Aislamiento de bacterias benéficas de raíz y su efecto sobre el crecimiento de maíz
El aislamiento y la selección
de bacterias benéficas de raíz (BBR) para inocular
maíz a dosis reducidas de fertilizante nitrogenado (FN),
es parte de una estrategia que no
afecta negativamente su rendimiento. Las BBR causan un efecto
similar al observado cuando el maíz se fertiliza con la
forma de N recomendada para esa variedad y región. Los
objetivos de
este trabajo
fueron: i) aislar y seleccionar BBR para la var de maíz
H-417 ii) analizar el efecto de inoculación de las BBR
sobre el crecimiento del maíz.
Las BBR se aislaron de raíces de maíz var
H-417, en agar D y D. posterior a su purificación se
sometieron la prueba de reducción de acetileno (ARA) para
detectar su capacidad de fijar N2. El maíz se inoculo y
cultivó en arena estéril en el sistema
hidropónico de jarras de Leonard en invernadero. Las
variables
respuesta evaluadas para el efecto de las BBR sobre el
maíz fueron: alturade la planta, peso fresco, seco,
contenido de proteína y nitrógeno total.
Los resultados muestran un efecto positivo de las BBR
sobre el crecimiento del maíz en términos del
incremento en su peso seco, por ciento de proteína y
nitrógeno total, en comparación con el maíz
sin inocular y fertilizado con nitrato de amonio. Lo anterior
indica que una selección cuidadosa de las BBR aumenta la
probabilidad
de una respuesta positiva del maíz a la inoculación
con estas rizobacterias y mejoraa el uso del FN, sin daño
ambiental.
Palabras clave: Rizobacteria, fitohormonas,
exudados radicales.
El maíz es un cereal de consumo
básico en México y
el mundo, requiere aplicación continua de fertilizante
nitrógenado (FN) como otras gramíneas domesticas
(Behling y Boddey, 1987; Baldani et al., 2000). El FN en
general no se usa en este cultivo no se aplica racionalmente,
ello causa perdida de fertilidad del suelo, eleva el
costo de
producción de este grano, además reduce su
área de cultivo y en consecuencia el país tiene que
importarlo (Pérez-Moreno Ferrera-Cerrato, 1996 y
Sánchez-Yáñez et al.,
1997).
Una estrategia para intentar minimizar y optimizar el
empleo del FN,
es el aislamiento, selección e inoculación del
maíz a la siembra con bacterias benéficas de
raíz (BBR), las cuales aumentan la absorción
radical del FN por estimulación fitohormonal (Berge et
al.,1991; García et al.,1995;
Sánchez-Yáñez et al., 1998; Jacoud
et al., 1999; James, 2000) a dosis inferiores de la FN
recomendada para la región, con ello se evita la contaminación ambiental, se ahorra en el
costo de producción y se alarga la vida útil
del recurso suelo (Valdivia, B., et al., 1997; Valdivia
et al., 1999; Sturtz y Nowak, 2000; Reis, et al.,
2000). Los objetivos de este trabajo fueron: i) aislar y
seleccionar BBR para la variedad de maíz H-417 ii)
analizar el efecto de esas BBR sobre el crecimiento del
maíz en invernadero.
Material y
métodos.
I. Origen de las BBR y semillas.
Las BBR se aislaron de raíces de maíz
variedad H-417 del Campo Agrícola Experimental de
Río Bravo (CAERIB), estado de
Tamaulipas en el noreste de México, según el
método
escrito por Llovera et al., (1994) que consiste en la
agitación de raíces y su desinfección con
alcohol
absoluto/5 min, lavado con agua
estéril tres veces con hipoclorito de sodio al 5% por
2/min, lavadas con agua destilada estéril, trituradas en
motero para sembrar luego en agar D y D semisólido en tubo
y en caja de Petri con agar 18g/L en el D y D con la siguiente
composición química g/L: KH2
PO4.. 0.4; K2H PO4..0.6; MgSO4 7H2O.. 0.0.2; NaCl ..0.1; CaCl
0.02; NaMo04 .2 H2O 0.02; trazas de FeCl; 4.0 ml de una
solución alcohólica de azul de bromotimol al 0.5%;
50g de malato de sodio (Merck) esterilizado por filtración
(membrana milipore Gelman 0.2 µ). El medio de cultivo se
ajusto a un pH de 6.8 con
NaOH 0.1M (Chelius y Triplett, 2000). Se inocularon tubos de 16 x
150 mm con 2 ml de D y D y un 0.05% de agar, la cepa de
Azospirillum brasilense de Brasil fue
proporcionada por el Dr. Ferrera-Cerrato del laboratorio de
microbiología de suelos del
Colegio de Postgraduados, Montecillos, Edo, México,
México. Las semillas de maíz (Zea mays L)
var. H-417 fueron donadas por el Instituto Nacional de Investigaciones
Agrícolas de Zaragoza, Coahuila, México.
Las BBR se mantuvieron por resiembra periódica en
agar nutritivo cubierto con aceite mineral
estéril entre 10-15°C.
II. Prueba de reducción de acetileno (ARA), o
fijación de N2.
La demostración de la fijación de
nitrógeno o ARA se realizó con los cultivos
bacterianos axénicos puros de acuerdo con Loera et
al., (1996). Los aislados de raíces de maíz se
crecieron en el agar D-D se incubaron a 30°C por 48 h, luego
con una manguera de hule de 10.0 mm de diámetro se les
agregó una mezcla de argón-oxígeno
en relación 95:5 para cambiar la atmósfera del tubo se
cerraron con tapones de hule de ampolleta; con una jeringa para
gases Hamilton
de 5 mL, se les extrajo el 10% de la fase gaseosa y se les
inyectó el 10% de acetileno, este gas se
generó al reaccionar 5.0g de carburo de calcio y 20 mL de
agua en un matraz Kitasato de 500ml cerrado con un tapón
de hule, y conectado a una torre de lavado mediante una manguera
de hule de 10/mm de diámetro. El acetileno producido en
cada tubo se extrajo con jeringa después de 0, 2, 3, 4 y
6h de incubación a 30°C, se analizó en un
cromatógrafo de gases Beckman GC-72-5 con detector de
ionización de flama, con una columna de Porapak N de dos
metros por cuatro mm. de diámetro a 50°C y
nitrógeno como gas de arrastre (25ml/min) según el
método descrito por Barber et al., (1976), Baldani
et al., (1986), Elbeltagy et al.,
(2000).
III. Inoculación del maíz en el
invernadero.
Las semillas de maíz variedad H-417 se sembraron
en jarras Leonard la gramínea se alimentó, con una
solución mineral de White, con la siguiente
composición química: K2HPO4
1M-1mL; KH2PO4 1M-1mL; MgSO4
7H2O 1M-1mL; CaCl2; 2H2O 1M-1mL;
FeSO4 trazas; solución de elementos menores:
(ácido bórico-2.68 g; ZnSO4
7H2O 0.22 g KCL-0.09g; Na-Mo04-trazas; agua
destilada 100 mL; pH 7.0) se utilizó un 1.0 mL; agua
destilada-1000 mL. Se dejaron 2 plantas de
maíz por jarra de Leonard (Luna y
Sánchez-Yáñez, 1991). El control relativo
fue el maíz fertilizado con NH4NO3,
1M-1mL/L en arena, con repeticiones por tratamiento. Las plantas
se mantuvieron durante 14 semanas, al terminar este
período las variables respuestas evaluadas fueron: altura
máxima alcanzada, peso fresco y seco (60°C/72 h)
nitrógeno total por el método Kjeldhal y
proteína según la A.O.AC. (Llovera et al.,
1994).
IV. Identificación de las BBR.
La identificación se basó en los criterios
de Luna y Sánchez-Yáñez (1991), Llovera
et
al., (1994), Loera et al.,(1996), que
consideran reacción al Gram, patron de
oxidación/fermentación de carbohidratos,
actividad proteolítica: caseína, urea, gelatina y
la respiratoria.
I. Aislamiento de las BBR.
La BBR fijadoras de N2 recuperadas de la variedad de
maíz H-417 se obtuvieron una por la técnica de
agitación y la otra por la de trituración de
raíces se observo que ambas BBR mostraron una evidente ARA
y que provenían de raíces expuestas en
agitación, lo que sugiere que por lo menos una fue
dominante en el rizoplano o en células
epiteliales de la raíz del maíz como se reporta
para Azospirillum de manera frecuente (Jacoud et
al., 1999).
Actividad reductora de acetileno (ARA) o fijación
biológica del N2.
En el cuadro 1 se muestra que la
ARA fue positiva y gradual para la BBR de maíz durante el
período de incubación, estos valores fueron
relativamente normales en comparación con lo que se
reportan para otras bacterias similares de gramíneas
(Baber et al., 1976; Baldani et al., 2000) al
considerar que el medio de cultivo en el cual crecieron y a
condiciones nutricionales que afectan la fijación de
nitrógeno son dependientes del tipo de BBR.
Evaluación de la inoculación del
maíz con las BBR.
El cuadro 2 presenta el efecto de las BBR sobre el
maíz H-417, donde se observa que A. lipoferum causo
un aumento en el peso seco, en el por ciento de proteína y
en el N total el cual fue superior al efecto observado en el
maíz inoculado con A. brasilense y Azotobacter
beijerinckii (Az. beijerinckii), los cuales a su vez
superaron al maíz solo fertilizado con N y obviamente al
maíz sin inocular y sin N, estos datos concuerdan
con los reportados por otros trabajos en los que Burkholderia
spp causó un incremento en el peso seco de una
variedad de maíz y además mantuvo un rendimiento
similar al observado en el maíz usado como control
relativo (García et al.,1995; Reis, et al.,
2000; García et al.,2005;) en donde la
inoculación de BBR en maíz dosis reducidas de FN
causó un efecto positivo sobre su crecimiento así
como se reporta para otras gramíneas (Baldani, et
al., 2000; Reis et al., 2000) en este sentido la
inoculación es una alternativa para la producción
de maíz (Sturtz y Nowak, 2000). Las BBR aceleran la
actividad radical mediante la absorción eficiente del N a
dosis reducidas (Valdivia et al., 1997; García
et al., 2001, García et al.,2005). A.
lipoferum fue la BBR que causó el mayor efecto
positivo sobre el por ciento de proteína como se reporta
en otras gramíneas que se inoculan con BBR (Elbeltagy
et al., 2000; Chelius y Triplett, 2000). El cuadro1
también se muestra que el por ciento de proteína de
N total, del peso seco y fresco del maíz inoculado fue
equivalente o mejor al similar del maíz usado como control
relativo. En general A. lipoferum influyo positivamente
sobre el desarrollo de
los diferentes tejidos del
maíz, lo que no se observó en el maíz
inoculado con las otras BBR como A. brasiliense incluso en
el maíz usado como control relativo (García et
al., 1995; Reis et al., 2000).
Identificación de las BBR
En el cuadro 3, se indican los resultados de las
pruebas
bioquímicas de identificación de las BBR. Como se
indica BBR denominada S-17 no hidrolizó la gelatina, ni la
caseína. Fue positiva a la producción: de ureasa,
catalasa y oxidasa: utilizó los citratos como única
fuente de carbono y
energía. Redujo los nitratos a nitritos: tuvo una
reacción negativa a la prueba de Voges Proskauer, rojo de
metilo e indol; no formo ácido sulfhídrico en el
agar triple azúcar–hierro (TSI),
ni en ácido y/o gas de ribosa, maltosa, sacarosa, rammosa,
lactosa y xilosa, de la glucosa fue
débil. Estos datos indican que S-17 corresponde a
Azospirillum lipoferum según Llovera et al.,
(1994) y Loera et al., (1996) con excepción de que
este aislado oxida la glucosa y reduce los nitratos apoyado en la
morfología
de la figura 1 al microscopio
electrónico como bacilos típicos del genero
Azospirillum.
En lo que respecta al aislado S-12 su patrón
bioquímico indica que se trata Azotobacter de la
especie: beijerinckii, por la producción de quistes
y por la carencia de movimiento
como por la incapacidad para hidrolizar el almidón, como
se reporta en la literatura (Baldani et
al., 1986; Baldani et al., 2000) para BBR de este
tipo.
Se concluye que el aislamiento de BBR del tipo de A.
lipoferum a variedades de maíz representan en
alternativa para producir esta gramínea a dosis reducidas
de FN bajo un esquema de producción sustentable de este
tipo de gramíneas..
Dedicatoria.
Al Dr Eduardo Aguirre-Pequeño, fundador de la
FCB, de la facultad de Agronomía , luchador social,
comprometido con la salud en todo nivel,
estudioso de la gerantología, filósofo y maestro
sin comparación de la UANL y el estado de
Nuevo León, México.
Agradecimientos
A la CIC de la UMSNH proyecto 2.7
(2005-2006) por las facilidades para la publicación de
este trabajo. A la Facultad de Ciencias
Biológicas de la UANL por el apoyo económico y el
microscopio electrónico
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Cuadro 1. Actividad de reducción de acetileno
(ARA) o fijación biológica del N2 por
rizobacterias benéficas de raíces de maíz
(Zea mays L) var. H-417.
Actividad reductora de acetileno | |||||||
Tiempo (h) | |||||||
Aislado/Cepa | 0 | 1.5 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
Azospirillum lipoferum | 0 | ND | 4.2 | 6.9 | 10.6 | ND | ND |
Azotobacter beijerinckii | 0 | 2.1 | ND | 6.3 | ND | 7.1 | 10.2 |
Burkholderia | 0 | 1 | 1.7 | 6.3 | 8.9 | 11 | ND |
Bacillus cereus | 0 | 0 | 0 | 4.2 | 0 | 0 | 0 |
La prueba se realizó con las bacterias crecidas
en D-D semisólido a 30° C/12 h. Todos los valores
son el promedio de 4 repeticiones. ND=No determinado. *Donada por
Dr. T. Van Van, Lab Ecología microbiana
Universidad Claude Bernard, Lyon, Francia, **Colección
Lab. Microbiología Ambiental, IIQB-UMSNH.
Cuadro 2. Efecto de la inoculación de
rizobacterias benéficas de raíz sobre crecimiento
de maíz (Zea mays L) variedad H-417.
Aislado/fertilización | Longitud de la planta | Longitud de hoja (cm) | Peso fresco (g) | Peso seco (g) | % de proteína | N total (g) |
Azospirillum lipoferum | 64.5ª | 62.8ª | 39.6ª | 2.4ª | 12.68ª | 2.03ª |
A. brasilense | 36d | 34.5c | 33.0b | 2.4ª | 7.87b | 1.26ª |
Azotobacter beijerinckii | 42c | 29c | 37.2ª | 2.1ª | 8.05b | 1.28ª |
Maíz*NH4NO3 sin | 51.5b | 43b | 36.4ª | 2.0a | 10.85ª | 1.73a |
Maíz** sin fertilizar, sin | 26.7d | 29.8c | 20.4c | 1.5b | 7.02b | 0.64b |
Realizado en jarra de Leonard, 8 repeticiones. Letras
iguales sin diferencia estadística según Tukey (P<0.05)
todos los valores son el promedio de 16 plantas. *Control
relativo, ** control absoluto.
Cuadro2. Identificación bioquímica
de las bacterias benéficas de raíces del
maíz H-417 de Río Bravo, Tam.
Características | Azospirillum (S-10) | Azosipirllum | Azotobacter (S-17) | Azotobacter |
Hidrólisis del almidón | – | – | – | – |
Hidrólisis de gelatina | – | – | – | – |
Hidrólisis de casína | – | – | – | – |
Ureasa | + | + | + | + |
Catalasa | + | + | + | + |
Oxidasa | + | + | + | + |
Citrato | + | + | + | + |
Ácido Sulfhídrico | – | – | – | – |
Reducción de nitratos | + | + | + | + |
Voges-Proskauer | – | – | – | – |
Rojo de metilo | – | – | – | – |
Indol | – | – | – | – |
Ácido y Gas a partir | ||||
Glucosa | D* | D* | + | + |
Maltosa | – | – | + | + |
Sucrosa | – | – | + | + |
Rammosa | – | – | + | + |
Lactosa | – | – | + | + |
Xilosa | – | – | + | + |
Producción de quiste | – | – | + | – |
(D*) Reacción débil (+)=Reacción
positiva (-)= Reacción Negativa. **Cepas donadas por el
laboratorio de Microbiología del Suelo. Colegio de
Postgraduados, Montecillos, Edo. de México.
Figura 1. Morfología al microscopio
electrónico de transmisión de Azospirillum
lipoferum (S-10) aislada del rizoplano de maíz (Zea
mays L) var H-417. (7000X).
S1 Posada. C.,
J1+
Ruiz-Ordoñez., 2
J. Villegas M
Sánchez-Yáñez,
J.M3
1Microbiología Industrial y Suelo,
FCB,
1+Unidad de Microscopia electrónica, F Medicina,
Universidad Autónoma de Nuevo León, Apdo. Postal
4141, San Nicolás de los Garza, N.L. CP.64000.
México. Ecología microbiana2.
Microbiología Ambiental3*
*autor correspondiente
Instituto de Investigaciones Químico
Biológicas, Ed.B-1, C.U. Universidad Michoacana de San
Nicolás de Hidalgo, Morelia, Mich., CP.58000.
México.