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Terapia génica




Partes: 1, 2

Monografía destacada
  1. Conceptos básicos en genética
  2. Terapia génica
  3. Estrategias de terapia génica
  4. Aplicación de la terapia génica
  5. Terapia génica: perspectivas futuras y consecuencias
  6. Referencias

    1. ¿Qué significa genética?
  1. CONCEPTOS BASICOS EN GENETICA
  • La genética es la rama de la biología que trata de la herencia y la variación. Esta disciplina abarca el estudio de las células, los individuos, sus descendientes, y las poblaciones en las que viven los organismos. Los genéticos investigan todas las formas de variación hereditaria así como las bases moleculares subyacentes de tales características.
  1. ¿Cuál es el centro de la herencia de la célula?
  • Los organismos eucariotas se caracterizan por la presencia de un núcleo en el que se encuentra el material genético. En los procariotes, como las bacterias, el material genético se encuentra en un área no limitada pero reconocible, de la célula denominada nucleoide. En los virus, que no son auténticas células, el material genético esta enfundado en una cubierta proteica denominada cabeza o cápsula.
  1. ¿A que se refieren las siglas DNA Y RNA?
  • DNA Y RNA son abreviaturas (acrónimos) del ácido desoxirribonucleico y del ácido ribonucleico, respectivamente. Son los dos tipos de ácidos nucleicos que se encuentran en los organismos. Los ácidos nucleicos junto con hidratos de carbono, lípidos y proteínas, forman las cuatro clases principales de biomoléculas orgánicas que caracterizan la vida en nuestro planeta.
  1. ¿Cómo esta organizado el DNA para servir como material genético?
  • El DNA, aunque tiene una sola cadena en algunos virus, es normalmente una molécula de cadena doble organizada en doble hélice. En las moléculas de DNA se encuentran unidades hereditarias llamadas genes, que son parte de un elemento más grande, el cromosoma.
  1. ¿Qué es un gen?
  • En términos sencillos, gen es la unidad funcional de la herencia. En términos químicos es una cadena lineal de nucleótidos –bloques químicos que constituyen el DNA y el RNA-. Una definición más conceptual es considerarlo como una unidad de almacenamiento de información capaz de sufrir replicación, mutación y expresión. Es un elemento muy complejo.
  1. ¿Qué es un cromosoma?
  • En virus y en bacterias es más fácil considerar al cromosoma como una molécula grande, normalmente circular, de DNA, organizada en genes. En eucariotas el cromosoma es más complejo. Esta compuesto por una molécula de DNA lineal asociada a proteínas. Además de la abundancia de genes, los cromosomas tienen muchas regiones no génicas. No esta claro el papel que juegan algunas de estas regiones. El conocimiento sobre los cromosomas, como de los genes, esta en continua expansión.
  1. ¿Cuándo y como puede visualizarse un cromosoma?
  • Si los cromosomas se liberan de la cápsula vírica o de la célula bacteriana, se puede visualizar al microscopio electrónico. En los eucariotas los cromosomas son visualizables más fácilmente en el microscopio óptico, cuando están en meiosis o mitosis.

En estos procesos de división, el material que forma estos cromosomas están fuertemente espiralado y condensado, dando lugar a la característica de los cromosomas. Después de la división, este material llamada cromatina, se desespiraliza en la interfase y se puede estudiar mas fácilmente con el microscopio óptico.

  1. ¿Cuántos cromosomas tiene un organismo?
  • Aunque hay muchas excepciones, los miembros de muchas especies tienen un numero especifico de cromosomas, denominado el numero diploide (2n), presentes en una célula somatica. Mediante un cuidadoso análisis, se ve que estos cromosomas están en pareja, y cada miembro del par, cuando son visibles en la división celular, comparte casi la misma apariencia. Los miembros de cada par denominados cromosomas homólogos, son idénticos en cuanto a su longitud y a la localización del centrómero, el punto en que se unen las fibras del huso en la división.

También tienen la misma secuencia de lugares génicos, o loci, y se aparean en la meiosis. El numero de tipos diferentes de cromosomas de cualquier especie diploide es igual a la mitad del numero diploide, que se denomina el numero haploide (n). en algunos organismos como la levadura , son haploides alo largo de la mayor parte de su ciclo biológico y tienen solo una dotación de cromosomas.

Muchos organismos, especialmente muchos vegetales, se caracterizan por tener a veces mas de dos dotaciones haploides de cromosomas y se dice que son poliploides.

  1. ¿Cuáles son las causas de la variación genética?
  • Clásicamente, hay dos causas de la variación genética: las mutaciones cromosomitas y las mutaciones génicas o puntuales. Entre las primeras también llamadas aberraciones cromosómicas, se encuentra la duplicación, la delección y la reordenación de segmentos de cromosomas.

Las mutaciones génicas se producen por un cambio en la información química en el DNA, que en conjunto se denomina el genotipo de un organismo. Tal cambio puede ser una sustitución, duplicación o delección de nucleótidos, que componen esta información química. Las formas alternativas de un gen que se produce como consecuencia de la mutación, se denominan alelos. Frecuentemente, aunque no siempre, la variación genética da lugar a l cambio de alguna característica del organismo, denominada como fenotipo.

Una vez que forma parte del repertorio genético de un organismo, tal variante puede extenderse por toca la población mediante diversos mecanismos reproductivos.

  1. ¿Cómo se almacena la información genética en el DNA?
  • La secuencia de nucleótidos de un fragmento de DNA que constituye un gen está presente en forma de un código genético. Este código especifica la naturaleza química (la composición de aa.) de las proteínas, que son el producto final de la expresión génica. Se producen mutaciones cuando se altera la secuencia de nucleótidos.
  1. ¿Cómo esta organizado el código genético?
  • En el DNA hay cuatro nucleótidos distintos, diferenciándose entre si por uno de sus componentes, la base nitrogenada. El código genético es un triplete; por consiguiente cada combinación de tres nucleótidos constituye una palabra del código, casi todos los posibles tripletes especifican uno de los 20 aa., que son las unidades químicas que forman las proteínas.
  1. ¿Cómo se expresa el código genético?
  • La información codificada en el DNA se transfiere primero en el proceso de trascripción a la molécula de RNA mensajero (mRNA). Posteriormente el mRNA se asocia con un orgánulo celular, el ribosoma, en donde se traduce una molécula proteica.
  1. ¿Hay excepciones donde las proteínas no son el producto final de un gen?
  • Sí, por ejemplo, los genes que modifican el RNA ribosómico (rRNA), que forma parte del ribosoma, y los del RNA transferente (tRNA), que actúan en el proceso de traducción, se transcriben pero no se traducen. Por consiguiente, a veces el RNA es el producto final de la información genética almacenada.
  1. ¿Qué es la genética médica?
  • La genética media toma parte de todas las aplicaciones de la genética en la parte médica. Por tanto, incluye los estudios de la herencia de las enfermedades en las familias, el mapeo (o trazado del mapa) de los genes patológicos en sus localizaciones especificasen los cromosomas, el análisis de los mecanismos moleculares mediante los cuales los genes provocan la enfermedad, y el diagnostico y el tratamiento de la enfermedad génica.

Como consecuencia del rápido progreso de la genética molecular, recientemente se ha iniciado la terapia génica, que consiste en la inserción de genes normales en pacientes con el fin de corregir enfermedades genéticas. La genética médica también incluye el asesoramiento genético, la información de información relativa a los riesgos, el pronóstico y el tratamiento de sus pacientes y sus familias.

  1. ¿Por qué el conocimiento de la genética médica es importante para el médico actual?
  • Primero porque las enfermedades genéticas forman una gran parte de la carga patológica total, tanto en la población pediátrica como en la adulta. Esta proporción continuara aumentando a medida que se incrementen nuestros conocimientos sobre la base genética de las enfermedades; y segundo porque la medicina moderna esta poniendo énfasis creciente en la importancia de la información y la genética proporciona una base para el conocimiento de la constitución biológica fundamental del cuerpo, alcanzando con ella de una forma natural un conocimiento mas preciso del proceso patológico y en muchos casos este conocimiento puede dar lugar a la prevención real de la enfermedad, así como un tratamiento mas efectivo de esta.
  1. ¿Qué tipos de enfermedades genéticas existen?
  • Se calcula que cada ser humano tiene entre 50 mil y 100 mil genes diferentes. Las alteraciones de estos genes o la combinación de estas puede producir trastornos genéticos. Estas enfermedades se clasifican en varios grupos principales: 1) enfermedades cromosomitas, en las que se pierden, duplican o alteran de alguna forma cromosomas enteros o grandes segmentos de estos.

Esta enfermedad incluye el síndrome de Down y el síndrome de Turner. 2) enfermedades causadas por la alteración de un único gen (a menudo denominados trastornos "mendelianos" o transtornos por un único gen). Entre los Ej. conocidos se incluyen la fibrosis quística, la anemia de las células falciformes y la hemofilia. 3) transtronos multifactoriales, originadas por una combinación de causas genéticas múltiples y ambientales.

A este tipo de enfermedades pertenecen muchos defectos congénitos, como el labio leporino y/o la fisura palatina, así como muchas enfermedades del adulto, como cardiopatías y diabetes. 4) transtornos mitocondriales, es un numero relativamente escaso de enfermedades las ocasionadas por las pequeñas alteraciones del cromosoma mitocondrial (probablemente de todos estos tipos principales de enfermedades, sean los transtornos por un único gen los que han recibido mayor atención; estos transtornos se clasifican según el modo en que se heredan en las familias –herencia autosómica dominante, herencia autosómica recesiva y herencia ligada al sexo).

Mientras que algunos transtornos genéticos, especialmente las enfermedades genéticas simples, están muy determinadas por los genes, muchos otros procesos son resultado de muchos factores genéticos y no genéticos.

Podemos considerar que las enfermedades genéticas se distribuyen a lo largo de un continuum, con las enfermedades de la fibrosis quística y la distrofia muscular de Duchenne situadas en un extremo (muy determinadas por los genes) y las enfermedades del tipo del sarampión situadas en el otro extremo (muy determinadas por el entrono). La mayoría de las enfermedades mas frecuentes, como muchos defectos congénitos y enfermedades comunes como la diabetes, la hipertensión, las cardiopatías y las neoplasias, se sitúan en alguna parte del continuum.

Estas enfermedades estarían causadas por grados variables de influencias genéticas y ambientales.

Algunas enfermedades se diagnostican con más frecuencia en ciertos grupos étnicos. La fibrosis quística es especialmente común entre los individuos de raza blanca, mientras que la anemia de las células falciformes es más común entre los africanos.

Además, algunas enfermedades son mas frecuentes en los ancianos, P. Ej. el cáncer de colon, el carcinoma mamario y la enfermedad de Alzheimer están causadas, en parte, por genes y no suelen manifestarse hasta etapas tardías de la vida. La prevalecía calculada de estas enfermedades seria superior en una población mas envejecida.

  1. TERAPIA GENICA

2.1 Concepto

El concepto de terapia génica resulta de la observación de que ciertas enfermedades, entre ellas particularmente el cáncer, resultan de daños genéticos específicos (Felgner y Rhodes, 1991; Anderson, 1992; Roemer y Friedman, 1992; Pyeritz, 1992; Kart y Broker, 1994; Friedman, 1996). En principio, las patologías causadas por defectos monogenéticos podrían ser curadas mediante la inserción y expresión de una copia normal del gen dañado.

La terapia génica se sustenta en la tradición fármaco-quirúrgica de la medicina y se define como la aplicación de principios genéticos para el tratamiento de enfermedades humanas (Wolf y Lederberg, 1994).

Concretamente el término terapia génica unifica los principios de la farmacología con los de la genética, pues implica tácitamente el empleo de ácidos nucleicos como el agente farmacológico para el tratamiento de estados patológicos, con esto la terapia génica persigue modificar el genoma de las células somáticas transfiriendo copias normales de genes para que produzcan cantidades adecuadas del producto génico normal, cuya acción corregiría la enfermedad genética.

La estrategia general que se utiliza para la terapia génica no es más que una extensión de la técnica de selección clonal por complementación funcional. Primero, la función ausente en el organismo recipiente como consecuencia de la presencia de un gen defectuosos se introduce en un vector; luego, este vector se inserta en uno de los cromosomas recipientes y genera un organismo transgénico que se ha "curado" genéticamente. Esta técnica tiene un enorme potencial en los seres humanos porque nos ofrece la esperanza de corregir los desordenes genéticos.

  1. Aunque dentro de unos años será posible mediante la terapia génica reparar los errores que existen en un gen y causan la enfermedad, los objetivos actuales son más modestos. En primer lugar, la terapia génica trata de complementar o sustituir el defecto en la función de un gen defectuoso introduciendo otra copia normal de éste en las células.

    Por otra parte, en otras situaciones lo que se intenta es lo contrario, es decir, inhibir o bloquear el funcionamiento de aquellos genes cuya intervención contribuye al desarrollo de la enfermedad (por ejemplo los oncogenes que intervienen en el cáncer o los genes de virus que son necesarios para que estos se multipliquen en las células).

    Por último, existen otras posibilidades de acción de la terapia génica en la que lo que se busca no es suplir o inactivar la función de un gen, sino introducir la información que permita a la célula sintetizar una proteína que tenga un efecto terapéutico nuevo. Este es el caso de la transferencia de genes para estimular el sistema inmune para que actúe frente a tumores o enfermedades infecciosas, para que se acelere la reparación de heridas, fracturas o se produzcan nuevos vasos sanguíneos, etc.

  2. Objetivos de la terapia génica
  3. Requisitos y criterios para realizar estudios de terapia génica

Evidentemente la meta de los estudios que involucran la terapia génica como alternativa terapéutica es la posibilidad de la utilización en la clínica.

Para ello se requiere cumplir una serie de requisitos que justifiquen estos medios y que a continuación se mencionan:

  1. La patología no debe tener actualmente un tratamiento efectivo para su cura. Para llegar a una propuesta terapéutica sólida y científicamente viable, se requiere de una fuerte inversión en recursos humanos y económicos por un tiempo prolongado. Esto hace que el costo de una o varias líneas de investigación que conduzcan a la propuesta de alternativas terapéuticas para determinada patología sea elevada. La inversión de estos recursos debe ser justificada cuidadosamente y, por ello, es conveniente que la patología constituya un problema de salud pública que no cuente con cura actualmente.
  2. Se debe conocer en lo posible los detalles del efecto involucrado a nivel molecular. Es evidente que si se pretende intervenir a nivel molecular, es indispensable contar con el conocimiento detallado del efecto, o los efectos.
  3. Se debe tener un sustento científico sólido que justifique la intervención a nivel molecular. Para llegar a la aplicación clínica de la terapia génica, se debe contar con amplia y sólida evidencia científica que demuestre que la intervención a nivel molecular podría resultar en la mejoría de la salud el paciente, o en la resolución del problema en cuestión. Esto se hace evidente mediante la publicación de artículos científicos que forman el marco teórico que sustenta la intervención molecular. Los protocolos establecidos internacionalmente requieren de una secuencia lógica que incluye desde la comprobación de cambios celulares fenotípicos in vitro, generados por el ácido nucleico terapéutico en cuestión, así como la comprobación de los efectos terapéuticos en modelos animales, la caracterización toxicológica del procedimiento, hasta llegar finalmente a la propuesta de su aplicación en protocolos clínicos.
  1. Normas para recibir terapia génica

Las normas para recibir terapia génica están bien establecidas e incluyen varios requisitos:

  1. El gen debe estar aislado y debe estar disponible para la transferencia, normalmente por clonación.
  2. Debe haber un medio efectivo para la transferencia del gen. Por el momento, muchos ensayos utilizan vectores retrovíricos, aunque también se emplean otros métodos, como los vectores adenovíricos y las técnicas físicas y químicas.
  3. El tejido diana debe ser accesible para la transferencia genética. La primera generación de procesos de terapia génica utiliza glóbulos blancos o sus precursores como tejido diana.
  4. No debe haber ninguna forma de terapia efectiva disponible, y la terapia génica no debe dañar al paciente.

Actualmente se están tratando varias enfermedades hereditarias con terapia génica, como la inmunodeficiencia combinada grave (SCDI, del ingles severe combined inmunodeficiency), la hipercolesterolemia familiar, la fibrosis quística y la distrofia muscular, y se están desarrollando procesos para tratar otras enfermedades.

III. ESTRATEGIAS DE TERAPIA GENICA

En terapia génica se utilizan dos grandes estrategias actualmente: las estrategias ex vivo (consiste en extraer células de un paciente, modificarlas in vitro mediante un vector retrovírico y reimplantarlas en el organismo) y las estrategias in vivo (se trata de administrar el gen corrector al paciente en lugar de hacerlo a células en cultivo).

3.1Estrategias ex vivo

El tratamiento está basado en la obtención previa de células del paciente procedentes de un tejido u órgano de interés. A continuación se procede a la disgregación de las mismas y su mantenimiento en condiciones de cultivo de tejidos in vitro, en donde las células son posteriormente transfectadas por el "gen terapéutico" utilizando para ello un vector adecuado.

Las células transfectadas son seleccionadas en función de su capacidad para expresar el gen exógeno de forma estable y persistente. Las células así seleccionadas son amplificadas y recolectadas con el fin de ser reimplantadas al paciente.

También se puede utilizar líneas celulares alogénicas en aquellos casos en los que el órgano o tejido de interés no puede ser extraído con facilidad o que ofrece dificultada in vitro. El riesgo de rechazo es mínimo y, por ello, es la técnica más utilizada. Se usa fundamentalmente en el tratamiento de cánceres.

    1. Métodos no virales
  1. Métodos de transferencia genética in vitro
  1. Químicos: Fosfato cálcico.
  2. Físicos: Electroporación, Microinyección, Bombardeo de partículas.
  3. Fusión: Complejos ADN-liposomas.
  4. Endocitosis mediada por receptor: Complejos ADN-proteína, Complejos ADN-cápsida/ envoltura viral , Inmunoliposomas/liposomas destinados.
  1. Métodos virales
  1. Adenovirus
  2. Retrovirus
  3. Virus adeno-asociados
  4. Herpes virus
  1. El tratamiento está basado en la administración sistemática de la construcción génica de interés. Aunque el ADN puede ser administrado de forma directa lo habitual es recurrir a la ayuda de algún vector que facilite el proceso de transferencia del gen y permita la entrada y localización intracelular del mismo, de tal forma que éste resulte en un gen funcionante.

    Así mismo, es importante recurrir a vectores con destinos específicos dentro del organismo lo cual permite la entrega celular selectiva del gen en un determinado órgano o tejido, sin requerir para ello procedimientos traumáticos o quirúrgicos. Se emplea en células difícil de extraer e implantar nuevamente, como sucede en la mucoviscidosis.

    1. Métodos no virales
  2. Estrategias in vivo
  • Inespecíficos
  • DNA desnudo
  • Complejo DNA-liposomas
  • Específicos
  • Mediados por receptor
  • Complejos DNA-proteína
  • Inmunoliposomas/liposomas destinados
  1. Métodos virales
  • Retrovirus
  • Adenovirus
  • Virus adeno-asociados
  • Herpes virus

3.3 Introducción del transgén

Antes de explicar más detalladamente el modo de introducción del transgén y ver las enfermedades en las que se aplica la terapia génica, es conveniente definir de forma clara qué es un transgén, también denominado construcción genética.

Podríamos definirlo como un conjunto de uno o más genes y secuencias reguladoras que controlan la expresión de éste. Este transgén es el que tiene la función terapéutica, y es el que da la terapia génica. Hasta el momento no se ha realizado ninguna experiencia, a pesar de ser lo más idóneo en un tratamiento, debido a su dificultad. Actualmente la mayoría de las experiencias se están realizando en modelos animales, pero también existen ya ensayos clínicos en humanos.

3.3.1 Métodos directos

3.3.1.1 Sistemas químicos

A) Transferencia con fosfato de calcio

Se empezó a usar esta técnica en los años 60, pero fue en los 70 cuando se empezó a desarrollar suficientemente para tener buenas eficacias de transfección. Se basa en la precipitación del DNA exógeno y los iones de calcio, provocando que la célula, mediante endocitosis, introduzca el DNA en su interior.

La eficacia de transfección puede llegar al 10% de las células, aunque suele ser transitoria. No es una técnica que provoque toxicidad en las células pero la expresión del transgén es muy pequeña. Únicamente se usa en cultivos celulares, y por lo tanto su aplicación es "ex vivo".

3.3.1.2 Sistemas físicos

  1. Consiste en colocar el DNA mediante una inyección en el núcleo de las células. Al introducirlo directamente allí, evitamos la degradación citoplasmática y lisosomal. Se realiza mediante un micromanipulador, microscopio invertido que permite la visualización.

    Las células que sobreviven y han insertado el material genético presentan una alta eficacia de expresión del mismo. La técnica es muy laboriosa y necesita células aisladas para su realización. Este sistema se suele utilizar "ex vivo". En el caso de inyección en embriones se denomina terapia génica germinal siendo un método "in vivo".

  2. Microinyección
  3. Electroporación

Se introduce la construcción génica mediante un choque eléctrico a las células que provoca la formación de poros en sus membranas , por donde entra el transgén. Está especialmente indicado para células con una alta tasa de proliferación. Sin embargo, muchas células mueren al no soportar el choque eléctrico por lo que muchas veces no es la forma más indicada en algunos tipos celulares.

C) DNA desnudo

Consiste en la introducción del DNA en una solución salina o sérica, normalmente mediante inyección intramuscular, para conseguir la expresión del transgén. Se ha observado actualmente expresión en timo, piel, músculo cardíaco y músculo esquelético. No se conoce el mecanismo por el que llega a entrar a la célula aunque se postula que es a través del complejo del poro nuclear.

Tiene un bajo porcentaje de células transfectadas, no hay integración en el genoma y una vez inyectado no hay replicación en el genoma. Este es un sistema utilizado para la realización de la terapia génica "in vivo".

3.3.2 Métodos directos (mediados por vectores)

3.3.2.1 Vectores no virales

A) Liposomas

En 1965 se descubrió que los liposomas (bolsas rodeadas de una membrana lipídica a semejanza de una célula eucariota animal) eran capaces de hacer entrar DNA en la célula, pero hasta 1980 no se consiguió una eficacia de transfección adecuada. Existen dos tipos de liposomas: liposomas catiónicos y liposomas aniónicos.

B) Liposomas catiónicos

Se encuentran cargados positivamente por lo que interaccionan con la carga negativa del DNA. Existen muchos lípidos que se usan para formar estos liposomas e incluso se están probando mezclas de estos. Son recomendables en transfecciones "in vitro".

Las ventajas de los liposomas es que protegen de la degradación al transgén hasta su llegada al núcleo. La talla del DNA introducido en ellos no tiene límite. Podemos hacerlos llegar a tejidos específicos incluyendo receptores en la capa lipídica.
Sin embargo como desventaja presentan la baja eficacia de transfección, una expresión transitoria, cierto grado de toxicidad celular y pueden ser inhibidos por componentes séricos.

C) Biolística o Gene-gun

Consiste en el bombardeo de los tejidos con partículas de oro o tungsteno que llevan adheridas a ellas el DNA. El bombardeo se realiza mediante una descarga con helio como si fuera una pistola (de allí el nombre de la técnica).

La capacidad de penetración es limitada usándose en líneas celulares, epidermis, músculo e hígado. Su expresión es transitoria y en la zona de descarga se produce una gran muerte celular. Esta técnica puede realizarse "ex vivo" (en el caso de células animales) e "in vivo" (en el caso de células vegetales).

D) Vectores virales

Esta metodología comienza en 1968 cuando se demuestra que los virus son capaces de infectar células de mamífero. El desarrollo en 1989 de las células empaquetadoras (aportan la composición proteica que necesitan los virus para su funcionalidad ya que ésta ha sido eliminada del genoma viral) supuso un avance importante en esta metodología al aumentar la titulación en virus no patógenos. En todos los casos vamos a eliminar el mayor número de genes y secuencias al virus para que pueda captar el DNA exógeno. Los vectores virales pueden ser utilizados tanto "in vivo" como "ex vivo". Hasta el momento los virus más utilizados en terapia génica son los siguientes:

 - Retrovirus

Son virus ARN que tienen capacidad para integrar genes terapéuticos relativamente grandes (un máximo de 8 Kb). Necesitan de células empaquetadoras para su obtención. Se transfiere el DNA del virus mediante la técnica del fosfato de calcio a las células empaquetadoras. Posteriormente se realiza una segunda transducción en la cual introducimos la construcción génica de interés.

Los virus inyectados en el huésped integran su DNA en el genoma del huésped expresando así el gen que le hemos añadido. Como las proteínas del virus no son expresadas por el huésped, no tenemos una respuesta inmunitaria. Tienen una alta eficacia de transducción y también de expresión, siendo un sistema bien estudiado. 

Sin embargo, únicamente sirven para infectar células del huésped que se encuentran en división. Además los títulos de virus obtenidos hasta ahora son bajos y la integración en el genoma es al azar.

Existen también vectores basados en el virus del SIDA (HIV), cuyo genoma es más complejo pero con un funcionamiento similar al que hemos visto. Son los denominados lentivirus.

 - Adenovirus

Son una familia de virus ADN que causan infecciones en el tracto respiratorio humano. Se pueden llegar a insertar en ellos hasta 7.5 Kb. de DNA exógeno. Normalmente en terapia génica se utiliza el serotipo 5, aunque existen hasta 42 serotipos diferentes que infectan a humanos.

En este caso no se necesita la integración del material hereditario del virus en el del huésped para su replicación, por lo tanto tampoco el transgén será introducido en el genoma de la célula. Y por tanto tampoco necesitan que las células infectadas estén dividiéndose para su replicación.

La gran ventaja de usar un adenovirus como vector es la alta eficacia de transducción, al igual que la expresión de la construcción génica introducida, sin embargo ésta es transitoria (pocas semanas). Esto último obligaría a tratamientos periódicos lo cual es un inconveniente ya que los adenovirus producen respuesta inmune celular e inflamatoria.

 - Virus adenoasociados (VAA)

Son parvovirus, contienen DNA como material genético, y requieren la coinfección con un adenovirus para multiplicarse. Son vectores que combinan las ventajas de los retrovirales y los adenovirales. Su capacidad de integrar DNA exógeno es pequeña, sólo de 5 Kb.

Las principales ventajas son que los virus adenoasociados integran su DNA en la célula durante la replicación, por lo que la transducción (la cual es altamente eficaz) es estable en la célula diana. Además pueden infectar tanto a células en división como a las que no lo están (de gran importancia para la terapia génica "in vivo"). Los vectores AAV no están implicados en ningún tipo de enfermedad humana. Además el riesgo de una respuesta inmune está minimizado ya que no produce proteínas víricas.

Sin embargo existen también una serie de inconvenientes como que este tipo de vectores todavía no ha sido tan bien estudiado como los retrovirus y los adenovirus.

 - Herpesvirus

Son virus DNA cuyas células diana son las neuronas. Su complejidad y lo poco que todavía conocemos de esta familia de virus dificulta su utilización.

La gran ventaja es el gran tamaño de su DNA , que les permite aceptar varios genes terapéuticos, incluso podrían ir con sus propias regiones reguladoras.

Uno de los inconvenientes es que habría que eliminar las secuencias que codifican para las proteínas líticas del virus que causan la muerte de las células a las que infectan.

Como resumen de los vectores, podemos hacer una recopilación de las características que deberían presentar para obtener el vector ideal para su uso en terapia génica:
 - Permitir la incorporación y expresión regulada durante el tiempo conveniente, de uno o más genes necesarios para la aplicación clínica requerida
 - Ser específico en su transferencia génica
 - Ser irreconocible para el sistema inmune y no inducir respuesta inflamatoria
 - Ser estable y fácil de obtener

3.4.Otras estrategias utilizando ácidos nucleicos

Como ya hemos visto la terapia génica supone la manipulación de las células utilizando procedimientos destinados tanto a reparar e incorporar nuevos genes en la célula como también a bloquear e inhibir la sobreexpresión de los mismos con fines terapéuticos.

3.4.1 Oligonucleótidos antisentido

Los oligonucleótidos son secuencias cortas de ácidos nucleicos diseñados para unirse a secuencias específicas de ADN (formación de ADN triplex) o ARN (formación de heteroduplex ARN-ADN). Los oligonucleótidos antisentido son complementarios de secuencias específicas de un determinado ARN mensajero (secuencia sentido) .

La formación de un heteroduplex bicatenario sentido-antisentido bloquea la traducción del mensaje genético a proteína. Las estrategias antisentido tienen un gran potencial terapéutico para inhibir la expresión de genes en patologías tales como el cáncer, enfermedades autoinmunes y enfermedades infecciosas como el SIDA. Sin embargo, su utilización en clínica se ha visto limitada por su corta vida media en la circulación sistemática y su dificultad para acceder con actividad funcional al citoplasma y/o núcleo celular.

Más adelante en el apartado sobre aplicaciones sobre el cáncer se explicará este tipo de estrategia con mayor profundidad. 

3.4.2 Reparación genética mediante oligonucleótidos

Es una estrategia destinada a reparar genes cuya alteración es originada por una mutación puntual conocida y el objetivo es activar selectivamente los mecanismos celulares de reparación del ADN, el lugar de la mutación.

Para ello se diseñan oligonucleótidos específicos para secuencias genómicas adyacentes al lugar de la mutación, en cuyo extremo el oligonucleótido lleva un agente capaz de lesionar el ADN , mediante la formación de un enlace covalente con el nucleótido responsable de la mutación . La lesión selectiva del nucleótido mutado, desencadena el proceso celular de reparación del ADN que conduce a una normalización estructural y funcional del gen.

3.4.3 Ribozimas

El término ribozima ha sido introducido para describir moléculas de ARN con actividad enzimática. Se ha identificado una enorme variedad de motivos catalíticos de ribozimas, todos los cuales catalizan reacciones en sustratos de ARN. Estas reacciones llevan a cabo la rotura y ligación de las cadenas en sitios específicos.

Una característica común para todos los ribozimas es el requerimiento del ión de un metal con carga divalente, como el magnesio Mg+2 , que participa en la reacción química. Diferentes centros catalíticos de ribozima han sido incorporados en ARNs antisentido, de tal forma que le dan la capacidad de aparearse con un ARN diana que son sustratos para dichos centros cortándolos en sitios específicos. La actividad del centro catalítico de ribozima da el corte y destrucción del ARN diana. Aparejando el ribozima con el sustrato necesitaría poco tiempo para cortar el ADN diana, inactivándolo funcionalmente.

Una vez que la diana ha sido cortada, el ribozima puede disociarse de los productos cortados y repetir el ciclo de unión , rotura y disociación. La habilidad de los ribozimas para cortar dianas y después reciclarlas proporciona una ventaja sobre los ARN antisentido estándar; así actúa estequiométricamente, y no destruye la función del ARN diana.

Los ribozimas pueden ser producidos química, bioquímica o biológicamente, y algunas características de los oligodesoxinucleótidos antisentido tales como modificaciones químicas en la cadena o en las uniones entre nucleótidos, pueden ser incorporadas dentro de la molécula del ribozima sintético, así añade estabilidad a la molécula.

La especificidad de apareamiento de bases, puede ser usada para dirigir los ribozimas a sus dianas, de ese modo se sugirió desde etapas muy tempranas en el conocimiento de los ribozimas que estas moléculas únicas podrían ser creadas por ingeniería para reconocer o aparearse con bases del ARN diana de cualquier célula o virus.

Aunque se han hecho significativos progresos en la ingeniería de ribozimas, todavía hay un montón de cosas que deben ser aprendidas en orden para optimizar la función del complejo de los ribozimas en el comportamiento intracelular. Hasta estos días, la mayoría de experimentos intracelulares con ribozimas han sido llevados a cabo con los ribozimas denominados "cabeza-martillo" (hammerhead). De cualquier manera, otros motivos de ribozimas, tales como los llamados "horquilla" (hairpin), comparte mucho de los mismos requerimientos básicos para maximizar la eficacia intracelular. Así, la aplicación con éxito del ribozima "cabeza-martillo" debería proporcionar valiosas lecciones para aplicaciones de otros motivos de ribozimas.

La simplicidad del dominio catalítico de "cabeza-martillo" lo ha hecho popular en el diseño de ribozimas que actúan en trans. Los requerimientos en el sitio de corte son relativamente simples, y virtualmente cualquier UX (donde X es U, C o A) pueden ser dianas, aunque la eficiencia de la reacción de rotura varía entre diferentes combinaciones.

Por otro lado una versión de ingeniería del ribozima "horquilla", también llamado "grapa", ha sido capaz de cortar y reciclar múltiple variedad de dianas en trans. Aunque hay una serie de cambios en el sustrato para este tipo de ribozima. Entre éstos, incluye una G obligatoria junto al sitio de rotura en el 3'. Por otro lado, hay bastante flexibilidad en las combinaciones de secuencia guía-sustrato, lo que hace que tenga un potencial éxito contra una amplia variedad de ARN diana. Estos ARNs catalíticos son relativamente simples y pueden ser construidos para esconder secuencias que faciliten el apareamiento de bases frente a un ARN deseado.

Hay cinco áreas de investigación que podrían llevar a un aumento en la eficacia intracelular de los ribozimas. Estos son:

  • El reparto de ribozimas a células apropiadas.
  • La eficiente expresión de los ribozimas en estas células.
  • La co-localización de los ribozimas y el sustrato de ARN diana en el mismo compartimiento.
  • La especificidad de los ribozimas para reconocer y cortar sólo la diana del sustrato de ARN.
  • El aumento del reciclaje del sustrato mediado por los ribozimas.
  1. APLICACIÓN DE LA TERAPIA GENICA
  1. En Animales

El primer ejemplo de terapia génica en mamíferos fue la corrección de la deficiencia en la producción de la hormona de crecimiento en ratones. La mutación recesiva little (lit) produce ratones enanos. A pesar de que estos presentan un gen de la hormona del crecimiento aparentemente normal, no producen mRNA a partir de este gen.

El primer paso en la corrección del defecto consistió en la inyección en huevos lit/lit de unas 5 mil copias de un fragmento de DNA lineal de 5 Kb portador de la región estructural del gen de la hormona del crecimiento de la rata fusionado al promotor del gen de la metalotioneína de ratón (MP). La función normal de la metalotioneína es la destoxificación de los metales pesados, por lo que la región reguladora responde a la presencia de metales pesados en el animal. Los huevos inyectados se implantaron en hembras pseudopreñadas y se analizo la descendencia.

Aprox. el 1% de los ratones recién nacidos resultaron ser transgénicos, y aquellos a los que se les administraron metales pesados durante el desarrollo alcanzaron mayor tamaño.

En los mamíferos, el sitio de inserción del DNA introducido es muy variable y no suele encontrarse integrado en el locus homologo. Por ello, la terapia génica en la mayoría de los casos no implica una corrección genuina del problema original sino más bien un enmascaramiento del mismo.

Se ha generado una tecnología similar para generar variedades transgénicas de salmón del Pacifico con una tasa rápida de crecimiento y los resultados han sido espectaculares. Se microinyectó en huevos de salmón un plasmado portador del gen de la hormona del crecimiento regulado por el promotor de la metalotioneína (ambos derivados del salmón).

Una pequeña porción de los peces resultantes fue transgénica, a juzgar por los resultados positivos obtenidos por el escrutinio del DNA utilizando el plasmado como sonda. Estos peces por termino medio pesaron 11 veces más que los controles no transgénicos.

4.2 En humanos

Quizás, la aplicación más excitante y polémica de la tecnología de los transgenes es la que respecta a la terapia génica humana, es decir, el tratamiento y alivio de las enfermedades genéticas humanas mediante la adición de genes silvestres exógenos para corregir la función defectuosa de las mutaciones.

En los seres humanos puede utilizarse dos tipos básicos de terapia génica, la somatica y la germinal.

4.2.1 Terapia en células somáticas

La terapia génica en células somatica, que ha sido el núcleo central de la investigación de terapia génica en seres humanos, consiste en la introducción de genes normales en células somáticas humanas para tratar un trastorno especifico. Las células del paciente pueden extraerse y manipularse fuera del cuerpo (terapia ex vivo) o, en algunos casos, las células pueden tratarse mientras permanecen en el cuerpo (terapia in vivo).

Algunos tipos de células somáticas son más apropiadas para la terapia génica que otros. Los buenos candidatos deben ser fácilmente accesibles y tener una vida media prolongada en el organismo. En algunos sistemas de cesión genética son preferibles las células en proliferación ya que, en este caso, el vector portador del gen puede integrarse en el interior del DNA de la célula.

No todos los tipos de enfermedades son apropiadas para la terapia génica. Es probable que muchas enfermedades dominantes, en especial las causadas por mutaciones dominantes negativas, sean difíciles de tratar porque requerirían de un bloqueo del efecto del gen. La terapia génica alcanza sus objetivos con más facilidad en las enfermedades recesivas que implican la presencia de un producto genético defectuoso o perdido. En este caso, la inserción de un gen normal sustituiría al producto perdido.

Muchos trastornos recesivos de deficiencia enzimática pueden corregirse, en potencia, cuando se produce alrededor de 10% del nivel enzimático normal.

Existen muchos posibles métodos de introducción de genes en las células, incluyendo la fusión celular, la coprecipitación de fosfato cálcico (el compuesto químico altera la membrana celular, facilitando la introducción del DNA extraño), las microinyecciones y la fusión de liposomas. Los dos sistemas de cesión más utilizados son: los retrovirus y los adenovirus.

4.2.1.1 Vectores retrovirales

Los retrovirus son capaces de insertar copias de sus genomas en las células huésped después de retrotranscribir su RNA viral en el DNA. Los retrovirus se integran en el DNA del huésped con un lato grado de eficacia, lo que los convierte en una opción razonable como vector de cesión de genes. Los retrovirus deben ser modificados para que no se repliquen ni afecten al huésped. Esto se realiza utilizando técnicas de DNA recombinante que provocan la delección de la mayor parte del genoma retroviral, sustituyéndola por una copia normal de un gen humano, sus elementos reguladores y una señal de poliadenilacion (el material genético humano se denomina "inserto"). Los retrovirus pueden aceptar insertos de incluso 8 Kb.

Estos virus de replicación defectuosa se propagan en células empaquetadoras (a veces, denominadas células auxiliares) que compensan la maquinaria perdida de reproducción de los retrovirus. Este método permite la reproducción de múltiples copias de retrovirus que contienen el gen humano, pero que no pueden replicar a si mismas.

A continuación, los retrovirus que contienen las partículas se incuban con las células somáticas del paciente (P. Ej. linfocitos o células primordiales de la medula ósea humana). Los retrovirus modificados insertan el gen humano normal en el DNA de la célula huésped. De forma ideal, el gen normal codificara después un producto génico normal en las células somáticas del paciente. Este tipo protocolo ha tenido unos resultados iniciales favorables en el tratamiento de la deficiencia de adenosina desaminasa.

Aunque la terapia génica retroviral es muy prometedora, plantea varias dificultades:

  • Expresión transitoria o de bajo nivel. El producto génico puede expresarse en niveles subterapéuticos, a menudo inferiores al 1% de la cantidad normal. En parte, ello se debe a que tan solo algunas células diana incorporan con éxito al gen normal. Además, la inserción aleatoria del retrovirus en el genoma del huésped puede afectar la regulación del gen. La trascripción cesa a menudo al cabo de algunas semanas o meses.
  • Dificultades para alcanzar el tejido diana. Mientras que algunos transtornos sistémicos pueden ser relativamente fáciles de tratar modificando linfocitos o, quizá células primordiales de célula ósea, otros plantean grandes dificultades. P. Ej. a menudo es difícil alcanzar las neuronas afectadas responsables de enfermedades del sistema nervioso central.
  • Potencial de oncogénesis. Puesto que los retrovirus se integran al azar en el DNA del huésped, podría localizarse junto a un protooncogen, activarlo y ocasionar así una formación tumural. Para minimizar esta posibilidad se alteran los promotores retrovirales; hasta ahora no se han descrito otros casos directamente atribuibles a la inserción de retrovirus.
  • Necesidad de una regulación precisa de la actividad del gen. La regulacion precisa de la actividad del gen no es necesaria en algunas enfermedades (P. Ej. una expresión 50 veces superior de la adenosina desaminasa no tiene efectos clínicos importantes). Sin embargo, es fundamental para enfermedades como la talasemia, en la que el número de cadenas de alfaglobina y betaglobina debe ser muy equilibrado. Es difícil alcanzar una precisión utilizando la terapia génica retroviral.
  • Los retrovirus solo infectaran las células en división activa. Esta propiedad de los virus impide su utilización en células que no se dividen o de división lenta (P. Ej. las neuronas).

Se esta efectuando un gran esfuerzo de investigación para superar estos problemas. En especial, se están estudiando métodos de inserción dirigida de genes y están desarrollando técnicas que aumenten los niveles y la permanencia de la expresión del gen.

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