Caracterización microbiológica de lodo residual

1. Resumen
3. Materiales y
   Métodos
4. Conteo de los microorganismos
   del Fango digerido
5. Aislamiento de las bacterias
   degradadoras de hidrocarburos
6. Resultados y
   Discusión
7. Conclusiones y
   Recomendaciones
8. Referencias

Resumen

En la búsqueda de aceleradores del proceso de
biorremediación de suelos
contaminados por hidrocarburos
y residuos
sólidos petrolizados, se realizó la
caracterización microbiológica del lodo residual o
fango digerido de una planta de tratamiento de aguas residuales
urbanas, en el que se aislaron 11 cepas de bacterias
aerobias, de éstas se identificaron 5 cepas Gram
negativas, que resultaron ser géneros comúnmente
aislados de suelos contaminados por hidrocarburos y residuos
sólidos petrolizados. De los microorganismos aislados, 7
cepas fueron capaces de utilizar todas las fracciones del
petróleo como única fuente de
carbono y
energía, lo que hace factible la utilización del
fango digerido caracterizado como fuente de microorganismos
degradadores de hidrocarburos en el proceso de
biorremediación de residuos sólidos petrolizados y
de suelos impactados por hidrocarburos, además del aporte
de nutrientes que presenta su utilización.

Palabras claves: lodo residual, fango digerido,
microorganismos, cepas, biorremediación,
hidrocarburos.

Introducción

Un lodo residual es una materia
orgánica húmeda con una cierta cantidad de
aditivos, entre los cuales hay algunos que resultan de interés
aprovechar por su importancia como nutrientes del suelo y otros
cuya presencia es indeseable por su posibilidad de contaminación.

El fango digerido o lodo residual de las plantas de
tratamiento de aguas residuales domésticas constituyen una
fuente importante de nutrientes y de microorganismos. Las
características físicas y químicas de los
lodos varían en función de
su origen, urbana o industrial, y del tipo de proceso al que han
sido sometidos. (Ameneiros, 2003)

Actualmente no se encuentra una disposición
ambientalmente segura para estos desechos en Cuba y en
países del área del Caribe, donde se
incrementarán los volúmenes de éstos
residuos en los próximos años por la
instalación de nuevas plantas.

Según estudios preliminares reportados por
algunos autores (Acosta, Infante y otros, 1995)(Álvarez y
col., 2004), se obtienen buenos resultados en el proceso de
Biorremediación de suelos impactados por hidrocarburos
como aceleradores del proceso y como fuente de nutrientes para el
desarrollo y
crecimiento de los microorganismos.

Es objetivo del
presente trabajo
caracterizar e identificar los microorganismos presentes en el
fango digerido o lodo residual de la planta de tratamiento de
aguas residuales urbanas Río Quibú en Cuidad de la
Habana, con vistas a su posible utilización como
acelerador en el proceso de biorremediación.

Materiales y
Métodos

La muestra de lodo
residual o fango digerido fue tomada puntualmente en la descarga
final de lodos residuales o fangos digeridos hacia el lecho de
secado de la planta de tratamiento de aguas residuales urbanas
Río Quibú. La muestra fue envasada en frascos
estériles de 1 litro de capacidad y conservadas en
frío hasta su utilización en el laboratorio de
microbiología (ISO
10381–6, 1993).

Conteo de los
microorganismos del Fango digerido.

• Conteo de bacterias aerobias, hongos,
  levaduras y bacterias degradadoras

Se pesaron 10 g del Fango digerido y se
añadió a un Erlenmeyer de 250 ml que
contenía 90 ml de medio Solanas (Solana, A.M.1985) y unas
gotas de tween 80 para facilitar la homogenización, se
incubó en zaranda termostatada a 150 rpm durante 30 min.
Se tomó del sobrenadante y se realizaron diluciones
seriadas en solución salina hasta 10 -8 (ISO
6887, 1993). Las diluciones se sembraron en placas por duplicado
en medio de Agar Triptona soya para el conteo total de bacterias
aerobias (ISO 4833:1991). Paralelamente las diluciones se
sembraron en placas con Agar petróleo
(Finnerty, 1983) para el conteo total de bacterias degradadoras
de hidrocarburos. Se realizaron inoculaciones en Agar Malta con
un 5% de Cloruro de sodio (BIOCEN, 2001) para el conteo de hongos
filamentosos y levaduras (ISO 7954: 1987).

Los resultados se reportan como unidades formadoras de
colonias (células)
por gramo de suelo según la fórmula
siguiente:

donde:

Cs: número de unidades formadoras de colonias en
el volumen de
referencia elegido (UFC/gcrudo)

Vs: Volumen de referencia escogido para expresar la
concentración de microorganismos en la muestra
(ml)

N: suma de todas las colonias contadas

n1, n2,…, ni:
número de placas por cada dilución

F1, F2……Fi:
dilución usada en cada volumen

V1, V2…..Vi: volumen
usado en la dilución (ml)

Aislamiento de las
bacterias degradadoras de hidrocarburos

Las colonias más representativas crecidas en Agar
petróleo se sembraron por agotamiento en medio Agar
triptona soya y se incubaron a 37 o C por 24 h. Para
la caracterización cultural se observaron las colonias al
estereoscopio y para definir las características
morfológicas tintoriales se realizó la
tinción de Gram. (Bergey´s Manual,
1974)

• Caracterización de las cepas
  degradadoras

Degradación de Resinas y Asfaltenos: Para
determinar la capacidad de estas cepas de degradar crudo pesado
se añadió 1% de residuo de destilación mayor que 347 oC y
residuo de destilación mayor que 465 oC de
Crudo Seboruco en tubos con 9 ml del medio Solanas. El medio se
inoculó con una asada del cultivo de la cepa, los tubos se
incubaron durante 21días a 37 0C con un
indicador de crecimiento.

Hidrocarburos Alifáticos: Para la
determinación de la capacidad de utilización de
fracciones de hidrocarburos alifáticos del petróleo
como única fuente de carbono se añadió 1 %
de queroseno y 1% de Isooctano por separado en tubos con 9 ml de
medio Solana. El medio se inoculó con una asada del
cultivo de la cepa y se incubaron durante 21 días a 37
0C con indicador de crecimiento.

Hidrocarburos Aromáticos: Para la
determinación de la capacidad de utilización de
fracciones de hidrocarburos aromáticos se utilizó
1% de Naftaleno (poliaromático) y 1% de Tolueno
(Aromático alquilado) en medio basal Solanas por separado.
El Naftaleno, como es un sólido insoluble en agua, se
disolvió primero en acetona y luego se
añadió al medio. El medio se inoculó con una
asada del cultivo de la cepa y se incubaron durante 21
días a 37 0C con indicador de
crecimiento.

Identificación de las cepas degradadoras: A
partir de cultivos frescos de las cepas que crecieron en todos
los medios de
caracterización se inocularon los Kit de
identificación (API 20 NE, 2002) para la
identificación de microorganismos Gram negativos no
enterobacterias.

Resultados y
Discusión

• Conteo y aislamiento de bacterias degradadoras del
  Lodo Residual o Fango Digerido de la planta de tratamiento de
  aguas residuales del Río Quibú.

En la tabla 1 se muestra el resultado de la
caracterización microbiológica del Fango digerido,
conteo total de las colonias de bacterias aerobias, hongos y
levaduras y microorganismos degradadores expresados en
UFC/g.

Tabla. 1. Caracterización
microbiológica del Fango digerido, expresados en
UFC/g.

El número de bacterias aerobias alcanzó
valores de
109 UFC/g , los hongos y levaduras hasta
105 UFC/g y los microorganismos degradadores de
hidrocarburos resultó elevado con valores que alcanzan
hasta 106 UFC / g. Estos resultados se corresponden
con la amplia flora característica de los suelos (Bergeys,
1984).

Tabla. 2. Caracterización
física –
química
del Fango digerido. (Álvarez y col., 2004)

HCTP: hidrocarburos totales del
petróleo

Este sustrato constituye una fuente rica de materia
orgánica con altos contenidos de nitrógeno,
fósforo y potasio donde aparece un por ciento elevado de
grasas y
aceites e hidrocarburos totales disueltos en el sedimento con
alta biodisponibilidad, además de poseer un pH adecuado
para el desarrollo y crecimiento de una abundante microbiota
adaptada al consumo de
crudo y sus derivados como única fuente de
carbono.

Del Conteo total de bacterias aerobias se aislaron
11cepas aparentemente diferentes. En la tabla 3
aparecen las características culturales
morfológicas de cada una de ellas.

Según se aprecia en la tabla 3, las bacterias
presentaron morfología
colonial diversa, lo cual está en concordancia con la
riqueza nutricional del lodo residual de donde provienen. Las
bacterias aisladas resultaron ser 5 cocobacilos positivos, 3
cocobacilos negativos, 2 bacilos negativos y 1 bacilo
positivo.

Tabla3. Características
culturales y tintoriales de las cepas aisladas

El estudio microscópico mostró formas
bacilares, cocobacilos, Gram positivos y negativos,
márgenes lisas e irregulares, convexas y planas, de
colores verdes,
amarillas y rosadas.

Caracterización de las cepas aisladas
degradadoras de hidrocarburos

En la tabla 4 se reportan los resultados de la
caracterización de las cepas aisladas del lodo residual o
fango digerido utilizando como fuente de carbono y energía
las diferentes fracciones del petróleo.

Tabla 4. Resultados de la
caracterización de las cepas aisladas del residuo con los
diferentes hidrocarburos.

Las cepas LR-1, LR -2, LR -3, LR -5, LR -7c, LR -9 y LR
-13 crecieron en todos los medios con los diferentes sustratos
como única fuente de carbono y energía (Tabla 4),
estas bacterias tuvieron un óptimo crecimiento al final de
la incubación con turbidez y cambio de
color (Fig. 6),
siendo capaces de degradar todas las fracciones de hidrocarburos
a la que fueron expuestas, por lo que constituyen cepas
promisorias para ser utilizadas con diferentes fines degradativos
en suelos impactados por hidrocarburos y donde el conteo de
microorganismos degradadores de hidrocarburos se encuentre por
debajo del rango establecido, entre 10 3 y 10
4 UFC/g, para aplicar el proceso de
Biorremediación.

La versatilidad nutricional de las cepas identificadas
en estos desechos resulta de significativa importancia, debido a
que en el mundo, son pocas las especies microbianas reportadas
con potencialidades para degradar todas las fracciones de
hidrocarburos simultáneamente. Algunos autores, (Whyte,
Bourbonnié y Creer, 1997), reportan que la mayoría
de las cepas degradadoras de hidrocarburos pueden mineralizar los
compuestos poliaromáticos o alifáticos pero no
ambos, sugiriendo que estas dos vías pueden ser
excluyentes en muchos casos. Sin embargo, en muchas bacterias se
han observado los genes que codifican para las enzimas
alcano-monooxigenasa y catecol 2,3 dioxigenasa, lo cual indica
que las vías degradativas para alcanos e
hidrocarburos aromáticos simples alquilados pueden
encontrarse simultáneamente.

Las cepas de bacterias aerobias aisladas e identificadas
del lodo residual o fango digerido de la Planta de Tratamiento de
aguas residuales urbanas del Río Quibú capaces de
degradar todas las fracciones de hidrocarburos, pueden servir
como materia prima
para la obtención de bioproductos (inóculos), para
ser empleados en suelos contaminados por hidrocarburos y donde no
sea posible la aplicación del proceso de
Biorremediación por la técnica de la
bioestimulación de los microorganismos autóctonos
(Ej. manglares).

Conclusiones y
Recomendaciones

El lodo residual o fango digerido caracterizado
constituye una fuente importante de nutrientes y microorganismos
degradadores de hidrocarburos, por lo que es promisoria su
utilización en el proceso de biorremediación de
residuos sólidos petrolizados y de suelos impactados por
hidrocarburos.

Se identificaron 5 cepas Gram negativas, resultando ser
géneros comúnmente aislados de suelos contaminados
por hidrocarburos y residuos sólidos
petrolizados.

Del total de las bacterias aisladas del lodo residual
estudiado, siete resultaron las de mejores resultados
biodegradativos utilizando al crudo y sus derivados como
única fuente de carbono y energía. Las cepas
denominadas LR-1, LR -2, LR -3, LR -5, LR -7c, LR -9 y LR -13,
son promisorias para su aplicación en diferentes procesos de
Biorremediación.

Las cepas aisladas e identificadas del lodo residual o
fango digerido pueden ser utilizadas como materia prima para la
obtención de bioproductos (inóculos), que pueden
ser empleados en el proceso de biorremediación.

Se recomienda evaluar la factibilidad de
utilización de los lodos residuales o fangos digeridos de
las plantas de tratamiento de aguas residuales domésticas
e industriales como fuentes de
nutrientes y de microorganismos biodegradadores de hidrocarburos
en el proceso de Biorremediación de residuos
sólidos petrolizados y suelos contaminados por
hidrocarburos.

Se debe estudiar la posibilidad de obtención de
bioproductos y biosurfactantes a partir de las cepas aisladas e
identificadas del lodo residual.

References

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    Microbiol. 62(9): 3719-3723.

José Alfonso Álvarez
González

Gisela Novoa Rodríguez

Silvia Acosta Díaz

Ricardo Campos Rodríguez

Miguel A. Díaz Díaz

Sandra Millar Palmer

Cristina Laffita Rivera

Centro de Investigaciones
del Petróleo, Washington # 169, Cerro, Ciudad de la
Habana, Cuba.