Función de la pared celular de Padina gymnospora en la acumulación de cadmio
Padina gymnospora es un alga parda, su hábitat
es el mar, presentan además de clorofila a y c un pigmento
pardo dorado llamado fucoxantina, su pared contiene abundantes
alginatos. Su cuerpo vegetativo es simple sin partes
diferenciadas (talo).
El cadmio es un catión metálico divalente
que en altas concentraciones en el agua de mar
es tóxico.
Se han usado diversas especies de Padina en
estudios de polución por metales pesados
debido a su alta capacidad por captarlos y retenerlos.
Se han propuesto dos mecanismos para explicar la
habilidad de estas algas en la acumulación de metales que
están en exceso en el agua:
- Presencia de polisacáridos
polianiónicos en la pared celular. - Vesículas citoplasmáticas (physodes) en
cuyo interior hay polifenoles y tolueno. Se cree que estas
vesículas constituyen una defensa ante la
herbivoría.
La información que se tiene de trabajos
previos sobre P.gymnospora, es la siguiente:
En organismos aislados de zonas contaminadas con
Cd y Zn, se
vio que el nivel de asociación de estos cationes en los
physodes era bajo. Esto sugiere que las altas cantidades de Cd y
Zn encontradas en las algas del área contaminada no se
debe a la capacidad de fijación por los
polifenoles.
En otro trabajo se vio
que las algas crecidas en altas concentraciones de Zn, o
individuos adultos aislados de zonas contaminadas con Zn,
presentaban altas concentraciones de este metal en
gránulos dispersados a lo largo de las paredes celulares,
de zonas corticales y medulares del talo del alga. Lo mismo se
observó para el Cd, ya que algas recolectadas de zonas
contaminadas con Cd presentaban concentraciones de dicho metal
diez veces mayor que en las algas de áreas no
contaminadas.
Los grupos sulfatos y
carboxilos de la pared celular (grupos aniónicos)
actúan como los principales complejos captadores de iones
metálicos.
Cuando hay alta concentración de iones
metálicos en el medio acuático, la pared celular
del alga previene la entrada de estos al citoplasma, actuando
como un mecanismo de exclusión, una barrera
iónica.
A concentraciones bajas de iones en el medio,
quedó demostrada la alta capacidad de la pared celular de
las algas pardas en el intercambio iónico, el cual es 3,5
veces mayor que en las plantas
terrestres.
Se vio que el Cd tiene un rol biológico en las
algas, este es el de aumentar la actividad de la enzima Anhidrasa
Carbónica, una metaloenzima que normalmente requiere Zn
(este ultimo ítem se demostró en
Diatomeas).
El objetivo de
este trabajo es trazar la distribución del Cd en la pared celular de
Padina gymnospora, y correlacionar esos resultados con los
de la distribución del Zn y con la distribución y
abundancia de los polisacáridos
polianiónicos.
Se aislaron individuos de P.gymnospora de la
Bahía de Ribeira (Río de Janeiro, Brasil) de un
área no contaminada con metales. En el laboratorio se
las lavó con agua de mar y se las cepilló para
retirar las partículas adheridas y epífitas. Una
vez limpias se separaron en tres grupos de diez algas cada uno.
Uno de los grupos se lo colocó en una pecera de vidrio con agua
de mar (control), otro
grupo en otra
pecera con agua de mar y CdCl2 (tratamiento 1), y el grupo
restante en otra pecera con agua de mar, CdCl2 y Zn2SO4
(tratamiento 2). Las condiciones de crecimiento para el control y
los tratamientos fueron: fotoperíodo 12:12 horas luz/oscuridad,
temperatura
21±2°C.
El tiempo que se
las deja crecer bajo estas condiciones es de una semana, pero al
cabo de tres días se observó daño
celular en la zona apical del talo de las algas crecidas bajo el
tratamiento 2. Por lo tanto se tomaron muestras de algas de los
dos tratamientos a los tres días, y al séptimo
día de crecimiento solo se tomaron muestras de algas del
tratamiento 1 y del control.
Las muestras son procesadas de acuerdo a las
observaciones que se les quiere hacer. Se va a analizar la
composición, concentración y distribución de
los metales acumulados, y se va a estudiar la ultraestructura del
tejido del alga en diferentes regiones del talo, tanto de las
crecidas en agua de mar como las crecidas bajo Cd y Cd/Zn
combinados.
Primero se analiza la concentración de Cd y Zn en
los tejidos de
P.gymnospora crecida bajo las condiciones del control y
los dos tratamientos, al cabo de tres y siete días de
incubación.
Al tercer día las algas que recibieron el
tratamiento 1 presentaban acumulación de Cd (mgCd/mg peso
seco) en una concentración 2,6×10³ más elevada
que en el control.
Al séptimo día bajo el mismo tratamiento
las algas presentaban acumulación de Cd 5×10³veces
más elevada que el control.
En las algas que recibieron el tratamiento 2, al tercer
día de crecimiento se ve que el Cd acumulado es
3,6×10³ más elevado que en el control, y a su vez es
mayor que la concentración de Cd en las algas del
tratamiento 1 al mismo tiempo de incubación. No se
disponen muestras de algas a la semana de tratamiento 2, ya que a
los tres días comienzan a aparecer los daños en la
morfología
y en la ultraestructura de las células.
Esto se debe a las altas concentraciones de Cd y Zn
combinados.
Con respecto a la acumulación de Zn, se vio que
su concentración en algas bajo el tratamiento 2 era
10² veces más elevado que en el control.
Por todos estos resultados se puede decir que frente a
altas concentraciones de Cd en el medio marino,
P.gymnospora lo acumula en un orden tres veces superior a
la concentración que se ve en algas de aguas no
contaminadas con dicho catión. Además cuando hay
presente Zn combinado con Cd, la acumulación de este
último en Padina es mayor que si no lo
hubiera.
Luego se procede a observar la ultraestructura de
Padina gymnospora. Para ello se hacen cortes transversales
de las algas crecidas en las condiciones del control, y se aplica
microscopía electrónica de transmisión (TEM) .
Figuras 1 a 4.
Figura 1*: Imagen de TEM de
un corte transversal del talo del alga. Se pueden distinguir las
células corticales (c) y las células medulares
(m).
Figura 2*: Se ve en ampliación una
célula
cortical en la que se distingue el núcleo (n), physodes
(p) y los cloroplastos adyacentes a la membrana plasmática
(palsmalema).
Figura 3*: La imagen muestra en
detalle la pared celular de una célula
cortical.
La punta de la flecha indica la
cápsula de la pared, luego sigue una capa amorfa de fibras
(a) y más internamente en contacto con el plasmalema
está la capa fibrilar (f) de aspecto denso, en la cual las
fibras se disponen unas paralelas a otras.
F
igura 4*: Se muestra la pared celular de
células medulares. Ésta presenta una capa fibrilar
(f) adyacente al plasmalema y una capa amorfa (a).
Luego se estudia la ultraestructura de las
células de individuos tratados con Cd
(trataminto1).Figuras 5 a 10.
Figura 5*: Imagen de TEM que muestra parte de una célula
cortical en la que se ven numerosos gránulos electrodensos
esparcidos en capas continuas a lo largo de la pared celular,
incluida la zona del plasmalema. También se distinguen
cloroplastos (c) y physodes (p) lo que indica la integridad
celular.
Figura 6*: Imagen de TEM donde se ve
parte de una célula subcortical, en ella los
gránulos electrodensos se ven depositados mayoritariamente
en la zona contigua al plasmalema, en gran
concentración.
Figura 7*: Se muestra un espectro del análisis de dispersión de rayos x de los
gránulos vistos en las figuras anteriores. Los picos
corresponden a los principales elementos encontrados en esos
gránulos: Carbono,
Oxígeno, Azufre y Cadmio (el pico del
Cobre es por
interferencia de una rejilla del microscopio
electrónico).
Figuras 8 a 10*: Son imágenes
de espectroscopia electrónica con filtros especiales, se
muestra la distribución de los gránulos en la pared
celular adyacente al plasmalema (figura 8), la
distribución del Cd (figura 9) y la distribución
del S (figura 10).
Se puede ver que el patrón de manchas que
muestran las imágenes en las tres figuras es el mismo. Por
lo tanto con estos resultados y los resultados del espectro de
rayos x se puede decir que el C, O, S y Cd colocalizan. Esto
sugiere que el Cd se uniría a los grupos sulfatos y
carboxilatos de la pared celular, dando lugar a la
formación de los gránulos electrodensos.
Luego se analiza la ultraestructura de las algas
crecidas bajo el tratamiento con Cd y Zn combinados
(tratamiento2). Figuras 11 a 19.
Figura 11*: Imagen de TEM donde se muestra una célula
cortical de la región subapical del talo con daños
como rotura de la pared, por eso se ven los gránulos
electrodensos en el citoplasma (punta de la flecha).
Se ven cloroplastos destruidos (S), y
aunque no se distinga en la figura,
también hay destrucción de
los physodes y los tilacoides están hinchados.
Figura 12*: Imagen donde se muestran dos células de la
región media del talo, la cual no esta
dañada.
Se distingue la disposición de los
gránulos electrodensos principalmente en las zonas
contiguas a la membrana plasmática. Se ven los physodes
(p) intactos lo que demuestra la integridad
celular.
Figura 13*: Ampliación de la zona de la pared celular
donde se muestra la disposición de los gránulos en
bandas concéntricas. Abajo a la derecha se ven manchas que
corresponden a electrones difractados (punta de las flechas) lo
que indica la naturaleza
mineral de los gránulos.
Figura 14*: Espectro de rayos x de los gránulos
electrodensos de la figura 13.
Se ve que los principales elementos que
componen estos gránulos son: C, O, S, Cd y Zn
(el pico del Cu es interferencia del
microscopio electrónico).
Figuras 15 a 19*: Imágenes de
espectroscopia electrónica con filtros especiales. Se
muestra la distribución de los gránulos en la pared
celular (figura 15), la localización del S (figura 16), la
del Cd (figura 17)
la del Zn (figura 18) y la del O (figura
19). Con todos estos resultados y los del espectro de rayos x se
puede decir que el C, O, S, Cd y Zn colocalizan, lo que sugiere
que el Cd y el Zn se unen a grupos sulfatos y carboxilos de la
pared celular.
Para estudiar la abundancia y distribución de los
principales grupos de polisacáridos polianiónicos
en las diferentes regiones del talo de P.gymnospora, se
aplican diversas técnicas
citoquímicas a los individuos control.
TB (azul de toluidina) a ph 0,5:
Diagnóstico para polisacáridos
sulfatados.
TB a ph 4,4: Diagnóstico para
poliscáridos sulfatados y carboxilados.
PATAg (Proteinato Acido Tiosemicarboxida-Plata):
Diagnóstico para localizar hidratos de carbono que
contienen azúcares con hidroxilos adyacentes libres, como
en los alginatos de la pared celular.
RR (Rutenio rojo): Revela hidratos de carbono
ácidos.
Ferritina Cationizada: Proteína cargada
positivamente que actúa como marcador de cargas negativas
sobre la superficie celular.
Los resultados de las técnicas
citoquímicas se pueden seguir en las figuras 20 a
29.
Figuras 20 y 21:Resultados de la prueba TB a ph 0,5. Figura 20*:
Corte transversal de la región media del talo de
P.gymnospora. Se observa una coloración más intensa
sobre la pared celular.
Figura 21*: Corte transversal de la
región subapical del talo de P.gymnospora. La intensidad
en el tono de las paredes es mucho menor comparada con la
intensidad en las paredes de la región media del talo
(figura 20).
Figuras 22 y 23*: Resultados de TB a ph
4,4, sobre las paredes de células de la región
media del talo (figura 22) y de la región subapical del
talo (figura 23).
Se observa el mismo patrón de intensidades que
presentan las imágenes de las figuras 21 y 22
respectivamente.
De acuerdo a los resultados obtenidos de la
técnica con TB a distintos ph se puede decir que los
grupos sulfatados y carboxilados se encuentran distribuidos en
las paredes celulares, y en mayor cantidad en las paredes de la
región media del talo de P.gymnospora.
Figuras 24 y 25*: Resultados de la
técnica con PATAg sobre las paredes celulares de
P.gymnospora.
Figura 24: Corte transversal de la pared celular de la
región media del talo.
Se puede ver un manchado sobre la capa fibrilar de la pared.
Figura 25: Corte transversal de la pared celular de la
región subapical del talo del alga.
Se observa un débil manchado sobre la capa amorfa de la
pared (arriba).
El análisis por PATAg revela que los hidratos de
carbono con hidroxilos adyacentes libres, como los alginatos,
están presentes de manera abundante en la capa fibrilar de
la pared de células de la región media del
talo.
Figuras 26 y 27*: Resultados de la
técnica de RR sobre las paredes celulares de
P.gymnospora.
Figura 26: Corte transversal de la pared de células de la
región media del talo.
Se distingue un manchado sobre la capa fibrilar interna de la
pared.
Figura 27: Corte transversal de la pared de células de la
región subapical del talo.
Se ve un leve manchado sobre la pared.
Por los resultados de la técnica con RR, se puede
decir que los hidratos de carbono ácidos son abundantes en
la capa fibrilar de la pared celular de la región media
del talo de P.gymnospora.
Figuras 28 y 29*: Resultados de la técnica con ferritina
cationizada sobre las paredes de P.gymnospora.
Figura 28: Corte transversal de una pared de células de la
región media del talo.
Se ve un manchado intenso depositado sobre la pared.
Figura 29: Corte transversal de la pared de células de la
región subapical del talo.
Se observa un leve manchado sobre la pared.
Se puede decir que las cargas negativas distribuidas
sobre la superficie celular se encuentran en mayor cantidad en
las paredes de las células de la región media del
talo que en las paredes de las células de la región
subapical.
Los resultados de las pruebas
citoquímicas determinan que hay diferencias en cuanto a la
cantidad y composición de los polisacáridos
polianiónicos de la pared celular a lo largo del talo de
Padina gymnospora.
En resumen se puede concluir:
- Frente a altas concentraciones del catión Cd
en el medio, Padina gymnospora lo acumula en las paredes
celulares, en tres ordenes superior a la acumulación en
algas de áreas no contaminadas. - Se esperaba que la competición entre Cd y Zn
produjera la inhibición de la acumulación de
alguno de los dos metales, pero no se observó. Incluso
la presencia de Zn provoca una acumulación mayor de Cd
en las paredes celulares de la zona media del talo. La
concentración del Zn en las paredes es dos ordenes
superior a la acumulación del mismo en algas crecidas en
medios no
contaminados, es decir sin exceso del cation. - Si bien los grupos sulfatos en la pared celular son
los que presentan mayor afinidad a iones metálicos, no
se descarta una posible contribución de los grupos
carboxilatos, también en las paredes celulares, ya que
son ricos en ácido urónico que une
metales. - Tanto el Cd como el Zn se unen a los grupos
polianiónicos (hidroxilos, carboxilos, grupos sulfatos)
de los polisacáridos de las paredes celulares, dando
origen a la formación de los gránulos que se
observan al microscopio electrónico. - Hay diferencias en la cantidad y/o composición
de los polisacáridos polianiónicos de la pared
celular a lo largo del talo de Padina gymnospora. Estos
polisacáridos se presentan en mayor cantidad en la capa
fibrilar de la pared de la región media del talo,
adyacente al plasmalema. - Altas concentraciones de Cd y Zn combinados producen
daños morfológicos y ultraestructurales,
principalmente en las células de la región apical
del talo, donde la cantidad de polisacáridos
polianiónicos es menor. - Por lo tanto la función
de la pared celular de Padina gymnospora depende de la
abundancia de polisacáridos polianiónicos y de la
concentración de iones metálicos en el medio
ambiente:
- Los grupos polianiónicos de la pared celular
actuarían como una barrera iónica frente al
"exceso" de Cd y Zn en el medio ambiente,
reteniéndolos y evitando se entrada a la
célula, lo que resultaría
tóxico. - La pared celular actuaría como un sistema de
intercambio de iones metálicos cuando estos
están en "bajas concentraciones en el agua de mar", ya
que se vio que tanto el Zn como el Cd cumplen un rol
biológico en las células.
- Todas las fotografías de este artículo
fueron originalmente publicadas en Phycología (2002)
volume 41(1), 39-48 "Role of Padina gymnospora
(Dictyotales, Phaeophyceae) cell walls in cadmium
accumulation".
Srta. Paula Nannavecchia