5 veces mayor que en las plantas terrestres.

Se vio que el Cd tiene un rol biológico en las algas, este es el de aumentar la actividad de la enzima Anhidrasa Carbónica, una metaloenzima que normalmente requiere Zn (este ultimo ítem se demostró en Diatomeas).

El objetivo de este trabajo es trazar la distribución del Cd en la pared celular de Padina gymnospora, y correlacionar esos resultados con los de la distribución del Zn y con la distribución y abundancia de los polisacáridos polianiónicos.

Procedimiento:

Se aislaron individuos de P.gymnospora de la Bahía de Ribeira (Río de Janeiro, Brasil) de un área no contaminada con metales. En el laboratorio se las lavó con agua de mar y se las cepilló para retirar las partículas adheridas y epífitas. Una vez limpias se separaron en tres grupos de diez algas cada uno. Uno de los grupos se lo colocó en una pecera de vidrio con agua de mar (control), otro grupo en otra pecera con agua de mar y CdCl2 (tratamiento 1), y el grupo restante en otra pecera con agua de mar, CdCl2 y Zn2SO4 (tratamiento 2). Las condiciones de crecimiento para el control y los tratamientos fueron: fotoperíodo 12:12 horas luz/oscuridad, temperatura 21±2°C.

El tiempo que se las deja crecer bajo estas condiciones es de una semana, pero al cabo de tres días se observó daño celular en la zona apical del talo de las algas crecidas bajo el tratamiento 2. Por lo tanto se tomaron muestras de algas de los dos tratamientos a los tres días, y al séptimo día de crecimiento solo se tomaron muestras de algas del tratamiento 1 y del control.

Las muestras son procesadas de acuerdo a las observaciones que se les quiere hacer. Se va a analizar la composición, concentración y distribución de los metales acumulados, y se va a estudiar la ultraestructura del tejido del alga en diferentes regiones del talo, tanto de las crecidas en agua de mar como las crecidas bajo Cd y Cd/Zn combinados.

Primero se analiza la concentración de Cd y Zn en los tejidos de P.gymnospora crecida bajo las condiciones del control y los dos tratamientos, al cabo de tres y siete días de incubación.

Resultados:

Al tercer día las algas que recibieron el tratamiento 1 presentaban acumulación de Cd (mgCd/mg peso seco) en una concentración 2,6x10³ más elevada que en el control.

Al séptimo día bajo el mismo tratamiento las algas presentaban acumulación de Cd 5x10³veces más elevada que el control.

En las algas que recibieron el tratamiento 2, al tercer día de crecimiento se ve que el Cd acumulado es 3,6x10³ más elevado que en el control, y a su vez es mayor que la concentración de Cd en las algas del tratamiento 1 al mismo tiempo de incubación. No se disponen muestras de algas a la semana de tratamiento 2, ya que a los tres días comienzan a aparecer los daños en la morfología y en la ultraestructura de las células. Esto se debe a las altas concentraciones de Cd y Zn combinados.

Con respecto a la acumulación de Zn, se vio que su concentración en algas bajo el tratamiento 2 era 10² veces más elevado que en el control.

Por todos estos resultados se puede decir que frente a altas concentraciones de Cd en el medio marino, P.gymnospora lo acumula en un orden tres veces superior a la concentración que se ve en algas de aguas no contaminadas con dicho catión. Además cuando hay presente Zn combinado con Cd, la acumulación de este último en Padina es mayor que si no lo hubiera.

Luego se procede a observar la ultraestructura de Padina gymnospora. Para ello se hacen cortes transversales de las algas crecidas en las condiciones del control, y se aplica microscopía electrónica de transmisión (TEM) . Figuras 1 a 4.

 

Figura 1*: Imagen de TEM de un corte transversal del talo del alga. Se pueden distinguir las células corticales (c) y las células medulares (m).


Figura 2*: Se ve en ampliación una célula cortical en la que se distingue el núcleo (n), physodes (p) y los cloroplastos adyacentes a la membrana plasmática (palsmalema).

 

 


Figura 3*: La imagen muestra en detalle la pared celular de una célula cortical.

La punta de la flecha indica la cápsula de la pared, luego sigue una capa amorfa de fibras (a) y más internamente en contacto con el plasmalema está la capa fibrilar (f) de aspecto denso, en la cual las fibras se disponen unas paralelas a otras.


F

igura 4*: Se muestra la pared celular de células medulares. Ésta presenta una capa fibrilar (f) adyacente al plasmalema y una capa amorfa (a).

 

Luego se estudia la ultraestructura de las células de individuos tratados con Cd (trataminto1).Figuras 5 a 10.


Figura 5*: Imagen de TEM que muestra parte de una célula cortical en la que se ven numerosos gránulos electrodensos esparcidos en capas continuas a lo largo de la pared celular, incluida la zona del plasmalema. También se distinguen cloroplastos (c) y physodes (p) lo que indica la integridad celular.


Figura 6*: Imagen de TEM donde se ve parte de una célula subcortical, en ella los gránulos electrodensos se ven depositados mayoritariamente en la zona contigua al plasmalema, en gran concentración.

 

 


Figura 7*: Se muestra un espectro del análisis de dispersión de rayos x de los gránulos vistos en las figuras anteriores. Los picos corresponden a los principales elementos encontrados en esos gránulos: Carbono, Oxígeno, Azufre y Cadmio (el pico del Cobre es por interferencia de una rejilla del microscopio electrónico).


Figuras 8 a 10*: Son imágenes de espectroscopia electrónica con filtros especiales, se muestra la distribución de los gránulos en la pared celular adyacente al plasmalema (figura 8), la distribución del Cd (figura 9) y la distribución del S (figura 10).

 

Se puede ver que el patrón de manchas que muestran las imágenes en las tres figuras es el mismo. Por lo tanto con estos resultados y los resultados del espectro de rayos x se puede decir que el C, O, S y Cd colocalizan. Esto sugiere que el Cd se uniría a los grupos sulfatos y carboxilatos de la pared celular, dando lugar a la formación de los gránulos electrodensos.

Luego se analiza la ultraestructura de las algas crecidas bajo el tratamiento con Cd y Zn combinados (tratamiento2). Figuras 11 a 19.


Figura 11*: Imagen de TEM donde se muestra una célula cortical de la región subapical del talo con daños como rotura de la pared, por eso se ven los gránulos electrodensos en el citoplasma (punta de la flecha).

Se ven cloroplastos destruidos (S), y aunque no se distinga en la figura,

también hay destrucción de los physodes y los tilacoides están hinchados.


Figura 12*: Imagen donde se muestran dos células de la región media del talo, la cual no esta dañada.

Se distingue la disposición de los gránulos electrodensos principalmente en las zonas contiguas a la membrana plasmática. Se ven los physodes (p) intactos lo que demuestra la integridad celular.


Figura 13*: Ampliación de la zona de la pared celular donde se muestra la disposición de los gránulos en bandas concéntricas. Abajo a la derecha se ven manchas que corresponden a electrones difractados (punta de las flechas) lo que indica la naturaleza mineral de los gránulos.

 

 


Figura 14*: Espectro de rayos x de los gránulos electrodensos de la figura 13.

Se ve que los principales elementos que componen estos gránulos son: C, O, S, Cd y Zn

(el pico del Cu es interferencia del microscopio electrónico).

Figuras 15 a 19*: Imágenes de espectroscopia electrónica con filtros especiales. Se muestra la distribución de los gránulos en la pared celular (figura 15), la localización del S (figura 16), la del Cd (figura 17)

la del Zn (figura 18) y la del O (figura 19). Con todos estos resultados y los del espectro de rayos x se puede decir que el C, O, S, Cd y Zn colocalizan, lo que sugiere que el Cd y el Zn se unen a grupos sulfatos y carboxilos de la pared celular.

 

Para estudiar la abundancia y distribución de los principales grupos de polisacáridos polianiónicos en las diferentes regiones del talo de P.gymnospora, se aplican diversas técnicas citoquímicas a los individuos control.

TB (azul de toluidina) a ph 0,5: Diagnóstico para polisacáridos sulfatados.

TB a ph 4,4: Diagnóstico para poliscáridos sulfatados y carboxilados.

PATAg (Proteinato Acido Tiosemicarboxida-Plata): Diagnóstico para localizar hidratos de carbono que contienen azúcares con hidroxilos adyacentes libres, como en los alginatos de la pared celular.

RR (Rutenio rojo): Revela hidratos de carbono ácidos.

Ferritina Cationizada: Proteína cargada positivamente que actúa como marcador de cargas negativas sobre la superficie celular.

Los resultados de las técnicas citoquímicas se pueden seguir en las figuras 20 a 29.


Figuras 20 y 21:Resultados de la prueba TB a ph 0,5. Figura 20*: Corte transversal de la región media del talo de P.gymnospora. Se observa una coloración más intensa sobre la pared celular.

 

Figura 21*: Corte transversal de la región subapical del talo de P.gymnospora. La intensidad en el tono de las paredes es mucho menor comparada con la intensidad en las paredes de la región media del talo (figura 20).

 

Figuras 22 y 23*: Resultados de TB a ph 4,4, sobre las paredes de células de la región media del talo (figura 22) y de la región subapical del talo (figura 23).

 

Se observa el mismo patrón de intensidades que presentan las imágenes de las figuras 21 y 22 respectivamente.

De acuerdo a los resultados obtenidos de la técnica con TB a distintos ph se puede decir que los grupos sulfatados y carboxilados se encuentran distribuidos en las paredes celulares, y en mayor cantidad en las paredes de la región media del talo de P.gymnospora.

Figuras 24 y 25*: Resultados de la técnica con PATAg sobre las paredes celulares de P.gymnospora.
Figura 24: Corte transversal de la pared celular de la región media del talo.
Se puede ver un manchado sobre la capa fibrilar de la pared.
Figura 25: Corte transversal de la pared celular de la región subapical del talo del alga.
Se observa un débil manchado sobre la capa amorfa de la pared (arriba).

El análisis por PATAg revela que los hidratos de carbono con hidroxilos adyacentes libres, como los alginatos, están presentes de manera abundante en la capa fibrilar de la pared de células de la región media del talo.

Figuras 26 y 27*: Resultados de la técnica de RR sobre las paredes celulares de P.gymnospora.
Figura 26: Corte transversal de la pared de células de la región media del talo.
Se distingue un manchado sobre la capa fibrilar interna de la pared.
Figura 27: Corte transversal de la pared de células de la región subapical del talo.
Se ve un leve manchado sobre la pared.

 

Por los resultados de la técnica con RR, se puede decir que los hidratos de carbono ácidos son abundantes en la capa fibrilar de la pared celular de la región media del talo de P.gymnospora.



Figuras 28 y 29*: Resultados de la técnica con ferritina cationizada sobre las paredes de P.gymnospora.
Figura 28: Corte transversal de una pared de células de la región media del talo.
Se ve un manchado intenso depositado sobre la pared.
Figura 29: Corte transversal de la pared de células de la región subapical del talo.
Se observa un leve manchado sobre la pared.

Se puede decir que las cargas negativas distribuidas sobre la superficie celular se encuentran en mayor cantidad en las paredes de las células de la región media del talo que en las paredes de las células de la región subapical.

Los resultados de las pruebas citoquímicas determinan que hay diferencias en cuanto a la cantidad y composición de los polisacáridos polianiónicos de la pared celular a lo largo del talo de Padina gymnospora.

Conclusiones

En resumen se puede concluir:

  • Frente a altas concentraciones del catión Cd en el medio, Padina gymnospora lo acumula en las paredes celulares, en tres ordenes superior a la acumulación en algas de áreas no contaminadas.
  • Se esperaba que la competición entre Cd y Zn produjera la inhibición de la acumulación de alguno de los dos metales, pero no se observó. Incluso la presencia de Zn provoca una acumulación mayor de Cd en las paredes celulares de la zona media del talo. La concentración del Zn en las paredes es dos ordenes superior a la acumulación del mismo en algas crecidas en medios no contaminados, es decir sin exceso del cation.
  • Si bien los grupos sulfatos en la pared celular son los que presentan mayor afinidad a iones metálicos, no se descarta una posible contribución de los grupos carboxilatos, también en las paredes celulares, ya que son ricos en ácido urónico que une metales.
  • Tanto el Cd como el Zn se unen a los grupos polianiónicos (hidroxilos, carboxilos, grupos sulfatos) de los polisacáridos de las paredes celulares, dando origen a la formación de los gránulos que se observan al microscopio electrónico.
  • Hay diferencias en la cantidad y/o composición de los polisacáridos polianiónicos de la pared celular a lo largo del talo de Padina gymnospora. Estos polisacáridos se presentan en mayor cantidad en la capa fibrilar de la pared de la región media del talo, adyacente al plasmalema.
  • Altas concentraciones de Cd y Zn combinados producen daños morfológicos y ultraestructurales, principalmente en las células de la región apical del talo, donde la cantidad de polisacáridos polianiónicos es menor.
  • Por lo tanto la función de la pared celular de Padina gymnospora depende de la abundancia de polisacáridos polianiónicos y de la concentración de iones metálicos en el medio ambiente:
  1. Los grupos polianiónicos de la pared celular actuarían como una barrera iónica frente al "exceso" de Cd y Zn en el medio ambiente, reteniéndolos y evitando se entrada a la célula, lo que resultaría tóxico.
  2. La pared celular actuaría como un sistema de intercambio de iones metálicos cuando estos están en "bajas concentraciones en el agua de mar", ya que se vio que tanto el Zn como el Cd cumplen un rol biológico en las células.
  • Todas las fotografías de este artículo fueron originalmente publicadas en Phycología (2002) volume 41(1), 39-48 "Role of Padina gymnospora (Dictyotales, Phaeophyceae) cell walls in cadmium accumulation".

Srta. Paula Nannavecchia

www.ecogeneis.com.ar


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