Contaminación de productos lácteos por Brucella spp y otras bacterias en el municipio Higuera, Nuevo León,. México

1. Resumen
2. Introducción y
   Antecedentes
3. Materiales y
   Métodos
4. Investigación de
   Brucella en queso
5. Investigación de
   Brucella en aire o atmósfera del
   rastro
6. Resultados
7. Discusión
8. Literatura
   citada

Resumen

Brucella es una bacteria que causa fiebre Malta u
ondulante, que se transmite de productos lácteos no
pasteurizados en humanos. El propósito de este trabajo fue
investigar la existencia de Brucella y otras bacterias en
leche y sus
derivados. Elaborados en el Municipio de Higueras, N. L.,
México,
en la atmósfera y en el suelo de los
lugares de confinamiento del ganado de la
región.

Así se analizaron 176 muestras: 78 de productos
lácteos de diferentes sitios y 38 de leche de vaca, 28 de
leche de cabra, 8 de queso de vaca, 4 de de cabra, además
15 muestras del aire. Los
resultados indican que solo de una muestra de leche
de cabra se aisló Brucella abortus del biotipo 1,
pero ninguna de las de leche fue positiva a la prueba del anillo.
En bajo porcentaje se aisló: Enterobacter
aerogenes, Proteus mirabilis y Staphylococcus
aureus; en las 15 del suelo en el 100% se aisló
Pseudomonas spp; en la leche, en el queso y en el aire se
observó escaso crecimiento de hongo pero abundantes en el
suelo. Es probable que las bacterias acompañantes y
hongos en los
lácteos inhibieron a Brucella y evitaron su
detección.

Palabras clave: Fiebre de Malta, aborto, ganado,
leche-derivados.

Introducción y Antecedentes

La brucelosis es una zoonosis
común en países de América.1, 20 En el hombre la
enfermedad causa problemas de
salud y
socioeconómicos, el riesgo de
infección es mayor cuando la población humana,16,17 esta en
estrecho contacto con el ganado enfermo, por deficiente
pasteurización de productos lácteos, en queso
fresco, así como por pobres hábitos sanitarios
mataderos, carnicerías, y
frigoríficos.3,4 En el hombre la
brucelosis es llamada fiebre de Malta u ondulante, en los
animales se
denomina como enfermedad de Bang, o del aborto contagioso, en las
especies de Brucella que infectan ganado bovino, al
caprino, al porcino y al ovino, la evidencia más
importante es que en animales gestantes les causa placentitis,
con la consecuente muerte y la
expulsión del feto en el
último trimestre de la
gestación.2,5

El género Brucella se aisló por
David Bruce en 1887 del bazo de soldados británicos que
murieron, en la Isla de Malta. La enfermedad la contrajeron al
beber leche sin hervir de cabra. En Dinamarca Bang en 1897
aisló una Brucella que actualmente es conocida como
B. abortus causante del aborto infeccioso. Traum en 1914
aisló B. suis de un cerdo infectado.6,
7

Carvajal en México en 1906, dio el primer reporte
sobre fiebre Malta.8 Los clínicos mexicanos
Carmona, Terrés y Valenzuela, creían que enfermos
con prueba de widal negativa, con síntomas de fiebres
prolongadas en realidad tenían
brucelosis.9

En 1910 se importaron al país las primeras cabras
"muncianas", fueron por el consumo
popular de leche de cabra.3,4 En 1912 una epidemia de
una enfermedad con síntomas de fiebre prolongada,
interrumpida por períodos apiréticos, sudores
profusos, supuso que fue fiebre de Malta, Placeres en 1920
reportó el aislamiento de una bacteria análoga a la
de Bruce, pero hasta en 1922 en México, se demostró
la existencia de la brucelosis. 1,6

El género
Brucella es un cocobacilo o bastoncito mide de 0.5-0.7
micras, por 0.6-1.5 micras de longitud, sin cápsula,
inmóvil, sin endospora, Gram Negativo, metabolismo
heterotrófico oxidativo14. Crece en medios de
cultivo enriquecidos, en 24-48 h forma colonias pequeñas
convexas y lisas al principio translucidas, luego
pardas.9 Brucella está adaptada a un
hábitat
intercelular, sus requerimientos nutritivos son complejos, se
conocen tres especies patógenas: B. abortus, B.
melitensis y B. suis.8

En el hombre la enfermedad no solo se transmite por
alimentos,
frecuentemente es por beber leche o derivados lácteos de
animales infectados. 2 Cada especie de Brucella
tiene un huésped de preferencia, pero todas infectan al
hombre, las vías comunes de infección son: oral,
mucosas y piel
19.

Reportes en los Estados Unidos de
Norteamérica de brucelosis humana es bajo por
ingestión de leche cruda, o de productos sin pasteurizar,
provenientes de ganado infectado,10,11 o por
trabajadores enfermos de rastros ganaderos y así como por
veterinarios que al contacto con la carne y las placentas
infectadas de vacas, cerdos, cabras y ovejas se
contagian.12, 13

La inespecificidad de Brucella ocasiona que
cerdos se infecten con B. melitensis, al igual que B.
suis4. Vázquez, reportó que
vías de infección en el hombre se dan por la
ingestión de productos de origen animal como: el queso
fresco, la leche cruda, de cabras infectadas con B.
melitensis, o de leche de cabra mezclada con la de una vaca
enferma por B. abortus ó B. suis. Este
trabajo se apoya lo vital del control de la
brucelosis en: bovinos, ovinos y caprinos en
México.1, 4

Con métodos
para detectar la infección por Brucella en animales
como la prueba del anillo en leche que es rápida,
sencilla, confiable, y de sensibilidad para determinar
anticuerpos anti Brucella. 12, 15

Existen en países con elevada crianza de cabras,
corderos, de porcinos en los cuales la brucelocis tienen una
manifestación ganglionar, en donde el aborto no es
tan frecuente como en otras especies
animales.13

Otros investigadores3 encontraron un alto
porcentaje de porcinos reactivos a los antígenos de brucelosis, pero no aislaron
Brucella de las vísceras de esos animales, en parte
por que en el caso de B. suis se localize en los ganglios
submaxilares, lo que explica su dificultad para su aislamiento y
la baja probabilidad de
transmisión de la enfermedad al
hombre.15,16

En una investigación sobre brucelosis en el Estado de
Morelos, México encontró que de 219 animales
analizados hubo una incidencia una incidencia de la enfermedad
del 95.4%, y lo que indica la importancia de Brucella en
la ganadería
y su transmisión por vía digestiva, ya que
atraviesa la mucosa gastrointestinal, o mediante el contacto
directo por heridas por así por la conjuntiva
también.3,18

Es probable que también lo haga por una
vía nasal por vía respiratoria, existen reportes
del aislamiento Brucella de la atmósfera de un
rastro en donde sacrificaron animales enfermos.20 Los
aerosoles, que contienen la bacteria son otra forma fácil
de transmisión en animales de laboratorio.19

Existe información de un elevado número de
personas que se contagiaron con el germen en el laboratorio. En
una investigación sobre la epidemiología de la
brucelosis caprina en el Perú, Zapatel y
Málaga,20 señalaron que la enfermedad es
un grave problema de salud
pública, así recomendaron el empleo de
técnicas estandarizadas en la
elaboración de queso, así como prohibir la venta de queso
fresco de rebaños reactivos a Brucilla. Mientras
que Torre y Gojon18,19 analizaron la prevalencia de la
brucelosis caprina en Tamaulipas, México reportaron un
39.4% de las hembras negativas, un 30.7% sospechosas y un 29.9%
positivas.

Con base en lo anterior los objetivos de
este trabajo fueron investigar la existencia de Brucella
en leche, sus derivados, al igual que: en el aire, en el suelo de
ganado bovino y caprino en confinamiento de de Higuera, N.L.
México.

Materiales y Métodos

El municipio de Higuera, N. L. se ubica en el noroeste
de la republica mexicana o, México tiene una área
de 600 km2, altitud de 212 mnm, con clima extremoso,
colinda al norte con los municipios del Estado de
Nuevo León de Salinas Hidalgo, al sur con Marín, al
este con Cerralvo y al oeste con Salinas Victoria, en el mismo
estado. Sus habitantes se dedican a la ganadería, a la
avicultura, y en menor escala a la
agricultura.

Se realizó una encuesta
domiciliaria para localizar los sitios de elaboración de
quesos para autoconsumo y venta, de los lugares de consumo o
venta de esos tipos de leche. Con esa información se
analizaron 76 muestras: 78 de derivados lácteos; de 38 de
leche de vaca; 28 de cabra; 8 de queso de vaca; 4 de cabra;
además 15 de aire y 15 de suelo.

Las de leche y queso se colectaron en frascos de
vidrio
estériles de 1 L, se conservaron en hielo para su transporte al
laboratorio para detección de Brucilla. Las de
leche se dejaron reposar/12h a 6°C de la capa superior de
donde se acumuló la grasa de la leche que se sembró
en medios de cultivo específicos para Brucilla
además se realizó la prueba del anillo. Las
muestras de queso se sembraron directamente en los medios de
cultivo selectivos para la bacteria.

Investigación de Brucella en
leche.

1).- Prueba del anillo.

En este caso la leche formó a las 12 h
después del reposo una capa superior, que se
transfirió 1 mL en un tubo de ensaye, se adicionó
0.3 mL de antígeno de Brucella abortus cepa 1119-3
de Productora Nacional de Biológicos Veterinarios
(Pronabive) y se incubó a 37.5 °C/ 30-60 minutos, la
formación de un anillo azul en la parte superior de la
leche, fue evidencia positiva.20

2).- Aislamiento de Brucella de los productos
lácteos.

A partir de la crema de la leche que se separó
durante su sedimentación, se transfirió 1 mL a dos
series de frascos de vidrio uno con 50 mL de caldo nutritivo y
otro con soya tripticasa (Bioxon) con polimixina B 6000 U.I., y
bacitracina 2000 U.I. Además de suero de caballo: medio de
cultivo No 1(g/L): extracto de carne 3.0, peptona de carne
5.0, NaCl 5.0, nistatina 10 mL (100,000 U/mL.), cristal violeta 1
mL (sol. 0.1%), suero glucosado * 50 mL, agua destilada
1000 mL, y el medio de cultivo No 2: (g/L) peptona de
caseína 17.0, peptona de soya 3.0, NaCl 5.0, fosfato
dipotasico 2.5, dextrosa 2.5, polimixina B 6000 U.I., bacitracina
2000 U.I., nistatina 10 mL. 100,000 U/mL, cristal violeta 1 mL.
sol. 0.1%, suero inactivado *50 mL., agua destilada
1000 mL. Luego se transfirió 1 mL a frascos con los medios
de cultivo 1 y 2; 25 mL del medio No 1 con de 1.5% de agar y 20
mL de medio No 2.

Los medios de cultivo 1 y 2 se prepararon en agua
destilada, excepto los antibióticos: la nistatina
(Lakside) que se agregó a los medios de cultivo, igual que
los antibióticos y el suelo, se adicionaron por separado a
temperatura no
mayor de 45°C, los frascos de cultivo se incubaron á
35°C /10-15 días, otra serie se incubó en
atmósfera de CO2 a temperatura ambiente,
después del tiempo de
incubación cada frasco se sembró por estría
en placas de Petri con agar base,( g/L): infusión de
músculo cardíaco 375.0; peptona de carne 10; NaCl
5.0; agar 15.0, agua destilada 1000 mL, se esterilizó a
121oC/15 cuando la temperatura del medio fue de 45-50
°C, por litro se agregó 50 mL de sangre de carnero
desfibrinada y el medio No 2 con 1.5% de agar.

Las placas se incubaron á 35°C/48-72 h una
serie en atmósfera de CO2 y la otra a
temperatura ambiente, de las colonias sospechosas de
Brucella, pequeñas, translúcidas y con
bordes lisa, se realizó tinción al Gram, su
morfología al microscópico,
además de las pruebas
bioquímicas por siembra en: agar triple azúcar
y hierro (TSI),
lisina hierro (LIA), SIM y urea.

Para la sensibilidad de los aislados a los colorantes:
fucsina y tionina, se sembró una colonia sospechosa de
Brucella en agar soya tripticasa, se colocaron sobre la
estría los discos impregnados con soluciones de
fucsina 1:200 y tionina 1:800. Las colonias diferentes de
Brucella, según su morfología, se
identificaron por pruebas bioquímicas con carbohidratos
del tipo, Voges-Proskawer, la actividad sobre aminoácidos.
Para ello colonias al microscopio
fueron cocos Gram positivos, agrupados en pares y racimos, se les
realizó la prueba coagulasa. Los aislados
bioquímicamente similares a Brucella, se enviaron
al Instituto de Salubridad y Enfermedades Tropicales,
Departamento de Brucelosis (ISET), para su confirmación y
tipificación.

Investigación
de Brucella en queso.

Las muestras de este producto
lácteo, se desmenuzaron con una espátula
metálica de acero inoxidable
estéril, se transfirió 1 g a dos series de frascos
de vidrio con 50 mL de medio de cultivo No 1 y 2, se
transfirió 1 g a un frasco con 0.5 ml de medio y de 25 mL
del medio No 2 y 1.5% de agar como fase sólida y 20 mL de
medio No 2 como líquida, los frascos se incubaron a
35°C/10-15 días; igual para la leche, una serie se
incubó en una atmósfera de CO2 y otra a
temperatura ambiente, después de la incubación de
cada frasco, se sembró por estría en placas Petri
con sangre base al 5% con sangre de cordero desfibrinada y medio
No 2 con 1.5% de agar, las placas se incubaron 35°C/48-72 h
con y sin atmósfera de CO2., para la
identificación de las colonias sospechosas de
Brucella se procedió como en las muestras de
leche.20

Investigación de Brucella en aire
o atmósfera del rastro.

Para colectar las muestras de aire o
atmósfera, se seleccionaron 5 sitios de confinación
del ganado, estas se tomaron por burbujeo de 30 L/min de aire,
directamente en un matraz con100 mL de medio No 2 con una bomba
de aire con manómetro.

Los matraces se incubaron a 35°C/10-15 días;
una serie se incubó en una atmósfera de
CO2, la otra a temperatura ambiente, de cada matraz se
sembró por estría en placas Petri con agar base
sangre al 5% de sangre de cordero desfibrinada y con el medio No
2 y 1.5% de agar. Las placas se incubaron a 35° C /48-72 h en
y sin atmósfera de CO2, para la
identificación y tipificación de las colonias
sospechosas de Brucella se procedió como para
muestras de leche y queso.

Resultados

El cuadro 1 muestra los géneros de las bacterias
aisladas de las 38 muestras de leche de vaca. En el 100% de la
leche se aisló Pseudomonas ssp y en un menor
porcentaje Enterobacter aerogenes, Proteus mirabilis y
Staphylococcus aureus.

En el cuadro 2 se presenta en el caso de la leche de
cabra se aislaron: Pseudomonas ssp, P.mirabilis y S.
aureus, de una muestra de leche se recuperó
Brucella, tipificada en el Laboratorio de Brucelosis del
Instituto de Salubridad y Enfermedades Tropicales. La cepa se
clasificó como Brucella abortus biotipos
1.20

Ninguna de las muestras de leche fue positiva a la
prueba del anillo.

A partir de los 8 quesos de vaca se aislaron:
Pseudomonas ssp. y E. aerogenes, así como en
el caso de las 4 de cabra como se indica en los cuadros 3 y 4. En
la leche y queso se observó escaso crecimiento de hongos
mientras del suelo, se aisló Pseudomonas ssp y
Escherichia coli, y P. mirabilis, etc, como lo
muestra el cuadro 5. Mientras en el aire el género
bacteriano más abundante fue Pseudomonas
ssp, según indica el cuadro 6, ésta bacteria
se aisló en el 100% de la leche y sus
productos.

El mínimo de aislamiento de Brucella, se
supone que fue por causa de Pseudomonas spp que tiene un
efecto antagónico sobre este género, por ello se
realizó una prueba para demostrarlo. Se sembró con
asa bacteriológica el aislado de B. Abortus en la
superficie de una placa de Petri con agar soya tripticasa con
algunos de los aislados de Pseudomonas de diversas
fuentes de
esta investigación, las placas se incubaron a 35° C
durante 24 -48 horas con y sin atmósfera de
CO2.

En los resultados se observó que todos los
aislados de Pseudomonas inhibieron el crecimiento de
Brucella.

Cuadro 1. Bacterias aisladas de 38 muestras de leche de
vaca procedentes del municipio de Higueras, N.L.
México.

* promedio de cuatro repeticiones.

Cuadro 2. Bacterias aisladas a partir de las 28 muestras
de leche de cabra procedentes del municipio de Higueras, N.L.
México.

* promedio de cuatro repeticiones

Cuadro 3. Bacterias aisladas de 8 muestras de queso de
vaca procedentes del municipio de Higueras, N.L.
México.

* promedio de cuatro repeticiones

Cuadro 4. Bacterias aisladas de 4 muestras de queso de
cabra procedentes del municipio de Higueras, N.L.
México.

* promedio de cuatro repeticiones

Cuadro 5. Bacterias aisladas de 15 muestras de suelo de
los lugares de confinamiento del ganado en el municipio de
Higueras, N.L. México.

* promedio de cuatro repeticiones

Cuadro 6. Bacterias aisladas de 15 muestras de aire de
los lugares de confinamiento del ganado en el municipio de
Higueras, N.L. México.

* promedio de cuatro repeticiones

Discusión

De las 176 muestras investigadas, B. abortus
biotipo 1, sólo se logró aislar una de leche de
cabra. Esta investigación10 señala el
alto grado de contaminación microbiana en productos de
lácteos e indican que la microbiota es de una amplia
variedad de géneros bacterianos a pesar de la elevada
concentración de antibióticos que se usaron y que
eliminó la sensible acompañante, aunque por otro
lado implica que el uso de estos químicos causa un
selección de resistencia
bacteriana lo cual a mediano plazo es ya un problema para el
consumidor..

Los cultivos bacterianos de los productos lácteos
en medio líquido se observó un efecto inhibitorio
de a Pseudomonas ssp; P. mirabilis contra
Brucella, esto es importante ya que en los productos
lácteos cualquier fermentación como en la elaboración
de queso inhibe a Brucella por su sensibilidad al pH
ácido. En general es difícil detectar en esa
condición.

En el aire o atmósfera, en el suelo, en los
sitios de confinamiento de ganado, el porcentaje de aislamiento
de Brucella fue bajo, pero por los problemas de
interferencia de otras bacterias esto podría ser un falso
positivo.

B. abortus obtenida de leche de cabra proviene de
hatos mixtos, probablemente ello influyó por la
convivencia estrecha entre bovinos y caprinos, por el tipo de
alimentación es fácil el contagio de
sanos con enfermas. Existen reportes del alto porcentaje de
bovinos positivos al serodiagnóstico de
Brucella,8,13,19, pero aún
así, fue difícil su aislamiento de los productos
lácteos2en el municipio de Higuera N. L,
México.

Se concluye que son necesarias modificaciones
diagnósticos para precisa detección de
Brucella spp que conduzcan a su control y
prevención en beneficio de la población humana,
ganaderos y los involucrados en la industria de
lácteos, de la región.

Agradecimientos

Al proyecto 2.7
(2005-2006) de la CIC-UMSNH por las facilidades. A Sandra Saucedo
González por su trabajo secretarial.

Literatura
citada.

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Sanidad y Bienestar Social, Dirección General de Salud Publica,
Castillas,-España.

González, M. D1,

Garza, F. H.1

Sánchez-Yáñez, J.
M.2

1Microbiología de Alimentos. Facultad
de Ciencias
Biológicas. Universidad
Autónoma de Nuevo León.
2Microbiología Ambiental. Instituto de Investigaciones
Químico Biológicas

autor correspondiente

Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo.
Morelia, Mich., México.