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Aislamiento y supervivencia de esporas Bacillus thuringiensis en maíz en almacén y en el ambiente




Enviado por syanez



    1. Resumen
    2. Introducción y
      Antecedentes
    3. Material y
      Métodos
    4. Resultados y
      Discusión
    5. Literatura
      citada
    6. Anexo

    Resumen.

    La bacteria Bacillus thuringiensis (Bt) es
    una alternativa ecológica para reducir el daño de
    insectos-plaga en la agricultura y
    evitar el uso de pesticidas químicos.

    Bt produce al final de su ciclo de vida,
    un complejo espora y cristal ó δ-endotoxina que
    intoxica insectos-plaga (IP) de los
    ordenes: Lepidoptera, Diptera y Coleoptera. Si a la
    aplicación de éste complejo sobre hojas, los IP no
    lo consumen, el cristal expuesto a la radiación
    solar se desnaturaliza y las esporas mueren rápidamente,
    excepto en almacén de granos en donde, éste factor
    físico no existe, en ese ambiente esporas y cristales de
    Bt persisten por mayor tiempo, que en
    el exterior.

    Los objetivos de
    este trabajo
    fueron: 1) aislar esporas variedades de Bt tóxicos
    a insectos-plaga de granos de almacén, 2) Establecer la
    supervivencia de esas esporas en maíz almacenado y
    expuesto a la intemperie.

    Para ello se colectaron 120 muestras de grano de los
    mercados: San
    Juan, Nicolás Bravo y Vasco de Quiroga de la ciudad de
    Morelia, Michoacán, México.
    Los granos se pasteurizaron y sembraron en agar nutritivo,
    ahí se buscaron las colonias típicas de Bt y
    en las células,
    la espora con el cristal característico.

    La supervivencia de las esporas de un Bt aislado
    de un grano y Bt var kurstaki HD-1 del producto
    comercial Dipel MR analizó en maíz,
    colocado en un simulador de almacén y otra se expuso a la
    intemperie, para medir el efecto de la luz solar sobre
    la viabilidad de las esporas Bt.

    Los resultados indican que de las 120 muestras de granos
    de mercados en Morelia se recuperaron dos aislados que se
    denominaron: Bt1 y Bt2 de girasol, equivalente al
    1.6 %. Este resultado sugiere que la frecuencia de aislamiento de
    las esporas de la bacteria, fue proporcional al tiempo de
    almacenamiento de
    esos granos. Mientras que la supervivencia de las esporas
    Bt en maíz, fue dependiente de su exposición
    a la radiación solar. En contraste en el maíz en
    almacén, la persistencia de las esporas de Bt fue
    alta. Finalmente Bt1 se identificó como var.
    morrisoni y Bt2 como var.
    kurstaki.

    Palabras clave: biopesticida, radiación
    solar, bacteria, insecto-plaga.

    Introducción y Antecedentes.

    Los insectos-plaga son uno de los factores que limitan
    la producción agrícola, dado que atacan
    cultivos vegetales (CV) desde su siembra a la cosecha e incluso
    en el almacen. Por ello el Declorodifenildicloroetano (DDE) y
    otros organoclorados se aplican durante el ciclo completo del CV,
    para protegerlos del ataque de estos IP. El continuo y excesivo
    uso de estos pesticidas, les indujo resistencia
    genética.

    Actualmente esta situación no cambia y su
    control se
    realiza con dosis elevadas de pesticidas en consecuencia para
    1989, se reportaron mas de 500 especies de IP de los ordenes
    Lepidoptera, Diptera y Coleoptera, tolerantes.
    Además los pesticidas contaminan: aire, suelo, agua y
    eliminan insectos benéficos (Alpuche, 1991).

    Una alternativa para el control de IP, es el
    microbiológico con ventaja sobre el químico por su
    especificidad; su inocuidad a humanos, animales,
    plantas y su
    relativo bajo costo (Herrero
    et al., 2001).

    Ejemplo de algunas de las especies del género
    Bacillus, son los de tipo entomotóxico y/o
    entomopatógeno como: B. thuringiensis (Bt),
    B. popilliae, B. larvae y B. sphaericus
    (Kiselek, 1979; Krieg, 1980; Moir y Smith, 1990), de estas
    especies, Bt se comercializa desde los años 50, por
    lo que en la actualidad es clave en la racionalización de
    los pesticidas (Rowe y Margaritis, 1989;
    Sánchez-Yáñez, 2004).

    Aunque por otro lado en el mercado se venden
    semillas transgénicas con el gen de Bt, responsable
    de la producción del cristal para evitar su
    desnaturalización en el ambiente en un intento por mejorar
    el control biológico de IP, con éxito
    relativo y que es causa de controversia por su aún no
    predecible impacto negativo ecológico (Doping et
    al
    ., 2000), como ocurre en la aspersión convencional
    del complejo espora-cristal, un problema práctico de la
    aplicación del éste es la persistencia de las
    primeras en el ambiente, pues influyen en la toxicidad del
    cristal (Sánchez-Yáñez y
    Peña-Cabriales, 2000).

    Las esporas de Bt, se aíslan con relativa
    facilidad de diversos ambientes, en función de
    su origen se recuperan: del suelo, del filoplano de plantas
    (Smith y Couche, 1991), de larvas enfermas de insectos, de
    productos
    almacenados y de alimentos
    balanceados para animales (Pinnock et al., 1971;
    Sztejnberg y Blakeman, 1973), aunque si existe diferencia en la
    frecuencia de aislamiento de las esporas de Bt, entre esos
    ambientes, ya que que son las responsables de su distribución cosmopolita (Goodfellow,
    1968a; Goodfellow y Dawson, 1978b), en el suelo (De Lucca et
    al
    ., 1981; Martín y Travers, 1989), asi se reporta que
    las esporas fueron viables en hojas de fríjol y
    maíz no mayor de 72 horas (Sánchez-
    Yáñez y Peña-Cabriales, 2000), debido a la
    acción
    bactericida de la radiación solar (Alekseev et al.,
    1982). Aunque otros reportes señalan periodos de
    persistencia mayores de 15 días (Luna- Olvera y
    Peña-Cabriales, 1996) similar a lo observado en los
    productos almacenados como granos y alimentos balanceados para
    animales. En los cuales las esporas de variedades de Bt se
    recuperan en por ciento del 7% al 30 % y un periodo de
    supervivencia de semanas (Waliszweski y Pardo-Sedas, 1991;
    Meadows et al., 1992), como se informa en las hojas del
    tabaco en
    almacén, en el que obtuvo un aislamiento de esporas de
    variedades de Bt del 20% (Kaelin et al.,
    1994).

    En general la frecuencia de recuperación de las
    esporas de estas variedades de Bt, es mayor en un ambiente
    protegido de la radiación solar, por ello se considera al
    ambiente de almacén, como uno de los sitios con mayor
    probabilidad
    en detectar de epizootias causadas por Bt con esporas de
    más de una variedad de Bt, lo que apoya que en este
    sitio el un número de esporas viables es suficientes para
    causar, no sólo la intoxicación del IP,
    también una verdadera enfermedad (Dulmage y Aizawa, 1982;
    Lambert y Perferoen, 1992).

    Con base en lo anterior los objetivos de este trabajo
    fueron i) Analizar esporas de variedades de Bt en granos
    de almacén. ii) Establecerr la supervivencia de sus
    esporas en maíz en almacén y expuesto a la
    intemperie.

    Material y Métodos.

    I. Origen de muestras.

    Se colectaron 120 diferentes muestras de grano de
    almacén de los mercados de San Juan, Independencia
    y Vasco de Quiroga de la Ciudad de Morelia, capital del
    estado de
    Michoacán, México.

    II. Recuperación de las esporas
    Bt.

    El aislamiento de las variedades de esporas de
    Bt, se suspendió 1g/ de granos de los mercados en
    tubos de 18x 150 mm con 10 ml de solución salina (NaCl
    0.85%,p/v), los tubos se agitaron/ 1 min en un vortex
    (Thermolyne). Los granos con daño por IP se trituraron y
    posteriormente ambas muestras se pasteurizaron a 65°C/ 13
    minutos y aumentar la probabilidad de la recuperación de
    variedades de esporas Bt. Se tomó 0.1 ml del
    pasteurizado y se inoculó en tubos con 10 ml de caldo
    nutritivo (Bioxon) g/l: peptona gelatina 5.0, extracto de carne
    de res 3.0, pH 6.9
    ± 0.2, los que se incubaron/24
    h y se resembraron con aza bacteriológca en cajas con agar
    nutritivo o AN (Bioxon) g/l: peptona gelatina 5.0, extracto de
    carne de res 3.0, agar 15.0, pH 6.9± 0.2, las cajas se incubaron a
    30°C/72 h.

    Entonces se buscaron las colonias típicas de
    Bt y en ellas se buscaron sus esporas con los cristal
    característicos, mediante tinción simple y la
    especifica de Anthony para esporas bacterianas (Martín y
    Travers, 1989). La purificación de las posibles variedades
    de Bt se udó la técnica de
    pasteurización en el aislamiento de las esporas de
    Bt, var kurstaki HD-1 del producto
    DipelMR (Shell, Co).

    Se realizó un bioensayo horizontal de la
    toxicidad de Bt1 contra gorgo (Sitophilus zeamaise
    L) como lo indica Dulmage (1970) y posteriormente la
    identificación bioquímica
    con los criterios aceptados para éste género y
    especie bacteriana (Krieg, 1980; Rowe y Margaritis,
    1989).

    Conservación de las esporas de
    Bt.

    Los aislados y las esporas de Bt se cultivaron en
    caldo nutritivo e incubaron a 30°C/72 h, se mezclaron en
    turba estéril (121°C/2 h) en tubos de 18×150 mm con
    tapón de rosca (Sánchez-Yáñez et
    al
    ., 2002; 2004) y se mantuvieron en refrigeración a 10°C para asegurar la
    viabilidad y pureza.

    III. Microscopia electrónica de los aislados de
    Bt.

    La observación de las esporas y cristales
    producidos por Bt1 y Bt2 se utilizó el
    microscopio
    electrónico de barrido (MEB) JEOL Model JSM 6400, del
    Instituto de Investigaciones
    Metalúrgicas de la UMSN. En este ensayo tomo
    una asada de cada Bt y se fijó en una placa
    metálica (1×1 cm) de oro, estas se
    sumergieron en glutaraldehido/45 min. y se deshidrataron en
    alcohol al 90%
    para su posterior observación al MEB, luego se recubrieron
    con una capa de oro (metalización). Las microfotografias
    se tomaron a 5,000 y 10,000 magnificaciones.

    Otra técnica empleada para la observación
    de Bt fue la siguiente: después de fijar en la
    placa metálica de oro se sumergió en
    glutaraldehído al 70% durante 30-45 minutos, luego se le
    aplicó un baño metálico, con oro o plata. Y
    se observo en el MEB (Guillen-Rodríguez et al.,
    2001).

    IV. Marcaje de los aislados y cepa de
    Bt.

    La persistencia de las esporas en los granos de
    maíz en almacén y al intemperie se
    seleccionó Bt2, por su abundancia y como
    comparación se usó la cepa comercial de Bt
    HD-1. Se diseñaron dos medios de
    cultivo selectivos para la recuperación de las esporas de
    Bt con base a su patrón de susceptibilidad a los
    antibióticos de un Multidisco *MR Gram positivo
    (Sanofi).

    La cepa HD-1 con resistencia a ampicilina en AN,
    agregada estéril por filtración con membrana
    milipore (Gelman, Co) en concentración de 1500 µg/ml
    (Lakeside). En el caso del aislado de Bt2 se agrego al AN
    750 µg/ml del mismo antibiótico en la forma
    señalada. Para inhibir el crecimiento de hongos en el AN
    se usaron U/ml de nistatina (Mendoza et al.,
    2003).

    V. Producción y recuperación del
    complejo espora/cristal de Bt.

    Ambos aislados de Bt se usaron para la
    producción del complejo espora/cristal, se crecieron
    individualmente en matraces de 1000ml con 500 ml de: caldo soya
    tripticasa (CST), caldo soya tripticasa lactosa (CSTL) y caldo
    nutritivo (CN).

    Cada matraz se incubó a 30°C/96h, Tiempo al
    cual por con el microscopio se buscó un 95% de
    esporas/cristales, con la técnica de Anthony como
    indicador del final del crecimiento de Bt. Luego cada
    caldo se centrifugó a 10,000 rpm/10 minutos, u
    cada/complejo espora-cristal se recuperó por el método de
    coprecipitación lactosa-acetona y se realizó el
    bioensayo horizontal con gorgo (Sitophilus zeamaise. L) y
    con gusano cogollero (Spodeptera frugiperda. L).
    Finalmente se determino la especificidad toxica del complejo de
    Bt1 y 2 (Dulmge, 1970).

    VI. Supervivencia de esporas en granos de maíz
    en almacén y expuestos a la intemperie.

    Las esporas y cristales de Bt2 y de HD-1 se
    ajustaron a 4×106 esporas/semilla, luego se asperjaron
    en el maíz, que se colocó en costales de
    polipropileno de 15 x10 cm, como conservan en
    almacén.

    Los costales se introdujeron en un simulador de un
    ambiente de lamacen de 50 x 50 cm, y esteblecer el tiempo de
    supervivencia de las esporas, mediante el análisis de un 1 g de maíz, a
    intervalos de 24 h,con la técnica de cuenta viable en
    placa, la disgregación de las esporas unidas a los granos,
    se uso peptona (Difco) al 0.1% y 10 ppm de N- laurilsarocosine
    sodium Salt (LSD, Sigma), así se determinó la
    densidad de
    las esporas de Bt2 en granos con y sin pasteurizar.
    Mientras que el maíz asperjado con Bt2 se expuso al
    intemperie, para medir el efecto de la radiación solar en
    el tiempo de supervivencia de esporas de Bt, con
    intervalos de 12 h, por ello se tomó 1 g de maíz
    como se describió con las esporas de Bt en
    maíz en almacén, simultáneamente
    registró la temperatura y
    la humedad relativa del ambiente durante el periodo del
    experimento (Guillen- Rodríguez et al.,
    2001).

    VII. Análisis
    estadístico.

    La persistencia de las esporas de Bt2 y la cepa
    comercial HD-1 en granos de maíz se evaluó
    con la prueba estadística por comparación de
    medidas de Tukey.

    Resultados y Discusión

    En la figura 1 se muestra una
    magnificación de cristal sintetizado por Bt1 que se
    recuperó de granos en almacén, con cristales
    rectangulares y cúbicos e incluso amorfos, lo cual sugiere
    que tentativamente en esos granos existe también la
    típica variedad morrisoni de Bt en
    almacén (Sánchez-Yáñez,
    2004.

    En la figura 2 muestra la morfología
    típica de las esporas y cristales bipiramidales producidos
    por Bt2 a la 96h, lo que sugiere que se trata de la
    variedad kurstaki.

    La figura 4 presenta el resultado del bioensayo
    horizontal del complejo espora-cristal de Bt2 el que
    define que su toxicidad, con una mortalidad de 100% al gusano
    cogollero (Spodoptera frugiperda. L) IP del orden
    Lepidoptera. ; lo cual fue dependiente de la
    composición del cultivo en donde creció (Dulmage,
    1970) y del origen del Bt (Lambert y Perferoen, 1992).
    Estos resultados apoyan que en productos de almacén como
    los granos es posible detectar más de una variedad de
    Bt diferente a la común en este sito: la
    morrisoni.

    Los resultados de este bioensayo y las pruebas
    bioquímicas indican que se trata de Bt variedad
    kurstaki

    En la figura 5 se presenta el resultado del bioensayo
    horizontal del complejo espora-cristal de Bt1 en el
    gorgojo del maíz (Sitophilus zeamaise. L). En el
    que se registró una mortalidad del 70%, lo que depende en
    cierta nivel de la composición químico del medio de
    cultivo donde Bt1 se cultivó, este resultado apoya
    que la variedad de Bt1 aislada pertenece morrisoni,
    que es solo tóxica para ciertos IP del orden
    Coleoptera como el gorgojo.

    En el cuadro 1 se muestra el tiempo de supervivencia de
    las esporas de Bt2 y la cepa HD-1 en granos de maíz
    en el almacén a temperatura promedio de 20°C ±
    1 y humedad relativa del 10%. Mientras que a la intemperie fue
    10°C a las 5 AM, 25°C a las 12 AM; 35°C a las 16 pm,
    humedad relativa de 40%; entre 17-19 pm de 28°C y humedad del
    30% entre h durante la primavera. En donde la visibilidad de las
    esporas de ambos aislados de Bt fue mayor en el
    almacén y restringida cuando el maíz se expuso al
    ambiente (Pinock et al., 1971), se cree que la muerte de
    las esporas fue causada por la acción germinada de la luz
    solar, que se relacionó con la carencia de las
    pequeñas proteínas
    solubles en el ácido (PPSA) de la cubierta de las esporas
    de Bt, las PPSA les proporcionan a las esporas tolerancia a la
    radiación solar (Benoit et al., 1990, Griego y
    Spence, 1979; Ignoffo y García, 1978).

    Así se explica que en almacén de granos en
    ausencia de la luz solar, a relativa baja humedad, se evita la
    actividad depredadora de microorganismos que eliminan las esporas
    de Bt, lo que favorece la supervivencia de las esporas de
    la bacteria por un mayor tiempo, en contraste con la menor
    persistencia de las esporas de Bt en ambiente abierto o
    intemperie (Guillén-Rodriguez et
    al.,
    2001).

    Esto justifica en parte el empleo de
    complejos encapsulados que contienen la δ-endotoxina y la
    espora de Bt, para aumentar su
    persistencia y la eficacia del
    control biológico de insectos-plaga de almacén y
    agrícola.

    En el cuadro 2 se muestra la caracterización
    bioquímica de Bt1 que apoyan variedad
    morrisoni como la utilización de glucosa, de
    almidón, la hidrólisis de caseína, y la
    síntesis de catalasa así como su
    incapacidad para la producción de ureasa
    (Guillén-Rodríguez et al .,
    2001).

    La presencia de esporas de Bt de distintas
    variedades, supone que durante la siembra, cosecha y transporte de
    los granos desde el campo al almacén se dieron las
    condiciones para su contaminación con esporas de diversos tipos
    de Bt; probablemente provenientes de insectos y
    pájaros con contacto con las plantas (Dulmage y Aizawa,
    1982).

    A pesar de que las esporas de otras variedades de
    Bt no son comunes y su persistencia es relativamente
    breve, se supone que el tiempo en el cual, esos granos se
    colectaron y luego almacenaron prolongo la supervivencia de las
    esporas de la bacteria por esa ruta (De Lucca et al.,
    1982; Demock et al., 1989).

    Conclusión

    Los granos de almacén son una fuente potencial
    para el aislamiento de variedades de Bt tóxicos
    para insectos-plaga agrícola y de almacén. Aunque
    en el caso de los insectos-plaga que atacan granos, su control
    por Bt, puede ser relativamente sencillo por la
    persistencia de sus esporas puesto que se comprobó que sus
    esporas tienen baja viabilidad expuesta al ambiente
    abierto.

    Dedicatoria. A Juan Manuel Sánchez
    Marín por su ejemplo de disciplina y
    trabajo

    Agradecimientos. Al proyecto 2.7
    (2005-2006) de la CIC de la UMSNH, por el apoyo económico
    para la presente publicación. Al IIM-UMSNH por las
    facilidades del microscópico de barrido y su
    técnico Francisco Solorio por su apoyo en este trabajo, a
    Beatriz Noriega por su paciencia en la escritura.

    Literatura
    citada.

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    21. Luna-Olvera, H.A., y Peña-Cabriales, J.J.
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    Galán- Wong, J.L..
    RodríguezPadilla, C., Luna-Olvera, H.A. (eds). Universidad
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    22. Martín, P.A.W, and Travers, R.S. 1989.
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    24. Mendoza, M.M., Ortega-Mendez, JP, y
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    25. Meadows, M.P., Ellis, D.J, Butt, J., Jarrett, P, and
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    28. Rowe, O.E, and Margaritis, A. 1989. Bioprocess
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    Stewart ed.J, Russel (eds.), CRC press, Boca Ratón, Fl.
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    29. Sánchez- Yáñez, J.M. y
    Carrillo-Amezcua, J.C.. 2005. Manual de
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    de Investigaciones Químico-Biológicas. Universidad
    Michoacana de San Nicolás de Hidalgo, Morelia,
    Michoacán, México pp: 20-25.

    30. Sánchez-Yáñez, JM. y
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    31. Smith, R.A, and Couche, R. 1991. The phylloplane as
    a source of Bacillus thuringiensis variants. Appl. Environ
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    32. Sztejnberg, A, and Blakeman, J.P. 1973.
    Ultraviolet-induced changes in populations of epiphytic bacteria
    on beetroot leaves and their effect on germination of Botrytis
    cinerea
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    33. Waliszweski, S, and Pardio-Sedas, V.T. 1991.
    Pesticides if Bacillus thuringiensis and Bacillus
    cereus
    in soil supplemnt with grass or manure. Plant soil. 83
    :389-398.

    ANEXO

    Figura 1. Microfotografía
    electrónica de barrido de las esporas y cristales
    cúbicos, rectángulares y amorfos producidos por
    Bacillus thuringiensis (Btl) variedad morrisoni
    aislada de granos en almacén, cultivo de 96 h (10,000
    magnificaciones). E= espora, C=cristal.

    Cuadro 1. Persistencia de esporas de Bacillus
    thuringiensis (Bt2)
    y B. thuringiensis var
    kurstaki (HD-l) asperjados en maíz en
    almacén y expuesto a la intemperie.

    Tiempo
    (días)

    Bt1
    expuesto

    Bt
    HD-l

    Bt2 en
    almacén

    Bt
    HD-l

    UFC x
    lO6/g

    expuesto UFC x

    UFC x
    lO6/g

    En
    almacén

    maíz

    lO6/g
    maíz

    maíz

    UFC xlO6/g
    maíz

    O

    3.5a

    3.5a

    3.5a

    3.5a

    2

    3.0a

    3.5a

    3.0a

    3.0a

    4

    3.5c

    3.0a

    3.0a

    3.0a

    6

    3.4a

    2.5b

    3.1a

    3.0a

    8

    3.0a

    2.6b

    3.1 a

    3.0a

    10

    2.5b

    2.5b

    2.0b

    2.5b

    12

    2.0b

    1.5c

    2.1b

    2.0b

    14

    2.0b

    1.0c

    2.1b

    2.0b

    16

    1.5c

    1.0c

    2.1b

    2.0b

    18

    0.0

    0.0

    2.1b

    2.0b

    20

    0.0

    0.0

    2.10b

    2.0b

    21

    0.0

    0.0

    2.00b

    2.0b

    Letras iguales sin diferencia estadística
    Tukey ( PO.Ol), CV 10%. Datos
    ambientales: material ~ métodos.

    Cuadro 2 Comparación de las
    características bioquímicas de Bacillus
    thuringiensis (Bt1)
    de granos almacenados y Bacillus
    thuringiensis
    variedad morrisoni**.

    Prueba.

    Bt.
    var

    Bt. de
    almacén de este trabajo.

    morrisoni**

    Movilidad

    +

    +

    Formación de
    película

    +

    +

    Catalasa

    +

    +

    Ureasa

    Fermentación de glucosa

    +

    +

    Voges- Proskauer

    +

    +

    Hidrólisis de
    caseína

    +

    *

    Hidrólisis de
    almidón

    +

    +

    Hidrólisis de gelatina

    +

    +

    Citrato Simmons

    Reducción de nitratos

    +

    +

    (+)= respuesta positiva; (-) = respuesta negativa,
    los resultados son el promedio de 4 repeticiones **Cepa de
    referencia, donada por el Laboratorio.
    H.T. Dulmage, Facultad de Ciencias
    Biológicas-Universidad Autónoma de Nuevo
    León. Monterrey, Nuevo León,
    México.

     

    Villegas, M. J1.,

    2Guillen, R, D.,

    Martínez, M, H

    2*Sánchez-Yáñez J.
    M.

    1Ecología Microbiana,
    2*Microbiología Ambiental.

    1*autor correspondiente

    Instituto de Investigaciones
    Químico-Biológicas. Universidad Michoacana de San
    Nicolás de Hidalgo, Ed. B-1, Ciudad Universitaria. C.P.
    58030. Morelia, Michoacán, México.

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