Síntesis de biomasa o proteína de origen unicelular de Saccharomyces exiguus en ácido acético

1. Resumen
2. Introducción y
   Antecedentes
3. Materiales y
   Métodos
4. Resultados y
   Discusión
5. Literatura
   citada

Resumen

La producción de alimentos con
proteína de calidad
nutricional se limita por diversas razones: una de ellas, el
deterioro del suelo, el
costo de los
fertilizantes químicos y el agua. Por
ello, otras alternativas se proponen como la obtención de
proteína microbiana. Conocida como "single cell protein"
(SCP) del tipo de la levadura Saccharomyces exiguus. El
objetivo de
este trabajo fue
establecer las mejores condiciones para la producción de
S. exiguus. Para ello la levadura se cultivo en
ácido acético (AA), sales minerales y
extracto de malta, su crecimiento se escalonó en un
reactor de 14L. Los resultados indican que el AA es una excelente
fuente de carbono para
la producción de biomasa microbiana de S. exiguus
como fuente de proteína si se usa extracto de malta como
factor de crecimiento.

Palabras clave: Proteína, levadura, dieta,
alimento.

Introducción y
Antecedentes

En la actualidad el aumento acelerado de la población no es proporcional a la cantidad
y calidad de la proteína disponible de origen vegetal y
animal, por ello se buscan otras fuentes de
proteína para la alimentación humana e
incluso animal. Este problema se intenta resolver de diversas
formas mediante el mantenimiento
de la producción agrícola como la
fertilización biológica, capacitación de personal en
centros de adiestramiento
para un mejor aprovechamiento, de los recursos
naturales, marinos y terrestres. Sin embargo, esto no es
suficiente.

Así se investigan otras alternativas de
proteína como la unicelular SCP o "biomasa" (2,3) este
término "proteína de origen unicelular"
nació en el Instituto Tecnológico de Massachussets
EUA, por el profesor
Wilson en 1966, (5). Aceptado para denominar de esa forma a
células
de bacterias,
hongos y algas
usadas como una fuente de proteína como se indica en el
Cuadro 1, que muestra el
análisis químico de las SCP derivadas de
diferentes microorganismos en donde es evidente que el contenido
de nitrógeno y los ácidos
nucleicos tienen un valor
considerable. (10,11). Esta opción tiene ven tajas sobre
otras proteínas
(3,12) ya que se obtiene de sustratos relativamente baratos, con
alto rendimiento y de calidad nutricional. Además
está sujeta a control lo que
hace posible que su fabricación sea maximizada (2, 4,
13).

Algunas ventajas de la proteína de
microorganismos cultivada en biorectores o sistemas
similares, sobre la similar de plantas y
animales se
indica como sigue (1, 14, 15):

1) Los microorganismos tienen tiempos de
generación cortos e incrementan rápidamente su
masa; las bacterias y levaduras bajo condiciones de laboratorio
alcanzan tiempos de generación entre un 0.5-2h o de 1-3h
(19).

2) Los microorganismos poseen una concentración
de proteína elevada entre un 10-50% (3).

3) La SCP es de alta digestibilidad no es tóxica
y de buen sabor (8,10).

4) La producción de SCP se basa en sustratos
relativamente baratos y abundantes como la celulosa, el
AA o el
petróleo, etc. (2,6).

5) La producción de SCP se logra con relativa
facilidad en un cultivo controlado independientemente de factores
ambientales (5, 7, 11).

CUADRO I.

PORCENTAJE PROMEDIO DE LA
COMPOSICIÓN QUÍMICA PROXIMAL DE LA PROTEÍNA
UNICELULAR EN BASE A SU PESO SECO.

(Anupama y Ravindra, 2000; Rhishipal y Philip, 1998;
Ghose, 1969; Bressani, 1968.)

Existen datos sobre la
utilización del nylon para la producción de SCP,
que prueban que la celulosa es una opción como fuente de
carbono para la síntesis
de proteína microbiana. Enebo (10) en un cultivo mixto con
Celullomonas y Alcaligenes a nivel de planta
piloto, comprobó la disponibilidad de este sustrato para
la producción de SCP. Con respecto al AA como sustrato
para la manufactura de
biomasa, se evaluaron 103 hongos; los resultados indican que
efectivamente esta es una opción como fuente de carbono
para la producción de SCP bajo las siguientes condiciones
de trabajo: AA (1 Y 2% v/v), pH 5.9 Y 6.3,
amonio 0.07 y 0.28%.

El análisis químico proximal de los hongos
señaló 38 y 50% de proteína cruda
respectivamente, y de un 7 y 8% de ácidos nucleicos con un
bajo en el contenido en metionina (15), Moo-Young (16) al evaluar
este proceso en
países desarrollados se determinó el costo de la
producción de SCP, a partir de AA, en comparación
con otros sustratos como se presenta en el Cuadro 11 en el que se
señala su factibilidad
económica. Al determinar la síntesis de SCP, Sal
daña (19) en su investigación con S. exiguus, obtuvo
6 g/L de peso seco con AA a una concentración de 0.75 %,
amonio 5 g/L Y 30 ppm de extracto de levadura como factor de
crecimiento con agitación mecánica de 250 rpm y temperatura de
25-30°C.

CUADRO II.

DIFERENCIAS ENTRE EL COSTO DE LA
PRODUCCIÓN DE LA PROTEÍNA UNICELULAR A PARTIR DE
ACETATO EN RELACIÓN A OTRAS FUENTES DE
CARBONO.

(Amrane y Prigent, 1998 -2000; Moo-Young.
1977).

Esta investigación señala que S.
exiguus, posee excelentes características
fisiológicas para desarrollarse en AA, la que incluye su
tolerancia al
pH ácido, y que además responde rápidamente
a la adición de tiamina, niacina, botina y ácido
pantotenico de las melazas lo cual incrementó al
rendimiento de su SCP (2,9,12), así como el tiempo de
duplicación, la velocidad de
crecimiento (1,2). Los objetivos de
éste trabajo fueron: i) obtener biomasa a partir de AA por
Saccharomyces exiguus en medio de cultivo con extracto de
malta como factor de crecimiento y ii) optimizar su
producción en un fermentador automatizado.

Materiales y
Métodos

I ORIGEN DE LA LEVADURA

La cepa de Saccharomyces exiguus se aisló
de aguamiel (Agave sp) y se identificó por
Saldaña (22); pertenece a la colección del
laboratorio de microbiología industrial y del suelo del
área de microbiología de la Facultad de Ciencias
Biológicas UANL, de donde se obtuvo para la
realización de este trabajo.

II CONSERVACIÓN

La levadura fue mantenida por resiembra periódica
mensualmente en agar Sabouraud glucosa al
(p/v) 2%, (Merck) pH 5, a temperatura de refrigeración y agar acetato diferencial
(Difco), pH6 y 7.

III MEDIO DE CULTIVO

Se probaron dos medios base
denominados M-I y M-II

a) El medio M-I contenía: (g/L)
NH42S04 (Reactivos Monterrey) 4.0; KH2PO
4 (Merck) 0.8; MgSO J H20 (Merck) 0.25; agua de la
llave 1000mL; extracto de malta (Merck) 30 ppm. AA (Reactivos
Monterrey) en concentración de 1, 2, 3, 4, Y 5 %; v/v pH
final 4.5 ajustado con NaOH concentrado con
potenciómetro.

b) El medio M-II contenía: (g/L)
NH4Cl (Reactivos Monterrey) 5.0;
KH2PO4 (Merck) 5.0, MgSO4.7 HP
(Merck) 2.5; CaCl2. HP (Baker) 0.8; agua de la llave
1000mL; extracto de malta (Merck) 30 ppm. AA (Reactivos
Monterrey) en concentración de 1, 2, 3, 4, y 5 (%); pH
de 4.5 ajustado con NaOH.

IV CONDICIONES DE FERMENTACIÓN

a) Se realizaron experimentos en
matraces Erlenmeyer de 500ml con 100ml del medio de cultivo en
un agitador mecánico 250 rpm (Eberbach), a temperatura
ambiente con
un tiempo de fermentación de 96-120h, se
seleccionó la mejor concentración de AA para la
producción de levadura en base a su rendimiento y se
escalonó a nivel de microfermentador M F-114 (New
Brunswick Scientific Co. Inc.) con capacidad de 14L
agitación de 300-500 rpm temperatura 30°C,
aeración de 1 VVM, con dos antiespumantes; antifoam
(Sigma) y el Dow corning FG-10 (Siliconas), se usó 1 mi
del antiespumante concentrado al iniciar la fermentación
y luego se diluyó al 10 % en agua destilada como
acarreador durante la fermentación.

b) Preparación del inóculo. Para los
experimentos en matraces Erlenmeyer se preparó una
suspensión de S. exiguus en solución
salina 0.85% estéril a partir de un cultivo de 48h,
crecida en agar Sabouraud glucosa 2%, se tomaron 5ml para cada
matraz hasta alcanzar una absorbancia de 0.60 a una longitud de
onda de 650m en un espectrofotómetro Coleman
júnior 11 en celdas de 5mm de diámetro y 2.5ml de
capacidad. Para los experimentos en el microfermentador se
emplearon dos matraces de 1000ml; con un volumen de
medio de cultivo de 350ml la levadura se activó de la
manera mencionada hasta alcanzar 0.60 de absorbancia con estos
700ml se inocularon los 7.7L del medio de cultivo para el
microfermentador.

V CINÉTICA DE
FERMENTACIÓN

Los principales parámetros considerados para
establecer la cinética de fermentación de S.
exiguus en AA y sales minerales además del extracto de
malta fueron: densidad óptica,
peso seco (g/L) y pH.

a) Densidad óptica.

Se tomaron muestras cada 0, 24, 48, 72, y 96h para los
matraces y 2, 3, o 4h, para los experimentos en el
microfermentador se colectaron 4ml del medio de cultivo para las
lecturas a una longitud de onda de 650nm. En un
espectrofotómetro Coleman júnior 11.

b) Determinación del peso seco.

Para el peso seco se usaron membranas milipore de 25m m
de diámetro (Gelman) de 0.2 micras de diámetro se
llevaron a peso constante en un horno a 11 OOC/18h,
después se depositaron en un portafiltros con una jeringa
hipodérmica adaptada y se filtró 1 mi del medio de
cultivo, se lavaron las células con 2ml de solución
salina al 0.85 % Y se secaron a 40°C. Las membranas se
llevaron a peso constante en el horno a 11 OOC/18h. El pH se
determinó con un potenciómetro Corning Scientific
Instruments Mod.5.

c) Coeficiente de rendimiento del sustrato.

Se calculó en base a la ecuación y = X/S
donde x representa los gramos de peso seco de la levadura IL de
medio de cultivo y s los gramos de AA/L para obtener los gramos
de peso seco de la levadura I gramo de AA.

d) Análisis estadístico.

Se desarrolló un análisis
estadístico de regresión
simple exponencial con una calculadora T1 Programable 58
Texas Instruments, (19), para obtener la cantidad de
células secas por unidad de volumen a un tiempo
determinado con la siguiente ecuación:

x = xo eµح

x = gramos de células por litro (g/L) a un tiempo
determinado.

xo = gramos de células por litro (g/L)
iniciales.

e = representa una constante.

µ = velocidad de crecimiento.

T = tiempo.

Resultados y
Discusión

En el Cuadro III se muestran los experimentos realizados
a nivel de microfermentador, en donde fue evidente que el 1 %
(v/v) de AA fue adecuado para la producción de biomasa,
pues el ácido se consumió totalmente al controlar
estrictamente las condiciones de producción celular con un
volumen de 7.700, con extracto de malta a 30 ppm el cual fue
fundamental como fuente de vitaminas para
la síntesis de enzimas que
necesita la levadura en su fase logaritima y que influye
directamente en su rendimiento a una temperatura de 30°C; una
agitación de 400 rpm; y una aeración de un volumen
de aire/L de
medio de cultivo, a un pH de 4.5 antiespumante FG-10 al 10% que
redujo considerablemente la formación de espuma En esta
condición se encontró un y= X/S 0.49 y un
rendimiento celular de 5.1 g de peso seco/L lo que significa un
eficiente uso del AA para su conversión en biomasa (20,21)
a un costo relativamente bajo.

El principal problema para la producción de SCP
de AA fue el pH, la levadura mostró tendencia a elevarlo a
un valor tan alto que causó un evidente olor a amonio, lo
que facilitó su contaminación por bacterias. La espuma no
controlada también ocasionó pérdidas,
así que se recomienda evitar la con un buen antiespumante.
Estos resultados sugieren un estudio bioquímico de los
productos de
fermentación y de la fisiología de la levadura cuando crece en
AA para reducir el problema de la alcalización del pH
(2,3,).

Por lo anterior, se concluye que a ninguna
concentración de AA, a nivel de matraz se inhibió
el crecimiento de S. exiguus. El extracto de malta fue
esencial para la producción de biomasa pues al suprimirse,
el rendimiento disminuyó notablemente, lo que indica que
es incapaz de sintetizar vitaminas del complejo B. Durante la
cinética de fermentación el pH se elevó lo
que provoca la
contaminación del medio del cultivo, por ello se
recomienda observar máximas medidas de asepsia al trabajar
con esta levadura y fuente de carbono.

CUADRO III.

CRECIMIENTO DE Saccharomyces
exiguus EN MEDIO MINERAL CON ÁCIDO
ACÉTICO-EXTRACTO DE MALTA EN FERMENTADOS DE 14 LITROS DE
CAPACIDAD CON UN VOLUMEN DE TRABAJO DE 7.700
LITROS.

*ácido acético adición
inicial.

Agradecimientos

Al proyecto 2.7
(2005-2006 de la CIC- UMSNH por el apoyo para su
publicación. Al similar "Biomasa" de la FCB – UANL,
Monterrey, N.L, México,
por el financiamiento
para su realización.

Literatura
citada

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23. Texas Instruments 1977 Personal Programming. 5:
V-39. T1 Programmable 58/59

Sánchez-Yáñez, J.
M.1*

Galán-Wong, L. J.2*

1Microbiología ambiental,

*autor correspondiente

Instituto de Investigaciones
Químico Biológicas, Ed B-1, Universidad Michoacana
de San Nicolás de Hidalgo., CP. 58030 Morelia,
Michoacán.

2Microbiología Industrial y del suelo.
Facultad de Ciencias Biológicas. Universidad
Autónoma Nuevo León, AP. 414, CP. 64000. San
Nicolás de los Garzas, N.L. México.