Burkholderia, endofita del teocintle promotora crecimiento de maíz

1. Resumen
3. Materiales y
   métodos
4. Resultados y
   discusión
5. Conclusión
6. Literatura
   citada

RESUMEN

El teocintle es una gramínea, considerada como
uno de los probables ancestros del maíz moderno, vive en
la naturaleza,
donde tolera estrés
nutricional, hídrico, temperaturas extremas y el ataque de
fitopatógenos. El teocintle como otras gramíneas,
se asocia con bacterias con
lo que interactúa en la rizósfera, en el rizoplano
y en el interior de sus tejidos:
raíz, tallos, hojas, etc. como
endófitos.

El maíz es una gramínea doméstica
cultivada normalmente bajo el sistema de
producción intensiva, con altas dosis de
fertilizante nitrogenado (FN), éste puede causar la
pérdida de fertilidad del suelo, contaminación ambiental y elevar el
costo de
producción del maíz; una posible alternativa de
solución para minimizar este problema, es la
inoculación de la semilla del maíz, con bacterias
endofitas del teocintle, que colonizan sus raíces, tallos,
hojas, promueven su crecimiento a dosis reducida en un 50% menos
urea o el equivalente a disminuir de 280 kg Nha-1 a
140 kgNha-1, de lo recomendado para la región
del norte de Michoacán y sur de Guanajuato. Los objetivos de
este trabajo
fueron: i) aislar e identificar Burkholderia spp
endófita del teocintle, y ii) determinar el efecto de la
inoculación de Burkholderia spp sobre el
crecimiento del maíz, a dosis reducida de urea en
invernadero.

Por principio se determinó la densidad de la
población de Burkholderia
endófita en semillas, tallo-hojas y raíces del
teocintle, por siembra de éstas partes de la planta, en
agar Pseudomonas cepacia ácido azelaico triptamina
(PCAT), posterior a su incubación, las bacterias se
seleccionaron por su dominancia en comparación con su
abundancia, en otras partes de la planta; como las raíces
del teocintle. Las bacterias endofitas se caracterizaron en base
a su perfil bioquímico, y las endofitas de raíz se
inocularon en maíz sembrado en arena esterilizada, se
registró como única variable-respuesta de la
inoculación, el peso seco del maíz comparado con el
maíz cultivado con la dosis recomendada para esa
región.

Los resultados muestran Burkholderia spp
endofitas, se detectaron en una densidad de 3.4 Log UFC/gramo de
peso fresco (gpf), en raíz, de 3.0 Log UFC/gpf en semilla
y en el tallo-hojas de teocintle, la Burkholderia sp,
denominadas con las claves T41 y T42, se inocularon en
maíz, el aislado T41 causó un incremento de un 47%
en el peso seco de la raíz al amacollamiento y de un 57% a
la extensión del tallo, comparados con el maíz sin
inocular y con el nivel máximo de urea de 280 kg
Nha-1. Parcialmente se concluye que el teocintle es
una fuente de Burkholderia endófita benéfica
para maíz.

Palabras clave: fijación biológica de
nitrógeno, absorción radical, peso seco.

ABSTRACT

Teocintle is a wild gramine regarded as an ancestor of
maize able to survive under nutritional and hydric stress, extreme
temperature and phytopatogens attack. As a wild plant it is
co-exists with bacteria on its rhizosphere, and its rizoplane, as
well as host inside its tissues as an endophytes. On the other
side, maize is a domestic plant cultivated under intensive yield
system by using high levels of nitrogen fertilization (NF), which
causes the loss of soil fertility, environmental pollution and
increases its production cost. An alternative to solve this
problem is to inoculate maize with plant promoting growth
bacteria as these endophytes of teocintle at reduced levels of
NF. The aims of this research were i) to isolate identify
endophytic Burkholderia sp from teocintle and ii) to
evaluate the inoculation effect of the endophyte
Burkholderia sp on maize growth with and without nitrogen
under greenhouse conditions. Population density of endophytic
Burkholderia were isolated in seeds, stems and roots of
teocintle by using Pseudomonas cepacia Azaleic Acid
Tryptamin agar (PCAT). Burkholderia was inoculated in
maize on sterile sand and dry weight was evaluated. Results
showed that endophytic Burkholderia was detected at 3.4
UFC log/gram of fresh weight (gfw) in roots and at 3.0 log
UFC/gfw in stems and roots. Burkholderia sp. T41 on maize
grown without NF increased in 45% its root dry weight and 57% on
stem length compared to non-inoculated maize, treated with high
levels of NF as recommended. It is concluded that teocintle could
be a source of beneficial endophytic Burkholderia spp to
maize.

Key word:
Biological nitrogen, radical absorption, dry weight.

INTRODUCCIÓN

El maíz es una de las gramíneas de mayor
cultivo en México por
sus múltiples usos, su producción en promedio es de
22×106 ton/año (Eubanks, 2001) el 50% se
destina al consumo
humano, para mantener su demanda, se
emplea el sistema de producción intensiva, basado en el
uso continúo del suelo, riego superficial, pesticidas y
elevadas dosis de FN (Cárdenas-Navarro et al.,
2005; Ferrera-Cerrato y Pérez-Moreno, 1995). Una posible
alternativa de solución para racionar la aplicación
de este FN, en la producción sustentable de maíz,
es la inoculación de semillas a la siembra, con bacterias
promotoras del crecimiento
vegetal ó BPCV (Döberiener et al., 2001),
porque cuando las semillas germinan, las BPCV colonizan las
raíces de la planta, estimulan su crecimiento, mediante la
síntesis de sustancias promotoras del
crecimiento vegetal o fitohormonas como: el ácido-3-indol
acético, que induce la proliferación de pelos
radicales, con ello aumenta la absorción del FN a dosis
reducidas de FN. El reto es la selección
de BPCV competitivas y efectivas como inoculante biológico
para el maíz a partir de gramíneas genéticas
relacionadas, esto hace esperar una respuesta positiva y
consistente del maíz a la inoculación con esas
BPCV; no obstante la experiencia con las BPCV de ese origen, no
es así (Bashan et al., 1996; Bashan y Levanony,
1990) en parte por factores
bióticos como la competencia de la
población nativa del suelo; por la predación por
protozoarios y lisis de las BPCV causada por virus.

Mientras que los abióticos impiden la actividad
de las BPCV por los cambios drásticos de temperatura,
por la disponibilidad de agua y la
carencia de nutrientes esenciales para su supervivencia, la suma
de ambos factores evitan que las BPCV colonicen las raíces
del maíz, en consecuencia se anula el efecto positivo
sobre el crecimiento y rendimiento de la planta. Otro aspecto
clave en la inoculación de BPCV en el maíz es su
origen, normalmente este tipo de bacteria, proviene de otra
gramínea doméstica, que no es necesariamente lo
suficiente competitiva para dominar la rizósfera en la
planta y ejercer su acción
benéfica de promoción de crecimiento (Junior et
al., 2000; Bashan et al., 1996).

Una alternativa poco explorada, es el empleo de BPCV
endofitas del teocintle para la inoculación de maíz
en especial por la estrecha relación genética
entre ambas plantas (Galinat,
2001; Eubanks, 2001; Wilkes, 1972, 1997), este hecho supone una
respuesta positiva del maíz a la inoculación con
Burkholderia endófita del teocintle. (Nejad y
Johnson, 2000; Sturtz y Nowak, 2000b; Sebilla et al.,
2001).

El teocintle (Zea mays ssp mexicana), es
una gramínea que crece en la naturaleza en suelos pobres en
nitrógeno, en stress por
sequía, tolera el ataque de fitopatógenos
aéreos y de raíces (Sánchez y Ordaz, 1987;
Wilkes, 1985) Burkholderia endófita del teocintle,
ecológicamente tiene ventaja sobre las rizobacterias de
plantas domésticas, por su estrecha interacción con los tejidos del
maíz, en analogía con lo que se reporta en otras
plantas, cultivadas y silvestres (Megalhaes-Cruz et al.,
2001). Aun no esta definida la acción, por la que promueve
el crecimiento del teocintle, en la literatura reporta efecto
benéfico de estas endofitas en el crecimiento de plantas
silvestres (Sturtz et al., 2000 a y b) y domésticas
(Nejad y Johnson, 2000). Lo anterior se basa en el hecho de que
existen por lo menos 54 géneros y 129 especies de
bacterias endófitas que poseen algún mecanismo de
promoción de crecimiento vegetal (Hallman et al.,
1997 a,b,c; Mclnroy y Klopper, 1995 a y b; Sturz, 1995; Gardner
et al., 1982; Mundt y Hinkle, 1976) en la literatura
adémas se señalan otros géneros bacterianos
de vida libre con especies endofitas de tipo: Pseudomonas,
Bacillus, Enterobacter (Benhamou et al., 1996;
Sharrock et al., 1991); actualmente Burkholderia y
sus especies B. vietnamiensis en arroz (Gran Van et
al., 2000); B. sp en piña (Weber et
al., 1999) (Mattos et al., 2001) y B.
brasilensis en algodón.

Las especies de Burkholderia inoculadas en
gramíneas reportan que B. vietnamiensis en arroz
aumentó en un 49% su peso radical, en comparación
con el mismo cereal a la dosis de FN recomendada para la
región, sin inocular en invernadero (Gran Van et
al., 2000). B. vietnamiensis incrementó el peso
seco del arroz por sustancias promotoras del crecimiento vegetal
(SPCV) (Gillis et al., 1995; Tran Van et al.,
2000). Burkholderia spp inoculada en arroz sin FN,
causó un aumento de un 50% en el contenido de
nitrógeno total; existe la hipótesis de que este incremento fue por la
vía de la fijación biológica del
N2 capacidad demostrada en esta especie de
Burkholderia y por la medición de la actividad reductora de
acetileno en el arroz (Megalhaes-Cruz et al., 2001).
Existe el reporte que Burkholderia es un endófito
en el sistema de conducción del arroz (Minerdi et
al., 2001; Guillis et al., 1995; Mundt y Hinkle,
1976). En la actualidad la fijación biológica del
N2, se considera una forma de promoción del
crecimiento vegetal (Minerdi et al., 2001), otro ejemplo
es B. brasilensis una endófita de caña de
azúcar
que causa un incremento del 25% en su rendimiento, por la
vía de la fijación del N2 (Najad y
Jonson, 2000), en comparación con la caña cultivada
exclusivamente con el FN, sin inocular en este ensayo se
detectó la actividad nitrogenasa de Burkholderia en
los órganos de la gramínea (Mattos et al.,
2001).

En general la investigación sobre la existencia y
actividad benéfica de Burkholderia endófita
en plantas domésticas, es amplía
(Calderón-Becerra et al., 2000; Castellanos et
al. 2005; Baldani et al., 1997; Hallman et al.,
1997abc; Gardner et al., 1982), pero mínima en
gramíneas silvestres, como el teocintle, tampoco existe
información relacionada al efecto
benéfico Burkholderia endófita de teocintle
en el crecimiento del maíz, a dosis reducidas de FN desde
un 50% menos de urea de lo recomendado para este cultivo, en la
región norte de Michoacán y sur del bajío
guanajuatense. Los objetivos de este trabajo fueron: i) Aislar e
identificar Burkholderia endófita de raíces
de teocintle benéficas para maíz ii) evaluar el
efecto de la inoculación, de Burkholderia de
teocintle en el crecimiento de maíz con y sin urea en
invernadero.

MATERIALES Y MÉTODOS

a) Origen del teocintle (Zea mays sp
mexicana L).

La gramínea se colectó de los municipios
Sta. Ana Maya y Álvaro Obregón, ubicados en el
noreste del estado de
Michoacán a 35 km al noreste de Morelia, se le
colectó creciendo en suelos franco-arcillosos, pobres en
materia
orgánica, en nitrógeno, en fosfato soluble, de
pH 6.8, en
estas zonas el teocintle es nativo.

b) Determinación de la densidad de
Burkholderia endófita de teocintle.

Los aislados de Burkholderia se detectaron, en
semilla, en las raíces y en el tallo-hojas, en la etapa 6,
de la escala de Feekes
ó de la extensión del tallo (Large, 1954) y en la
etapa 11.4 ó del llenado del grano; para ello los
órganos del teocintle se lavaron externamente con agua
destilada y detergente comercial, se eliminaron los residuos del
suelo de las raíces, luego cada tejido ó semilla,
se desinfectó con hipoclorito de sodio al 3% (p/v) por 15
min, se lavaron 6 veces con agua esterilizada, después se
trataron con tween 20, al 2% (v/v) por 5 min, se lavaron 6 veces
con agua esterilizada, finalmente se desinfectaron en etanol al
70% por 5 min y se lavaron 3 veces en agua esterilizada, la
eficacia de la
desinfección de los tejidos y semillas del teocintle, se
comprobó mediante su siembra en agar nutritivo (Bioxon) e
incubación a 28 -30 °C por 24 h; de cada órgano
o tejido de teocintle se pesó un gramo y se trituró
por separado en un mortero en solución salina (NaCl 0.85%)
esterilizada, se inició con la dilución
10-1 del macerado y las siguientes en serie:
10-2, 10-3, 10-4,
10-5, 10-6, se determinó la densidad
de la población de Burkholderia endófita; de
la dilución más alta 10-6 se tomó
0.1 ml para sembrar en caldo Watanabe (W) medio mineral sin
nitrógeno, empleado para la prueba indirecta de
fijación biológica de N2, preparado de
acuerdo con la siguiente fórmula: Solución A (g/L):
Zn SO4, 7H2O, 0.43; Mn SO4,
H2O, 1.30; NaMoO42H2O. 0.75;
H3 BO3, 2.8; Cu SO4
5H2O, 0.026; Co SO4 7H2O, 0.07;
Solución B (g/L): Mn SO4 7H2O, 2.00;
Ca Cl2 2H2O, 2.00; Fe SO4
7H2O, 0.44; EDTA 0.04. Solución C (g/1):
K2HPO4, 60; KH2PO4
60; mezclar solución B 50 mL, solución C 15 mL y
solución A 20 mL / L; se agregó por separado (g/L):
glucosa 5;
sacarosa 4.5; manitol 3.5; almidón 4; el pH se
ajustó a 6.8 – 7.0; se esterilizó a 121
°C por 15 min para el aislamiento de Burkholderia
endófita, se empleó el agar Pseudomonas
cepacia ácido ázelaico triptamina ó PCAT
(g/L): Mg SO4, 0.1; ácido ázaleico 0.20;
triptamina 0.2g (disolver en 2 mL de alcohol
absoluto): K2HPO4 4;
KH2PO4 4; extracto de levadura, 0.02; el pH
se ajustó a 5.7; las cajas de PCAT se incubaron a 28-30
°C por 72 h; las cajas con Watanabe se incubaron por 48 h;
los aislados endofitos de teocintle que crecieron en estos
medios de
cultivo, se resembraron en agar nutritivo para asegurar su pureza
(Calderón-Becerra et al., 2000).

Identificación de Burkholderia
endófita de raíces del teocintle.

Los aislados Burkhoderia endofita de
raíces del teocintle se identificaron, por su perfil
bioquímico que se muestra en el
cuadro 1, según se describe en la literatura (Mattos et
al., 2001 y Calderón Becerra et al., 2000), se
incluyó el sistema API-50CH (BioMerieux, Francia),
Burkholderia endófita de las raíces del
teocintle, se compararon con las cepas de referencia: B.
cepacia ATCC 2546 y B.vietnamiensisTVV75; donadas por
el Dr. J. Balandreu y el Dr. Tran Van Van, del Depto de Ecología Microbiana
de Suelos de la Universidad
Claude Bernard, Lyon, Francia, además de las pruebas
bioquímicas indicadas en el cuadro 2 que se relacionan con
este género,
referente a su capacidad de utilizar diversas fuentes de
carbono.

Medición indirecta de capacidad de
Burkholderia para la fijación biológica de
N2.

Los aislados de Burkholderia endófita de
las raíces del teocintle, según las pruebas
bioquímicas, se suspendieron en solución salina
para inocular matraces Erlenmeyer de 500 mL con 250 mL de caldo
Watanabe; estos matraces se incubaron de 28-30 °C; se tomaron
alícuotas a intervalos de 24, 48, 72 y 96 h, con el
método de
Lowry para cuantificar la cantidad de proteína, medida
indirecta del crecimiento de la bacteria al fijar N2
(Sebilla et al., 2001.)

Inoculación de maíz con
Burkholderia endófita en
invernadero.

En este ensayo se usaron semillas de maíz "raza
jala", donadas por Laboratorio de
Química de
Productos
Naturales de La Escuela de
Químico-Farmacobiología de la Universidad
Michoacana de San Nicolás de Hidalgo. Las semillas se
pasteurizaron sumergidas en agua a 70°C por 5 min, para
eliminar las bacterias endófitas que contienen
según lo reporta en la literatura (Hallman et al.,
1997abc); luego las semillas se colocaron en hielo por 5 min, se
desinfectaron acorde con el procedimiento
señalado en el punto b), para aislar las bacterias
endofitas de tejidos y órganos vegetales.

Para el experimento del efecto de Burkholderia en
maíz se sembraron 5 semillas del maíz en maceta de
plástico
con capacidad de 4 kg, en arena húmeda esterilizada a
121°C / 60 min / 3 días; cuando las semillas
germinaron se inocularon 3 mL de Burkholderia de
teocintle, a la densidad de 1×10 3 log UFC/ semilla;
después de germinar se dejaron 2 plantas de maíz
por maceta; la superficie de estas se cubrió con
aserrín esterilizado a 121°C / 2 h; las macetas del
maíz se mantuvieron en invernadero, se irrigó 3
veces por semana con la solución mineral Thorton,
esterilizada a 121°C por 15 min (g/L):
K2HPO4, 0.2; Mg
SO4H2O, 0.2; NaCl, 0.1; Fe2
SO4, 0.01 y mL de elementos menores CuSO4 1
mL; solución 1M de: ZnCl2, 0.22,
NaMoO4, 1 mL/L (García et al.,
1995).

Diseño experimental y esquema de
fertilización nitrogenada.

En el ensayo de
inoculación de maíz con Burkholderia se
emplearon los siguientes tratamientos: Control relativo
(C) = maíz sin inocular y con 280 KgNha-1
equivalente a la dosis 100% de urea recomendada para la
región, variedad jala de maíz; tratamiento 1: B.
sp 1 y ½, 50% de la dosis de urea ó 140
kg/Nha-1; tratamiento 2: B.2 1/2 = maíz
inoculado con B. sp 2 y 50% de urea; tratamiento 3:
B.2 1/2 = maíz inoculado con B. sp 2 y
½, 50% de la dosis de urea ó 140
kg/ha-1. El diseño
se realizó con 20 repeticiones por tratamiento, la
distribución del maíz en el
invernadero fue un diseño de bloques completamente al
azar, se hicieron dos muestreos: el primero al amacollamiento
según la escala Feekes (Large, 1954), el segundo a la
extensión de tallo, en cada muestreo se
separaron las raíces y el tallo para secar a 80 °C /
24 h y determinar su peso seco.

Análisis estadístico.

Los resultados obtenidos se sometieron a la prueba de
Tukey, con base en un diseño de 5 tratamientos y 20
repeticiones, para evaluar el efecto de Burkholderia
endófita, sobre el peso seco del maíz; las
diferencias en la respuesta de la planta por tratamiento, se
establecieron por comparación de medias, con la prueba de
la diferencia mínima significativa (DMS) y con un nivel de
significación de P<0.05. Los cálculos se
realizaron con el programa para
computadora
Statgrat versión 5.0 (2002).

RESULTADOS Y DISCUSION

La figura 1 muestra en general que la población
endófita de Burkholderia en la semilla, en el
tallo-hojas y en especial en las raíces del teocintle, en
donde se le detectó en un orden de magnitud de 3.4 log
UFC/gpf (gramo de peso fresco); de 3.0 log UFC/gpf en el
tallo-hoja y en semilla, se estableció una diferencia
estadística significativa entre la
población de Burkholderia en raíces y la
detectada en los tejidos aéreos de teocintle, esto sugiere
una distribución heterogénea de este género
bacteriano en la planta, como se reporta para otros endofitos de
especies vegetales domésticas (Benhamov et al.,
1996, Sharrock et al., 1991) y silvestres diferentes al
teocintle, la literatura señala que Burkholderia es
endófita en una amplia variedad de plantas, en las que
promueve su crecimiento (Nejad y Jonson, 2000; Sturz, 1995; Sturz
y Nowak, 2000; Sebilla et al., 2001). Burkholderia
endófita se distribuyó heterogéneamente en
sus órganos, en especial en las raíces, por ello
los endófitos inoculados en el maíz para el ensayo
en invernadero fueron de las raíces del
teocintle.

Los valores son el
promedio de 1 g de semillas, y posteriormente de 20 plantas.
Valores con la misma letra sin diferencia estadística.
(DMS P<0.05) según Tukey, 1 g= semilla, tallo y
raíz.

Identificación bioquímica
de los endofitos de teocintle.

En el cuadro 1 se muestra el perfil bioquímico de
los endofitos, aislados de las raíces del teocinte. La
literatura reporta que Burkholderia sintetiza citocromo
oxidasa, y que posee un patrón oxidativo en la
utilización de azúcares. Este género se
describe como un bacilo Gram Negativo, móvil, catalasa y
oxidasa positivo, no produce ácido sulfihídrico, ni
triptofanasa; crece en medio mineral sin nitrógeno; usa el
citrato de sodio como única fuente de carbono y no libera
ácido de glucosa, en este cuadro se muestran las
diferencias bioquímicas básicas entre
Burkholderia endófita de las raíces del
teocintle y el género Pseudomonas spp, aislada de
plantas silvestres (Valdivia-Urdiales et al., 1999), en el
anterior patrón permite su separación
taxonómica por su perfil bioquímico, como lo
reportan Baldani et al., (1997) y Gillis et al.,
(1995), con una certeza de aproximadamente de un 80% de
pertenencia al género Burkholderia.

Cuadro 1. Comparación entre el comportamiento
bioquímico de Burkholderia endófita del
teocintle y Pseudomonas de plantas domésticas y
silvestres.

Reacción= (+)= positiva y (-)= negativa; (R)=
resistente; (S)= sensible, *Crec. sin N comb.= crecimiento en
medio mineral sin nitrógeno. Cada prueba se realizó
por triplicado.

El cuadro 2 se muestra el patrón de
asimilación de 50 carbohidratos
de los aislados endófitos de las raíces del
teocintle denominadas: T421 y T42, en comparación con las
cepas de referencia: B. cepacia ATCC 25416 y B.
vietnamiensis TVV 75 que asimilaron: acetato,
D-α-alanina, succinato, 2-ceto-gluconato, celobiosa,
D-arabinosa, D-arabitol, D-fructuosa, D-glucosa, D-lisosa,
D-manosa, D-tagatosa, dulcitol, D-xilosa, esculina, galactosa,
glicerol, gluconato, inositol, D-arabinosa,
D-fucosa, manitol, N-acetil
glucosalina, ribosa, sacarosa, sorbitol. Pero no α-metil
D-glucosida, α-metil D-manosida, almidσn,
β-metil xilosa, ramnosa, melizitosa, melibiosa, maltosa,
lactosa, erytriol, L-sorbosa. B.
vietnamiensis TVV75 y B. sp T42;
sólo usaron β-gentobiosasola y
D-fucosa. B. cepacia y
B. sp T41 y T42; arabutina B. cepacia; D-arabitol;
B. vietnamiensis; turanosa. B. sp T41; salicilina.
B. spp T41 y T42; glucogéno e inulina. Estos
datos son
útiles para el diseño de medios de cultivo
selectivos, en el aislamiento y diferenciación de especies
de Burkholderia de diversos ambientes.

Los aislados sospechosos de Burkholderia
endófita de las raíces del teocintle: T41 y T42,
mostraron un patrón de asimilación de
azúcares y sus derivados, similar al reportado por Gillis
et al., (1995). Lo que apoya que pertenecen a este
género y sólo requieren una confirmación
molecular, para su clasificación definitiva en este
género.

Cuadro 2. Asimilación de diferentes fuentes de
carbono orgánico, de Burkholderia endófita
de las raíces del teocintle.

*Acetato, D-α-alanina, succinato, 2 ceto
gluconato, celobiosa, D-arabinosa, D- arabitol, D-fructusa,
D-glucosa, D-lisosa, D-manosa, D-tagatosa, dulcitol, D-xilosa,
esculina, galactosa, glicerol, gluconato, inositol, D-arabinosa,
D, fucosa, manitol, N-acetil glucosalina, ribosa,
sacarosa, sorbitol, fueron asimilados

**α-metil D-glucosida, α-metil D-manosida,
almidσn, β-metil xilosa, ramnosa, melizitosa,
melibiosa, maltosa, lactosa, erytriol, L-sorbosa, glucogeno,
inulina. 1=β-gentobiosa, 2=Adonitol,
3=Amigdalina, 4= Arabutina, 5=D-arabitol,
6=D-fucosa, 7=D-rafinosa, 8= Turanosa, 9=Inulina, 10=Salicilina,
11= glucogeno. Reacción observada: (+) = asimilado, (-)=no
asimilado

BET= Burkholderia endofita de
teocintle.

En la figura 2 se muestra el crecimiento de las cepas de
referencia: B. cepacia ATCC 25416, B. vietnamiensis
TVV 75, comparadas con Burkholderia sp T41, T42 y S37
endófitas del teocintle, crecidas en Watanabe sin
nitrógeno en el que se registró que B.
vietnamiensis TVV75 creció en 24 h, en contraste con
B. spp T41 que lo hizó en 48 h mientras B.
sp T42 en 72 h, la concentración de proteína usada
como medición indirecta del crecimiento
bacteriano, el cual fue equivalente al registrado en la cepas
de Burkholderia de referencia que crecieron, sin
limitación de nitrógeno, esto sugiere
fijación de N2 en evidente diferencia, con el
mínimo crecimiento de B. cepacia ATCC 25416 y
B. spp S37 que no generaron proteína en el caldo
Watanabe, en concordancia con la literatura que no reporta que
B. cepacia, no fija el N2, a diferencia B.
vietnamiensis TVV75 que si fija N2 (Gillis et
al., 1995; Tran Van Van et al., 2000). La
concentración del total de la proteína por
B. sp T41 y T42 endófitas de las raíces del
teocintle, acumulada en el caldo Watanabe apoya que fijan
N2, no obstante su perfil bioquímico no
corresponde a B. vietnamiensi, lo que indica que
pertenecen al género Burkholderia, pero no a la
especie B. vietnamiensis.

Figura 2. Crecimiento de los aislados
del teocintle y las cepas de referencia de Burkholderia en
caldo Watanabe medida indirecta de la fijación
biológica del N2.

Todos los valores
son el promedio de 20 repeticiones. CV 15%.

Inoculación de Burkholderia
endófita de raíces del teocintle en maíz en
invernadero.

En la figura 3 se muestra el efecto de la
inoculación de Burkholderia sp T41 endófita
de teocintle, aumentó en un 47%, sin urea en el peso seco
radical del maíz, al amacollamiento, mientras que con 140
kg/N/ha-1 de urea ó el 50% de la dosis, el peso
seco del maíz fue de un 25% mayor, en comparación
con el similar del maíz usado como control relativo sin
inocular y fertilizado con 280 kgN/ha-1 de urea o la
dosis 100%. Estos datos apoyan que el aislado de
Burkholderia T41 tuvo un efecto positivo de
promoción de crecimiento vegetal en el maíz
(Fuentes-Ramírez
et al., 1999) B. sp T42 endófita de las
raíces del teocintle, causó un incremento del 11%
en el peso seco del tallo de maíz sin urea; mientras hubo
un incremento del 14% del peso seco del maíz tratado con
140 kgN/ha-1, dosis del 50% de urea, comparado con el
porcentaje del peso seco del maíz usado como control
relativo sin inocular con 280 kgN/ha-1 equivale a la
dosis 100% de urea.

El tipo de respuesta del maíz a la
inoculación con Burkholderia endofita de teocintle,
sugiere que la bacteria fija N2, pues esa actividad en
los procariotes en asociación con vegetales, es
dependiente de la concentración del FN disponible para la
planta (Döbbereiner et al., 2001), en acuerdo con lo
que la literatura señala sobre B. vietnamiensis y
otras bacterias fijadoras de N2 (Hallmann et
al., 1997b), cuando viven en asociación con
gramíneas en las que ejercen un efecto benéfico de
promoción sobre su desarrollo y
rendimiento a dosis reguladas de FN. (Minerdi et al.,
2001; Sturtz et al., 2000a).

O. maíz sin inocular, Aislados: B1:
Burkholderia sp T41, B2: B. sp T42, Dosis de urea: (1);
280 KgN h-1, (1/2); 140 KgNh-1, (0); con 0
KgNh-1. La medida corresponde a 20 repeticiones.
Valores con la misma letra sin diferencia estadística
significativa (P<0.05) según Tukey.

En la figura 4, se muestra el efecto de
Burkholderia endófita de las raíces del
teocintle, sobre el peso seco del tallo del maíz durante
la extensión del tallo; en donde B. sp T41 lo
incrementó en un 57%, sin urea y en un 39% con 140
kgN/ha-1 ó el 50% de la dosis; similar al
porciento en peso seco observado en el maíz fertilizado
con 280 kgN/ha-1 equivalente a la dosis 100% de urea,
sin inocular, mientras B. sp T42 en maíz
causó un aumentó del 18% del peso seco del tallo,
sin FN; y un 16% en el peso seco del maíz con 140
kgN/ha-1 equivalente a la dosis 50% de urea, similar
al valor de esa
variable-respuesta en el maíz usado como control relativo,
tratado con 280 kg/N ha-1 dosis 100% de urea, sin
inocular, se hipotiza que cuando no se aplicó urea
Burkholderia del teocintle fijaron N2, como se
reporta sucede cuando este género bacteriano, se asocia
con arroz a dosis mínimas de FN ó sin N (Hallmann
et al., 1997b).

El efecto positivo Burkholderia teocintle sobre
el maíz, fue análogo reportado por Sebilla et
al., (2001), con A. diazotrophicus inoculado en
caña de azúcar sin FN en invernadero, en este
ensayo se reportó que la bacteria aumentó en un 50%
el contenido de nitrógeno en la planta, respuesta similar
de la caña fertilizada con la dosis 100% de urea, sin
inocular (Fuentes-Ramírez et al., 1999),
también se observó que el efecto benéfico de
Burkholderia sobre el maíz se inhibió con la
de concentración de urea, acorde con lo señalado en
la literatura cuando se inocula una bacteria endofita del tipo
A. diazotrophicus en gramíneas a dosis
relativamente elevadas de FN (Sturtz y Nowak, 2000b).

Burkholderia endofita de teocintle causó
un incremento en el peso seco de tallo de maíz, que fue
dependiente del origen del aislado, ya que B. T41
causó un positivo efecto mayor que B. sp T42,
cuando se compararon ambos con el peso seco del tallo del
maíz, usado como control relativo y fertilizado con 280 kg
Nha-1 equivalente a la dosis 100% de urea, sin
inocular (Junior et al., 2000). El aislado de B.
spp T41 de teocintle causó el mayor efecto positivo en el
peso seco del tallo del maíz, sin urea (Sturtz et
al., 2000a). en contraste con B. sp T42 que
incrementó en un 20% el peso seco del tallo, independiente
de la dosis de urea aplicada, hecho para el cual aun no se tiene
una explicación, ya que en general en la literatura se
reporta que dosis relativamente elevadas de FN, inhiben el efecto
positivo de A. diazotrophicus en caña de
azúcar (Hallman et al., 1997c), lo cual se
registró en este ensayo con Burkholderia en
maíz con la dosis máxima de urea que inhibió
el efecto positivo de B. sp T41 en el peso seco del tallo
del maíz (Fuentes-Ramírez et al., 1999), no
obstante que este patrón bacteria -dosis de FN, suceso que
no se reporta en Herbaspirillum spp (Junior et al.,
2000), el cual fue análogo a lo observado con B. sp
T42. Estos datos sugieren que los aislados indica que
Burkholderia del teocintle, no pertenecen a la misma
especie, pues la literatura al respecto
(Fuentes–Rámirez et al., 1999) indica que la
conversión de productos del metabolismo
vegetal en bacterias endofitas, en SPCV, es función no
sólo del género, sino también de la especie
bacteriana en asociación con una familia vegetal
específica (Gardner et al., 1982; Nejad y Jonson,
2000).

Figura 4. Efecto de inoculación de
las probables Burkholderia spp endofitas de las
raíces del teocintle, sobre el peso seco del tallo de
maíz con y sin urea en invernadero

O. maíz sin inocular, Aislados: B1:
Burkholderia sp T41, B2: B. sp T42, Dosis de urea: (1);
280 KgN h-1, (1/2); 140 KgNh-1, (0); con 0
KgNh-1. La medida corresponde a 20 repeticiones.
Valores con la misma letra, sin diferencia estadística
significativa (P<0.05) según Tukey.

CONCLUSION

En los órganos del teocintle especialmente en las
raíces, en el tallo-hojas y en las semillas en ese orden
se detectó endófita Burkholderia, su perfil
bioquímico sugiere que no se trata de Burkholderia
vietnamiensis. El endofito de teocintle fue benéfico
para el crecimiento del maíz, independientemente de urea
aplicado.

Este trabajo es uno de los primeros reportes sobre la
asociación del género Burkholderia
endófita de las raíces, del tallo-hojas, de la
semilla del teocintle.

Agradecimiento. Al Proyecto 2.7
(2003-2005) de la CIC-UMSNH por el apoyo y facilidades para su
publicación, a Beatriz Noriega-Gamboa por su trabajo de
escritura.

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García-Reyna, M.J1,

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J.M.1*

*autor correspondiente

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+Ecología microbiana. Microbiología Ambiental

1.. Instituto de Investigaciones
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Morelia. Mich., México.