Caracterización e implicaciones del virus de la gripe aviar a nivel celular
- Objetivos
- Marco
teórico - Virus.
- Descripción del
virus - Hemaglutinina y
neuraminidasa - Papel patogénico de la
Neuraminidasa - Otras
proteínas - Variación
antigénica - Principales virus de la
gripe aviar - Pruebas de laboratorio para
detectar el virus de la gripe aviar - Bibliografía
Analizar el funcionamiento celular del virus de la gripe
aviar, especialmente la variante H5N1 y su participación
en el desarrollo de
la enfermedad.
OBJETIVOS ESPECIFICOS
Caracterizar las estructuras
presentes en el virus de la gripe aviar (cepa H5N1).
Observar la estructura
celular de la cepa patógena y analizar las consecuencias
que produce el virus al hacer contacto con la cepa, a
través análisis de inmunofluoresencia.
Realizar extracción de las células
afectadas por el virus e inocularlas en células sanas del
mismo tipo y observar su desarrollo.
Palabras claves
Ortomixovirus, hemaglutina, neuraminidasa, cepa
H5N1
La gripe aviar, más conocida como gripe del pollo
fue identificada por primera vez en Italia hace
más de 100 años. Se trata de una enfermedad viral
muy contagiosa causada por las cepas tipo A del virus de la gripe
que puede afectar a todas las especies de aves.
Los virus de la gripe aviar son miembros de la
familia Orthomyxoviridae,
género
Influenzavirus tipo A
Estos virus están divididos en subtipos sobre la
base de sus proteínas
de membrana
hemaglutinina (H) y
neuraminidasa (N). Hasta la fecha se
reconocen 15 subtipos de hemaglutininas del virus de la gripe
(H1-H15) y 9 subtipos de neuraminidasas (N1-N9). Hasta ahora,
todos los brotes de las formas muy patogénicas han sido
causados por los virus A de la gripe de los subtipos H5 y
H7.
Los síntomas de la gripe aviar en humanos
varían desde síntomas parecidos a la gripe
típica (fiebre, tos,
dolor de garganta y dolores musculares) hasta infecciones
oculares, neumonía, dificultad respiratoria aguda y
otras complicaciones graves que pueden suponer una amenaza para
la vida.
Se ha confirmado la afectación humana de la gripe
aviar desde 1997:
1997: En Hong Kong, la gripe aviar A (H5N1)
afectó tanto a pollos como a humanos. Fué la
primera vez que se encontró la transmisión directa
de aves a humanos. Durante este brote 18 personas fueron
hospitalizadas y 6 de ellas fallecieron. Para controlar el brote
y eliminar la fuente del virus las autoridades sanitarias mataron
cerca de 1,5 millones de pollos.
La investigación de este brote concluyó
que el contacto estrecho con las aves infectadas vivas
había sido el origen de la infección humana.
Estudios genéticos posteriores evidenciaron que el virus
había saltado directamente de las aves al hombre. Se
produjo también una transmisión limitada al
personal
sanitario, sin llegar a causar síntomas de
gravedad.
1999: En Hong Kong, se confirmaron dos casos de
gripe aviar A H9N2 en niños.
Ambos pacientes se recuperaron y no se confirmaron otros casos.
Los hechos sugieren que las aves de corral fueron la fuente de
infección y el principal modo de transmisión
fué de aves a humanos. Sin embargo, la posibilidad de
transmisión de persona a persona
permaneció abierta. Se informó de infecciones
humanas H9N2 en China en
1998-1999.
2003: Dos casos de gripe aviar A (H5N1)
ocurrieron entre los miembros de una familia de Hong
Kong que había viajado a China. Una persona se
recuperó y otra murió. No se determinó donde
habían sido infectadas estas personas. Otro miembro de la
familia murió de una enfermedad respiratoria en China,
pero no se tomaron muestras. No se informó de otros
casos.
Se confirmaron en Holanda infecciones de gripe aviar A
(H7N7) entre las personas que trabajan con aves de corral y sus
familias durante un brote de gripe. Se informó de
más de 80 casos de enfermedad H7N7 (los síntomas
fueron confinados a infecciones oculares con algunos
síntomas respiratorios) y un paciente murió (un
veterinario que había visitado una granja afectada).
Había evidencia de transmisión de humano a
humano.
En un niño en Hong Kong se confirmó
infección por H9N2. El niño fué
hospitalizado pero se recuperó.
2003-2004: Un brote de gripe aviar está
afectando a las poblaciones de aves en países
asiáticos. El brote está causado por el virus de la
gripe subtipo H5N1.
Este brote ha causado también casos de infección en
humanos en Vietnam y Tailandia, habiendose producido
muertes.
Durante 2005 se han observado cambios
importantes en la epidemiología de la enfermedad en los
animales. Se
siguen registrando casos humanos, y el virus se ha extendido a
nuevos países, con el consiguiente aumento del
tamaño de la población en riesgo. Cada caso
humano nuevo brinda al virus otra ocasión para mutar y
transformarse en una cepa pandémica plenamente
transmisible.
Los datos disponibles
muestran que el virus H5N1 es hoy endémico en algunas
zonas de Asia, habiendo
establecido su nicho ecológico en las aves de
corral.
El riesgo de aparición de nuevos casos humanos
persistirá, al igual que las oportunidades de
aparición de un virus pandémico. Los brotes se han
reproducido pese a las enérgicas medidas de control
adoptadas, entre ellas el sacrificio de más de 140
millones de aves. Un gran número de aves migratorias
salvajes, el reservorio tradicional de los virus A de la gripe,
están muriendo actualmente como consecuencia de una cepa
hiperpatógena de H5N1. Los patos domésticos pueden
excretar grandes cantidades de virus hiperpatógeno sin
acusar signos de la
enfermedad. La intervención silente de estos animales en
el mantenimiento
de la transmisión complica aún más el
control de las aves y es un problema añadido para evitar
los comportamientos de riesgo en las poblaciones
humanas.
Debido a las continuas transformaciones de los virus de
la gripe, no es posible prever ni el momento ni la gravedad de la
próxima pandemia. El paso final – una mayor
transmisibilidad entre personas – puede tener lugar por dos
mecanismos principales: un fenómeno de
redistribución, consistente en un intercambio de material
genético entre el virus humano y el virus aviar durante la
coinfección de un hombre o un cerdo, y un proceso
más gradual de mutación adaptativa que
conferiría al virus aviar una creciente capacidad para
unirse a las células humanas en las sucesivas infecciones
de personas. La redistribución puede desembacar en un
virus pandémico plenamente transmisible, presagiado por un
súbito incremento de los casos y una propagación
explosiva del virus. Las mutaciones adaptativas, que se
manifestarán al comienzo en forma de pequeños
conglomerados de casos humanos con indicios de una
transmisión limitada, nos concederán probablemente
algún tiempo para
tomar medidas defensivas.
Los virus son parásitos intracelulares
submicroscópicos, compuestos por ARN o por ácido
desoxirribonucleico (ADN) —nunca
ambos— y una capa protectora de proteína o de
proteína combinada con componentes lipídicos o
glúcidos. En general, el ácido nucleico es una
molécula única de hélice simple o doble; sin
embargo, ciertos virus tienen el material genético
segmentado en dos o más partes. La cubierta externa de
proteína se llama cápsida, y las subunidades que la
componen, capsómeros. Se denomina nucleocápsida al
conjunto de todos los elementos anteriores. Algunos virus poseen
una envuelta adicional que suelen adquirir cuando la
nucleocápsida sale de la célula
huésped. La partícula viral completa se llama
virión. Los virus son parásitos intracelulares
obligados, es decir: sólo se replican en células
con metabolismo
activo, y fuera de ellas se reducen a macromoléculas
inertes.
Replicacion viral es un proceso que incluye
varias síntesis
separadas y el ensamblaje posterior de todos los componentes,
para dar origen a nuevas partículas infecciosas. La
replicación se inicia cuando el virus entra en la célula:
las enzimas celulares
eliminan la cubierta y el ADN o ARN viral se pone en contacto con
los ribosomas, dirigiendo la síntesis de proteínas.
El ácido nucleico del virus se autoduplica y, una vez que
se sintetizan las subunidades proteicas que constituyen la
cápsida, los componentes se ensamblan dando lugar a nuevos
virus. Una única partícula viral puede originar una
progenie de miles. Determinados virus se liberan destruyendo la
célula infectada, y otros, sin embargo, salen de la
célula sin destruirla por un proceso de exocitosis que
aprovecha las propias membranas celulares. En algunos casos las
infecciones son "silenciosas", es decir, los virus se replican en
el interior de la célula sin causar daño
evidente.
Ortomixovirus, grupo de virus
que constituye la familia Orthomyxoviridae, cuyo genoma
está formado por ácido ribonucleico (ARN)
monocatenario lineal. Antes se les conocía como mixovirus,
virus de mucosas, y se incluía tanto a los ortomixovirus
como a los paramixovirus en una sola familia. Sin embargo, al
conocerse mejor sus características se han clasificado en
dos familias distintas.
El virus de la gripe (influenza) es el más
representativo de los ortomixovirus. La familia incluye los
influenzavirus tipos A, B y C. Los A y B constituyen el
género Influenzavirus.
El ARN de la partícula viral está
segmentado en 8 fragmentos que codifican las proteínas
presentes en ella. La nucleocápsida es helicoidal y su
diámetro oscila, al ser pleomórfico, entre 80 y 100
nanómetros. En la parte externa de la envoltura
lipídica aparecen por separado dos tipos de
espículas (glicoproteínas con carácter antigénico): una
hemaglutinina (H) y una neuraminidasa (N). La primera es
responsable de la aglutinación de hematíes en
presencia del virus y la segunda es una enzima que interviene en
la fase final de la liberación del virus.
El hecho de poseer un ARN fragmentado hace que las
combinaciones antigénicas sean más numerosas (como
consecuencia de cambios genéticos ocurridos en la
formación de H y N), dando lugar a cepas distintas para
las que la población no presenta anticuerpos. Por esta
razón, la inmunidad específica adquirida para una
cepa en concreto no
sirve para las nuevas que se originan.
El influenzavirus tipo A es el causante más
común de pandemias (epidemias de amplia extensión),
el tipo B causa mayoritariamente epidemias locales y el de tipo
C, de origen animal, rara vez es patógeno.
Papel patogénico de la
hemaglutinina
La HA es una glicoproteína formada por tres
subunidades codificadas por el gen viral 4, que tiene la
capacidad de aglutinar hematíes de diferentes especies
animales mediante su unión específica a los
receptores celulares que contienen ácido siálico22
.
Sus funciones
son:
– Fijación y unión al receptor de la
célula huésped.
– Penetración de las partículas virales a
través de la membrana celular.
– Actuación como antígeno mayor del virus que se expresa en
la superficie de las células infectadas. La HA está
presente en la partícula viral en una forma precursora
(HA0) y precisa de una activación enzimática para
producir la forma activa (cleavage activation). Procesos
similares son necesarios para la entrada en la célula
huésped de una gran variedad de virus como el VIH y
parainfluenza. La hidrólisis enzimática de la HA0
determina un cambio
conformacional de la proteína, dando lugar a dos
subunidades HA1 y HA2 que permanecen unidas por un puente
disulfuro. Esta hidrólisis es un requisito esencial previo
para que la glicoproteína pueda fijarse al receptor
celular y participar el en proceso patogénico e infectivo
del virus. Según el subtipo, el proceso hidrolítico
determina la pérdida de 1-6 aminoácidos.
El tropismo celular y la capacidad de
diseminación sistémica del virus influenza dependen
de los receptores funcionales del huésped, de la distribución de las proteasas capaces de
realizar la hidrólisis y de la permisividad de la
replicación viral por parte de las células
huésped 20.
Las enzimas proteolíticas capaces de hidrolizar
la HA y activarla se clasifican en 2 grupos:
– Enzimas de tipo tripsina: capaces de hidrolizar la HA
perteneciente a cepas avirulentas y virulentas.
– Enzimas dependientes del Calcio: capaces de activar
cepas virulentas con numerosos residuos básicos en el
entorno y punto de corte de la HA. Están localizadas en el
aparato de Golgi de las células eucariotas. La más
estudiadas han sido la Furina (codificada por el gen Fur) que
reconoce la secuencia B-X-B-R. La proteína PC6 sólo
activa cepas virulentas con múltiples residuos
básicos en la zona de corte hidrolítico. Existen 2
características estructurales que determinan la capacidad
para ser hidrolizada la secuencia aminoácido de la
HA:
– Secuencia aminoácido específica del
punto de corte.
– Secuencia aminoácido existente en la vecindad
del anterior.
Activación proteolítica de HA.
Papel
patogénico de la Neuraminidasa
La NA es un homotetrámero codificado por el gen 6
del virus. Es una enzima que cataliza e hidroliza las uniones
á-cetósido entre un ácido siálico
terminal y una D-galactosa o D-galactosamina
adyacente.
Sus principales funciones son la eliminación de
los residuos de ácido siálico de la HA y de la
superficie celular, favoreciendo la liberación de las
partículas virales y diseminación a otras
células (difusión-infección). Participa en
el transporte del
virus a través de la mucina presente en el tracto
respiratorio, permitiendo la llegada del virus a otras
células epiteliales
(expansión-infección).
Además puede unirse al plasminógeno, lo
que originaría el aumento de la concentración local
de proteasa15,19,22. Esto se ha visto en algunas cepas aviares y
en las humanas. Papel del plasminógeno
La envoltura está compuesta por una doble capa
lipídica, en cuya superficie interna hay una
proteína de matriz M, la
cual proporciona estabilidad al virión y crea un medio ambiente
selectivo para la inclusión de proteínas
codificadas por el virus que resulta importante en el estadio
temprano de la replicación viral. La proteína M
también sirve como antígeno específico de
tipo (2, 5, 6). Dentro de la envoltura existe la
nucleocápside, la cual está fragmentada en 8
segmentos.
Los datos disponibles sugieren que los segmentos del
genoma son incorporados al azar a viriones maduros, un proceso
que sólo rara vez podría dar como resultado un
virión que contenga todos los segmentos del genoma
necesarios para la infección, pero que podría
explicar una mayor capacidad de infección determinada por
la agregación de viriones de la influenza.
Al estar agregados, se complementan dos o más
partículas virales, mientras que, si se presentaran
aislados y cada uno careciera de uno o más segmentos de
ARN, podría no producirse infección. Este proceso
al azar explicaría también la gran frecuencia de
reordenamiento de segmentos de ARN entre dos virus de influenza
que ocurre cuando las células son infectadas en forma
simultánea con dos virus de influenza diferentes (2, 5,
6).
Las mutaciones puntuales en los genes que codifican
estos antígenos ocasionan cambios en las proteínas
virales, que permiten evadir la respuesta inmune y llevan a la
aparición de enfermedad, aun existiendo anticuerpos
previos; esta situación se denomina cambio
antigénico menor (antigenic drift). Si llega a producirse
un intercambio genético entre diferentes especies de virus
de la influenza, con reordenamiento del genoma y
generación de un nuevo subtipo viral, se produce el
fenómeno conocido como cambio antigénico mayor
(antigenic shift). La variación antigénica
involucra sobre todo a la hemaglutinina y la neuraminidasa. La
hemaglutinina es la más importante, ya que está
involucrada con mayor frecuencia y porque los anticuerpos contra
esta proteína neutralizan la infección (2, 6,
7).
PRINCIPALES VIRUS DE LA GRIPE
AVIAR
1. Influenza A H5
• 9 subtipos diferentes
• Puede ser LPAI o HPAI.
• Se han descrito infecciones por H5 en humanos y
en ocasiones han causado enfermedad severa y muerte.
• No se ha demostrado claramente la
transmisión persona-persona, pero sí la
transmisión animal-persona y la transmisión
animal-interespecie
2. Influenza A H7
• 9 subtipos distintos
• Puede ser LPAI o HPAI.
• La infección por H7 en humanos es rara,
pero puede ocurrir entre personas que tienen contacto estrecho
con pájaros infectados. Los síntomas pueden ser
desde conjuntivitis hasta graves síntomas
respiratorios.
• Igualmente sólo se ha demostrado la
transmisión animal-persona e
interespecie animal.
3. Influenza A H9
• 9 subtipos diferentes
• Sólo se han descrito en la forma
LPAI
• Han sido confirmadas 3 infecciones en humanos,
por ahora24.
• Solamente se ha demostrado la transmisión
animal-persona y animalanimal de la misma o de otra
especie.
Ciclo biológico
Pruebas de
laboratorio
para detectar el virus de la gripe aviar
Análisis de
inmunofluorescencia
El análisis de inmunofluorescencia puede
utilizarse para la detección de virus en muestras
clínicas o en cultivos celulares. Son preferibles las
muestras clínicas, obtenidas lo antes posible tras la
aparición de los síntomas, ya que el número
de células infectadas presentes disminuye durante el curso
de la infección. Es mejor realizar este análisis en
cultivos celulares inoculados, pues permite la
amplificación de los virus que puedan estar
presentes.
Material necesario:
• Juego de
reactivos de la OMS para la identificación del virus de la
gripe A/H5 (versiones 1997-98, 2003 ó 2004). Los reactivos
de este juego para el análisis de inmunofluorescencia
comprenden los siguientes:
– mezcla de anticuerpos monoclonales específicos
de la gripe A/H5
– mezclas de
anticuerpos monoclonales específicos de la gripe A y
específicos de la gripe B
– anticuerpos monoclonales específicos de la
gripe A/H1 y de un subtipo A/H3.
• conjugado de isotiocianato de fluoresceína
(FITC) y anti-IgG de ratón
• Portaobjetos para microscopio
• Cubreobjetos, 24 x 60 mm
• Líquido de montaje
• Acetona
• Microscopio de
inmunofluorescencia.
Procedimiento
Esta prueba se realizará siguiendo las
instrucciones incluidas en el Juego de reactivos de la OMS para
la gripe. Las células epiteliales se lavan por
centrifugación para eliminar toda la mucosidad
contaminante; a continuación se fijan y se tiñen
con anticuerpos monoclonales específicos. Las
células del epitelio respiratorio contenidas en una
muestra
clínica son sumamente lábiles y se deterioran con
facilidad, por lo que habrán de mantenerse refrigeradas
con hielo durante la manipulación y no centrifugarse a
más de 500 g. Habrá que incluir portaobjetos
de control con células infectadas por la gripe A/H3 y H1
(y, si se dispone de ellas, células infectadas por el H5)
y células no infectadas para controlar debidamente los
anticuerpos monoclonales y el conjugado y para facilitar la
interpretación de la tinción
específica.
Interpretación de resultados
La tinción específica debe dar una intensa
fluorescencia intracelular de color verde
manzana.
Puede observarse fluorescencia nuclear o
citoplásmica. Es importante velar por que la densidad celular
sea suficiente. Puede aceptarse como resultado positivo la
presencia de una o más células intactas que
muestren fluorescencia intracelular específica. Como se ha
demostrado que los anticuerpos monoclonales disponibles en el
comercio para
la caracterización de subtipos de gripe A/H1 reaccionan de
forma cruzada con los subtipos de gripe A/H5, incluidas las cepas
actualmente circulantes (2004), deben realizarse pruebas
confirmatorias utilizando el anticuerpo monoclonal incluido en el
juego de reactivos de la OMS.
http://www.infectio.org/upload/eve24.pdf
www.who.int/entity/csr/disease/
avian_influenza/guidelines/labtests.pdf
www.tecnociencia.es/especiales/
gripe_aviar/gripe_aviar.htm
–
http://remi.uninet.edu/2005/11/REMIA032.htm
Diana Cristina Hurtado
Solano
Estudiante de Biologia
Sandra Milena Lozano Triana
Ana Silvia de las Rosas Diaz
Rodriquez
Diana Marcela Montoya
Navarro
Paola Andrea
Arevalo