Evaluación de la técnica más apropiada para la diferenciación

Antecedentes
históricos
Caracterización de
entamoeba histolytica y entamoeba
dispar
Ciclo de
vida
La
amibiasis
Técnicas empleadas para
la diferenciación de entamoeba histolytica y
entamoeba dispar

INTRODUCCIÓN

La amibiasis es una enfermedad que se presenta en el
10% de la población mundial aproximadamente. Esta
se produce por la presencia de Entamoeba histolytica, la
cual es idéntica morfológicamente a Entamoeba
dispar (no patógena). La amibiasis invasora resulta
en aproximadamente 50 millones de casos y hasta 100.000 muertes
por año. Por esta razón es importante realizar
una revisión bibliográfica acerca del protozoo
causante de esta enfermedad y las técnicas
empleadas para diferenciar estas dos especies.

Actualmente se están empleando técnicas
moleculares para estudiar la ecología de una
gran variedad de organismos.

Estas técnicas representan las herramientas
importantes para el estudio de la sistemática, genética de la población,
biogeografía y ecología de parásitos con
la capacidad de identificar los organismos de interés
con precisión. Además, se utiliza para el
diagnóstico eficaz y detección de
parásitos y las enfermedades
parasitarias. En el caso de la diferenciación entre
especies, necesario para el diagnostico de la amibiasis ha sido
importante la aplicación de técnicas de PCR,
ELISA, ISOENZIMAS, para la diferenciación entre E.
dispar y E. histolytica.

ANTECEDENTES
HISTORICOS

En 1875, Entamoeba histolytica, fue reconocida
por Losch en un paciente con disentería, sin establecer
la relación causa-efecto entre la amiba y los
síntomas del paciente. (Chac Bonilla, 2001).
En 1887, Kartulis demostró por primera vez su
papel como patógeno.
En 1903, Schaudinn introduce el nombre de la
especie.
En 1925, Emilé Brumpt propuso el concepto de que
E. histolytica comprendía dos especies
morfológicamente idénticas, una no
parásita (denominada E. dispar) y otra
parásita responsable de la amibiasis invasiva (E.
dysenteriae) por lo cual era posible la existencia de
portadores asintomáticos. Sin embargo, este concepto no
fue ampliamente aceptado. (Chac Bonilla, 2001).
En 1961 Hoare afirmó la existencia de dos
tipos diferentes de amiba histolítica: "Es seguro que al
lado de las cepas activamente patógenas, en los
países cálidos, existen en todas las regiones del
globo, cepas constantemente avirulentas que son totalmente
inofensivas para el hombre en
regiones templadas." (Chac Bonilla, 2001).
En 1978, Sargeaunt empezó a analizar el
patrón electroforético de las isoenzimas de la
hexoquinasa de E. histolytica, estableciendo su gran
valor para
el estudio de la relación hospedador-parásito.
Logró determinar dos tipos de patrones
electroforéticos, los cuales denominó: zimodemos
parásitos" y "zimodemos no parásitos". (Chac
Bonilla, 2001).
En 1982 postula (dado los hallazgos encontrados
durante su investigación) que en la amibiasis
estaban involucradas dos especies, una parásita y otra
no parásita, y que la propuesta de Brumpt debía
ser aceptada. (Chac Bonilla, 2001).
Los estudios de Sargeaunt, junto con otros que se
realizaron en la época, permitieron llegar a la
conclusión de que la amiba clínicamente conocida
como E. histolytica en realidad comprende dos especies
morfológicamente idénticas: E. histolytica
responsable de la enfermedad y E. dispar que es un
comensal intestinal. (Chac Bonilla, 2001).
Estudios genéticos recientes han demostrado
una divergencia genética entre las dos amibas, hallazgo
que constituye una evidencia irrefutable de la existencia de
dos especies diferenciables por métodos
bioquímicos, inmunológicos y genéticos.
Esta redefinición de la clínica E.
histolytica revoluciona el
conocimiento que se tenía de la relación
hospedador-parásito. (Chac Bonilla, 2001).

2.
CARACTERIZACION DE Entamoeba histolytica y Entamoeba
dispar

La Entamoeba histolytica es uno de los
eucariotes más primitivos, clasificado de la
siguiente

Las Entamoebas se caracterizan por presentar cariosoma
compacto, pequeño y cromatina distribuida por la parte
interna de la membrana nuclear.. La especie histolytica
se reconoce por tener el cariosoma en el centro del
núcleo y la cromatina en gránulos de
tamaño uniforme y regularmente dispuestos (Chac Bonilla,
2001). Morfológicamente, las Entamoebas se definen como
microorganismos unicelulares que pueden existir en dos formas:
trofozoito y quiste.

Trofozoito

Forma móvil del parásito, que ejerce la
acción patógena. Es un anaerobio
facultativo de 10-40m m de
diámetro, que emite un pseudópodo y puede
detectarse en las deposiciones recién emitidas (Chac
Bonilla, 2001). Es extraordinariamente pleomórfico, ya
que su aspecto y movilidad están muy influidos por los
cambios de pH,
potencial redox y osmolaridad. Se multiplica por fisión
binaria y es muy sensible al jugo gástrico y a los
agentes externos. Su hábitat comprende la luz y pared del
colón, y especialmente sigma y recto. El trofozoito se
nutre por fagocitosis y digestión intracelular de
nutrientes a expensas de los tejidos
disueltos y hematíes, y se ayuda de los
pseudópodos. (Pumarola.; Rodríguez Torres; Garcia
Rodríguez; Piedrola Angulo,1987)

Las formas mas pequeñas corresponden a las
<<no invasivas>> y se encuentran habitualmente en
los casos asintomático . Las de mayor tamaño son
las <<formas invasivas>> que a diferencia de los
anteriores no aparecen en la luz intestinal y poseen en el
endoplasma restos celulares y hematíes. (Pumarola, et
al.,1987)

La pared periférica del trofozoito, el
ectoplasma, es hialino y retráctil. Los
pseudópodos son prolongaciones del ectoplasma y
proporcionan una movilidad a parásito de aproximadamente
50 um/seg. Carece de algunos organelos que se encuentran en la
mayoría de los eucariontes como son: citoesqueleto
estructurado, microtúbulos citoplasmáticos,
mitocondrias y sistema de
lisosomas primarios y secundarios (La Entamoeba
histolytica y la Amibiasis, ). El núcleo, que
sólo es visible con tinciones, es excéntrico,
redondo y posee un pequeño cariosoma central. La
cromatina aparece repartida periféricamente de forma
uniforme y adosada a la membrana nuclear, y contiene un
pequeño cariosoma central puntiforme.

Fig. 1. A. Dibujo
perfecto de un trofozoito B. Dibujo del quiste de E.
histolytica (Fuente: Intestinal Protozoa, 2005)

Quiste

Los quistes son formas redondas o ligeramente ovaladas
de 8 a 20m m de diámetro, las
cuales, en muestras sin teñir, se pueden ver como
cuerpos hialinos con pared refringente. Su citoplasma es
incoloro permitiendo la visualización de los llamados
cuerpos cromatoides (que contienen principalmente ácidos
nucleicos y fosfatos) y nucléolos en número de
uno a cuatro. Posee una pared de 0.6 um y es resistente al jugo
gástrico, factores ambientales externos, y cifras
habituales de cloro del agua. (La
Entamoeba histolytica y la Amibiasis ).

Los quistes jóvenes poseen 1 o 2
núcleos, algunos cuerpos cromatínicos y vacuolas
de glucógeno. Cuando el quiste madura, posee cuatro
núcleos y desaparecen los cuerpos cromatínicos .
Solo los quiste maduros son infecciosos . (Pumarola, et
al.,1987)

Los quistes son una forma de resistencia de
la E. histolytica, ya que pueden sobrevivir fuera del
huésped por semanas o meses en un ambiente
húmedo. Es sumamente resistente a las condiciones del
medio y a los jugos del tubo digestivo. (La Amibiasis,
2005)

2.1 CARACTERISTICAS BIOLÓGICAS QUE
DISTINGUEN E. histolytica de E.
dispar (Ackers ,2002).

Patrones de isoenzimas,
particularmente la hexocinasa.
Epitopos específicos,
reconocidos por la reacción con varios anticuerpos
monoclonales.
Diferentes secuencias en el rDNA del
episoma.
Diferencias significativas en las
secuencias entre genes homólogos (2-18%).
Un número pequeño de genes, por ejemplo
ariel (Willhoeft et al 1999 citado por Ackers,
2002) y cp5 (Bruchhaus et al 1996; Willhoeft
et al 1999 citados por Ackers, 2002) aparecen mas lejos
en E. histolytica.
Ha sido mas fácil adaptar
E. histolytica al crecimiento axénico. Los
cultivos axénicos de E. dispar son
extremadamente difíciles y solo se ha logrado una cepa
(Clark 1995, citado por Ackers, 2002).
Al realizar una examinación con el microscopio
electrónico de los cultivos axénicos de ambas
especies se aprecian diferencias significativas en la
superficie (Clark et al 2000, citado por Ackers, 2002).
Esto puede relacionarse a la evidente carencia superficial de
lipofosfoglicano (LPG) de E. dispar.(Bhattacharya
et al 2000, citado por Ackers, 2002).

CICLO DE
VIDA

El ciclo de
vida es relativamente sencillo. La infección se
inicia con la ingesta de quistes provenientes de agua o
alimentos
contaminados con materia
fecal. En el intestino delgado ocurre la llamada
exquistación, que consiste en liberación de una
amiba de 4 núcleos, metaquiste que finalmente se divide
en 8 trofozoitos.

Los trofozoitos se dirigen al intestino grueso, donde
alcanzan el colón , lo colonizan, ahí se
alimentan de bacterias y
restos celulares (La Entamoeba histolytica y la
Amibiasis ). Allí ellos maduran, transformándose
en los llamados "trofozoitos de la luz intestinal", se dividen
por fisión binaria, se eliminan con las heces y se
destruyen en el medio
ambiente.

Otras veces, se transforman en quistes inicialmente
uninucleados, que después maduran y son igualmente
eliminados por las heces . En algunas ocasiones, la
maduración de del quiste tiene lugar en el medio
externo.

Fig 2: Ciclo de vida de E.
histolytica y manifestaciones clínicas de
infección en humanos. (FUENTE: Huston, Haque, and
Petri, 1999)

Ya en el medio ambiente, los quistes son impulsados
por el viento y contaminan vegetales, frutas y agua
potable, y cuando son consumidos transmiten la enfermedad,
completándose así el ciclo. (La
Amibiasis,2005).

En determinadas circunstancias, los trofozoitos
anteriores, adquieren capacidad invasiva y , por la
acción de proteasas, hialuronidasas y
mucopolisacaridasa, erosionan la mucosa y a veces la ulceran y
alcanzan incluso la submucosa. Estos trofozoitos o
<<trofozoitos tisulares>> son de mayor
tamaño, poseen mayor movilidad, son hematófagos,
no se transforman en quistes y no suelen salir por las heces. A
través del sistema portal pueden alcanzar el
hígado u otros órganos (Pumarola, et
al.,1987).

4. LA
AMIBIASIS

La Organización Mundial de la Salud ha definido a la
amibiasis: "como la condición de portar el
parásito Entamoeba histolytica con o sin
manifestaciones clínicas". Se sabe desde hace mucho que
muchas personas aparentemente infectadas con E.
histolytica nunca desarrollan síntomas y eliminan
sus infecciones espontáneamente.

Esto lo interpretaron muchos investigadores como una
indicación de que el parásito tenía una
virulencia variable. La E. histolytica puede causar
enfermedad invasora intestinal y extraintestinal, contrario a
E. dispar. La confirmación de la
distinción de estas dos especies es posiblemente el
mayor logro en el campo de la investigación de la
amibiasis.

4.1 EPIDEMIOLOGÍA

Se estima que el 10% de la población mundial
está infectada por E. dispar o por E.
histolytica, lo que resulta en aproximadamente 50 millones
de casos de amibiasis invasora y hasta 100.000 muertes por
año. La prevalencia de infección amibiana puede
ser tan alta como 50% en ciertas áreas de los
países en desarrollo.
Tasas elevadas de infección amibiana ocurren en el
subcontinente indio, Africa
occidental, lejano oriente y Centroamérica. La
prevalencia de la infección amibiana depende de
hábitos culturales, edad, nivel de saneamiento,
hacinamiento y condición socioeconómica (La
Entamoeba histolytica y la Amibiasis, 2005 ).

En Colombia, la
amibiasis es un problema endémico, si se aplican las
tasas de prevalencia de amebiasis de la Encuesta
Nacional de Morbilidad de 1980, se encuentra que
aproximadamente 3.025.000 colombianos son portadores
asintomáticos de E histolytica y 1.075.000 han
sufrido algún tipo de enfermedad amebiana intestinal o
extraintestinal. Por tanto es importante conocer los factores
de riesgo
epidemiológicos relevantes para la adquisición de
la infección, el desarrollo de la enfermedad y
así poder
identificar los pacientes con amibiasis, así como las
técnicas apropiadas para la diferenciación de
Entamoeba. Introducción

5. TÉCNICAS
EMPLEADAS PARA LA DIFERENCIACION DE Entamoeba histolytica y
Entamoeba dispar

El diagnóstico de la amibiasis intestinal
está basado en el examen de heces o en la biopsia. El
examen microscópico no permite diferenciar E.
histolytica de E. dispar, excepto cuando los
trofozoítos de E. histolytica presentan
eritrocitos fagocitados, que es una condición altamente
asociada con la amibiasis invasora. En las infecciones por
E. dispar no hay trofozoítos hematófagos.
De este modo las técnicas utilizadas para la
diferenciación de estas dos especies son:

5.1 ELISA

La técnica ELISA (Enzyme Linked Inmunoabsorvent
Assay) se basa en la detección de un antígeno inmovilizado sobre una fase
sólida mediante anticuerpos que directa o indirectamente
producen una reacción cuyo producto,
por ejemplo un colorante, puede ser medido
espectofotométricamente. Este principio tiene muchas de
las propiedades de un inmunoensayo ideal : es versátil,
robusto, simple en su realización, emplea reactivos
económicos y consigue, mediante el uso de la fase
sólida, de una separación fácil entre la
fracción retenida y la fracción libre (Pumarola,
et al.,1987).

La técnica ELISA ha sido muy usada para
determinar diferencias entre E. histolytica y E. Dispar: En los
años posteriores a 1978, se desarrollaron anticuerpos
monoclonales contra varios antígenos que permiten
diferenciar las cepas invasoras de las no invasoras. Dentro de
estos se encuentran: la lectina de adherencia Gal/GalNac
(GIAP), un antígeno de superficie de 96 kDa, un
antígeno proteínico interno de 81-84 kDa, una
proteína hidrofílica de membrana de 29 kDA/30
kDa, así como el antígeno aislado de los
gránulos electrodensos (EDG) producidos al interactuar
trofozoitos del parásito con colágeno "in vitro"
(Reyes y León,2002).

Otros métodos más específicos
utilizan la lectina denominada GIAP. Esta lectina de 260 kDa
presenta dos subunidades: una pesada de 170 kDa unida por
puentes disulfuro con otra subunidad liviana de 35 kDa. La
subunidad de 170 kDa es antigénicamente conservada y
además es inmunogénica, por el contrario la de 35
kDa no desarrolla una respuesta inmune . Por lo anterior, el
antígeno de 170 kDa ha sido utilizado tanto para la
detección de anticuerpos , como para el desarrollo de
anticuerpos monoclonales que permiten su identificación
directamente en las heces. Se ha desarrollado anticuerpos
monoclonales contra esta subunidad y establecido la presencia
de al menos 6 epitopos importantes como posibles herramientas
para la diferenciación de E. Histolytica / E.
dispar. Dos de estos anticuerpos monoclonales reconocen
dos epitopos presentes en ambas especies y los cuatro restantes
reconocen epitopos que se encuentran sólo en la especie
patógena (Reyes y León,2002).

5.2 PCR

En el estudio de la función
y la estructura
genética se requiere para su análisis suficientes cantidades del DNA
de interés. Esto es accesible gracias a una
técnica, que no requiere el uso de microorganismos,
conocida como reacción en cadena de la Polimerasa (PCR).
Este es el nombre que se ha dado a la amplificación
in Vitro de secuencias especificas de ácidos
nucleicos mediante ciclos repetidos de síntesis
dirigidos por cebadores. El mecanismo, es básicamente el
utilizado por las células
durante la replicación; la desnaturalización
capacita a la enzima Polimerasa a generar una copia
complementaria a la hebra de DNA parental a partir de
desoxirribonucleótidos trifosfato en (dNTPs)
solución.

La secuencia de un único gen puede ser
localizada entre una abundancia de otras secuencias de DNA,
incluso en lisados crudos, y será amplificada de una
forma exponencial hasta rendir una cantidad analizable (Walker
y Gingold, 1997)

Para la separación de las dos
cadenas que forman la molécula de

ADN que se
quiere amplificar, se debe calentar el ADN a altas
temperaturas que pueden ser próximas a la
ebullición (950c). Cada una de estas cadenas
actuará como molde para fabricar su complementaria. A
continuación se baja la temperatura
(600c) para conseguir que cada cebador se
una a su región específica dentro de la cadena de
ADN. El último paso consiste en la generación de
la cadena de ADN
complementaria por acción de la ADN Polimerasa
a una temperatura elevada (720c). Cada una de las
moléculas de ADN hijas
pueden volver a entrar en el proceso y
servir como molde para fabricar más copias. Así
tras 20 ciclos de reacción se puede obtener hasta 1
millón de copias de una molécula de
ADN.

5.2.1 AP – PCR

Según García y Yara, 2002, Wiliams
descubrieron una técnica llamada AP – PCR (PCR de
DNA polimórfico amplificado aleatoriamente) que emplea
un solo primer de oligonucleótidos de secuencia
aleatoria pero con un mínimo contenido de GC de 60%,
este primer se anilla a regiones arbitrarias del DNA blanco a
37 0C durante el PCR. Según García y
Yara (2002), Welsh y McClelland (1990) descubrieron una
técnica similar, AP-PCR (PCR preparado arbitrariamente),
en el cual un primer largo es anillado a temperaturas bajas
durante los ciclos iniciales del PCR. Ambas técnicas
dependen del anillamiento de las primeras regiones
complementarias a través del genoma.

Con cualquiera de las técnicas de la
región entre los dos sitios de anillamiento del primer
será amplificada si el extremo 5’ de los sitios de
anillamiento ( o el extremo 3’ de los primers anillados)
se encuentra cara a cara con la cadena opuesta de DNA.
Además los sitios de anillamiento pueden ser
suficientemente estrechos para que la región que
interviene pueda ser amplificada durante una rutina de PCR.
Ambas técnicas son similares en sus condiciones de
reacción y la forma de los datos que
producen. Una región amplificada por cualquiera de las
técnicas será flanqueada por repeticiones
invertidas que son en su mayoría complementarias a los
primers y separadas por no mas de 2.5 – 3.0 Kb. Los
polimorfismos revelados por estas técnicas son por
consiguiente expresados como la presencia o ausencia de un
fragmento de un tamaño particular entre individuos. Los
polimorfismos genéticos revelados por AP son usados en
una gran variedad de diferentes áreas de la
genética, incluyendo impresiones digitales del DNA,
genética de poblaciones y mapeo del genoma
(García y Yara, 2002)

5.2.2 PCR como método
de diferenciación entre E. histolytica y E.
dispar

Desde los inicios de los años 90, se ha venido
utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR),
la cual ha demostrado ser muy eficaz para la
diferenciación de ambas especies pero cuyo empleo se
haya limitado a estudios epidemiológicos o
experimentales pero no a nivel diagnóstico
rutinario.

A través de PCR, se establecieron diferencias
entre E. histolytica y E. dispar no sólo a nivel
bioquímico y antigénico sino también desde
el punto de vista genético principalmente en secuencias
altamente repetitivas de ADN circular extracromosomal,
así como diferencias en genes codificantes para la
actina, la cisteína proteinasa, la superóxido
dismutasa ( Reyes y León, 2002).

La habilidad del PCR para amplificar
específicamente grandes cantidades de DNA
patógeno ha revolucionado el diagnostico de muchas
enfermedades
infecciosas, y ha hecho de este una técnica ideal para
diferenciar entre numerosas secuencias de genes
homólogos en E. histolityca y E. dispar.
varios métodos han sido publicados, pero no todos
cuentan con la amplificación de regiones únicas
de SSUrRNA en el episoma. Su alto número de copias
provee elevada sensibilidad. Sin embargo, en el proceso
original el producto fue frecuentemente detectado por
electroforesis en gel seguido de visualización con
bromuro de etidio, detección colorimétrica que
usa pruebas
específicas y que ahora es frecuentemente
empleada.

Los ciclos de PCR han sido aplicados para la diagnosis
de la amibiasis utilizando trofozoítos cultivados in
vitro. De este modo, se ha desarrollado la
identificación de cepas al igual que especies, sin
embargo es importante tener en cuenta las desventajas de este
método. Primero, se requiere la separación en
tres pasos: extracción de DNA, amplificación y
detección del producto. Segundo, con todos los
métodos de PCR, se debe eliminar el riesgo de falsos
positivos debido a la
contaminación por productos
preparados anteriormente.

En la práctica la alta sensibilidad
teórica del PCR es balanceada por la velocidad y
la conveniencia de un Kit y la escogencia del método
dependerá de las preferencias y los recursos
locales (Ackers, 2002).

5.3 ISOENZIMAS

Técnica que se fundamenta en la migración electroforética
diferencial de las isoformas de una enzima, las cuales
conservan su actividad catalítica pero se diferencian en
su estructura primaria. Como son la expresión directa
del genoma son un buen indicador de la variabilidad
genética de una población (Acquaah, 1992 citado
por García y Yara, 2002). Las características
más importantes de las isoenzimas son:

Múltiples formas moleculares de enzimas
(isoenzimas) comunes en los organismos
Comparten una actividad catalítica
común
Con frecuencia exhiben especificidad en tejidos o
células
La heterogeneidad molecular de las enzimas confiere
flexibilidad, versatilidad y precisión sobre un
organismo en términos de funciones
metabólicas
Son caracteres monofactoriales

La electroforesis de isoenzimas puede aplicarse a
problemas en
sistemática de parásitos si se interpretan
correctamente los patrones de bandeo en los geles. Esta
interpretación requiere un conocimiento
previo de la estructura cuaternaria de las enzimas usadas y las
muestras de los individuos de estudio. En general hay dos
métodos de descripción e interpretación de
los patrones electroforéticos en los geles:
independiente de la ploidía o modo de reproducción del organismo bajo estudio.
Ellos son la aproximación al zimodemo y la
aproximación alozímica.

5.3.1 Electroforesis de isoenzimas como
método de diferenciación entre E.
histolytica y E. dispar

Gracias a la técnica de electroforesis de
isoenzimas actualmente se ha logrado establecer lo
siguiente:

Todas las especies de amibas del intestinos humano
pueden ser diferenciadas por patrones isoenzimáticos.
Este resultado incluye la importante verificación de la
existencia de la E. hartmanni, antes llamada la forma
minuta de la E. histolytica, como especie
distintiva.
Más de veinte patrones isoenzimáticos
de E. histolytica han sido encontrados en cuatro
continentes.
Las amibas cultivadas de muestras obtenidas de casos
bien definidos de amibiasis invasora (disentería
amibiana o absceso hepático) se agrupan en siete
diferentes patrones de isoenzimas, caracterizados por la
presencia de bandas específicas en la enzima
fosfoglucomutasa, y por bandas "rápidas" en la enzima
hexoquinasa (Son todas las amebas invasoras, 2005).

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ONEIDA ESPINOSA ALVAREZ

estudiante VI semestre BIOLOGÍA,

UNIVERSIDAD DEL TOLIMA – IBAGUE

GINA MARCELA GALLEGO LOPEZ

estudiante VI semestre BIOLOGÍA, UNIVERSIDAD DEL
TOLIMA – IBAGUE

KARINA ALEXANDRA GUTIERREZ DIAZ

estudiante VI semestre BIOLOGÍA, UNIVERSIDAD DEL
TOLIMA – IBAGUE

DIANA KARINA ROJAS BRIÑEZ

estudiante VI semestre BIOLOGÍA, UNIVERSIDAD DEL
TOLIMA – IBAGUE

IBAGUE

2005