Metabolito bacteriano a partir de Burkholderia cepacia como agente biocontrolador en cultivos de interés agrícola (página 2)

4.
CARACTERÍSTICAS MÁS IMPORTANTES DE LA ESPECIE
Pseudomonas (Burkholderia) cepacia.

El género
Pseudomonas presenta un amplio espectro nutricional y no
requiere de factores de crecimiento para su desarrollo.
Así se ha encontrado como un género dominante en la
rizosfera del maíz en
diferentes localidades edafoclimáticas (Hebber,1999).
También aparecen poblaciones altas en la rizosfera de las
plantas de trigo
y plantas ornamentales (Hernández, 2000).

Pseudomonas (Burkholderia) cepacia tiene una alta
frecuencia de aparición, en la mayoría de los casos
estudiados (Hernández, 1998). En los últimos
años, esta especie adquiere vital importancia en estudios
relacionados con la agricultura,
debido fundamentalmente a la producción de una amplia gama de
metabolitos activos que
influyen positivamente sobre el crecimiento y desarrollo
saludable de las plantas.

Se caracteriza por ser bacilos cortos Gram negativo,
mótiles y no formadoras de esporas, produce pigmentos no
fluorescentes difusibles en el agar (piocinina) y acumula
gránulos de poli -b
hidroxibutirato (PHB). Es lecitinasa, ureasa, lisina
descarboxilasa y amilasa negativa. Puede ser gelatinasa positiva
o negativa (Pallerony, 1984).

Existen cepas patogénicas y saprofiticas, dado
fundamentalmente por su gran diversidad genética.
De aquí la importancia, de trabajar con su parte activa,
es decir con los metabolitos secundarios que al parecer son los
responsables de los efectos benéficos en plantas por lo
que al eliminar la célula
se evita cualquier problema de índole ecológico.
Esta especie produce diferentes tipos de sideróforos
(Meyer et al., 1989) y ácido indol
acético.

5. CONDICIONES DE
CRECIMIENTO MICROBIANO.

La composición de los medios de
cultivos para la multiplicación de B. cepacia, se
informa en general en la literatura especializada,
los de mayor frecuencia reportados son King A, King B (King y
Rang, 1954) en medio liquido, sin embargo se reportan otros para
su empleo en
mayores volúmenes dependiendo de la utilidad final
que se requiera (Ortiz et,al 2000; Sánchez et
al., 2003). Su temperatura
óptima de crecimiento es 37± 30C, se desarrollan a un
pH
7.2± 0.2. Tienen un crecimiento
rápido tanto en medio agitado como estático
(Miranda, 1998).

En estudios con metabolitos secundarios se debe tener en
cuenta que los mismos se producen durante la fase estacionaria de
crecimiento y su producción esta en dependencia de las
condiciones de cultivo, por lo que los compuestos fermentativos
relacionados con uno u otro metabolito resultan complejos y se
pueden observar variaciones en la concentración de los
mismos, aún cuando se mantengan las mismas condiciones de
fermentación, a diferencia de los procesos donde
se persigue la obtención de biomasa de un microorganismo
determinado, la cual no está sometida directamente a las
complejidades de las rutas metabólicas y sus respectivas
regulaciones (Fernández, 1998).

6. MECANISMOS DE
ACCIÓN. CONTROL
BIOLÓGICO DE PATÓGENO.

El uso de antagonistas microbianos para el control de
fitopatógenos se ha catalogado como un importante
complemento en el manejo integrado de las enfermedades de las plantas.
El género Pseudomonas,presenta propiedades que lo
ubican dentro de las PGPR como agentes de biocontrol, debido a
que las bacterias de
este grupo tienen
la capacidad de crecer colonizando los órganos de las
plantas tales como raíces y tubérculos, utilizan un
gran número de sustratos orgánicos
comúnmente encontrados en exudados radicales y producen
una gran variedad de metabolitos secundarios tóxicos a
hongos y
bacterias fitopatógenos, entre los cuales se destacan los
sideróforos, los antibióticos y los alcaloides
quinolisidínicos (Hernández et al.,
1999).

El modo de acción
de Pseudomonas sp incluye la inhibición del
patógeno por competición por el hierro III
(hipótesis de los sideróforos) o por
productos
volátiles o difusibles (antibiosis) y la inducción de resistencia en
plantas (Meyer, 1999).

Pseudomonas (Burkholderia) cepacia se destaca por
producir diferentes tipos de sideróforos,
antibióticos, alcaloides quinolisídinicos de
naturaleza
antibiótica (Hernández, 1999), ácido
cianhídrico y ácido salicílico . En los
últimos años se ha prestado especial interés a
los sideróforos, como uno de los principales metabolitos
implicados en la actividad de biocontrol.

7.
SIDEROFÓROS: palabra griega que significa portador de
hierro.

Los sideróforos son pigmentos extracelulares
fluorescentes con alta afinidad por el hierro III (Kfe
>
1030,) de color amarillo
verdoso, solubles en agua y de bajo
peso molecular (500-1000 Da) (Dybas et al, 1995),
producidos por una gran variedad de microorganismos crecidos en
condiciones de hierro limitante.

La hipótesis de los
sideróforos, plantea que estos suprimen la enfermedad
mediante el secuestro de
hierro III convirtiéndose así este elemento en un
factor limitante para el crecimiento de patógenos en la
rizosfera (Schroth y Hancock, 1982). Cuando el sideróforos
forma el complejo con el hierro, este último se hace
inaccesible para los microorganismos patógenos, los cuales
no poseen los receptores proteicos específicos para
adquirir el hierro enlazado. Por otro lado, las bacterias
productoras de este metabolito, poseen un sistema de
transporte y
un receptor de membrana específico, que reconocen el
complejo sideróforo– hierro III, por lo cual se
considera que estos sirven como vehículo de este elemento
hacia el interior de la célula
bacteriana (Xiao and Kasaalita, 1995).

Las plantas por su parte han desarrollado diferentes
estrategias por
ejemplo liberación de protones o la excreción de
agentes reductores para poder
incluirlos en su propia nutrición (Chen,
1995).

Virtualmente todos los microorganismos (excepto
lactobacillus) requieren de hierro para satisfacer sus
necesidades vitales, pues éste participa en procesos
biológicos tan importantes como el transporte de oxígeno, síntesis
del DNA, fijación del nitrógeno, fotosíntesis y respiración (Venturi, 1994).

En estos procesos el hierro participa como cofactor de
muchas enzimas del
metabolismo y
proteínas reguladoras al poder existir en
dos estados de oxidación, (Fe2+) y
férrico (Fe3+) (Venturi et al 1995). Sin
embargo, este elemento no siempre esta disponible para ser
aprovechado por las bacterias, debido a que en el medio
ambiente, el oxígeno atmosférico produce la
oxidación del Fe2+ a Fe3+,
precipitado este último como hidróxido
férico que no es biológicamente accesible para los
microorganismos debido a su baja constante de solubilidad
(Venturi, 1994). Este fenómeno se acentúa en
suelos neutros y
alcalinos (Alexander y Zuberer, 1991).

Con el objetivo de
tratar de dilucidar las propiedades de los sideróforos se
han realizado varios ensayos, como
estos metabolitos son utilizados por las bacterias que los
producen y la influencia que tienen su producción sobre
las plantas.

Uno de los aspectos que ha sido estudiado es su
actividad enlazadora con el hierro marcado. Esta se
demostró a través de la capacidad mostrada por los
sideróforos en arrastrar hierro marcado radioactivamente a
través de una columna de Sephadex G-25, luego de haber
comprobado que el hierro era incapaz de eluir en ausencia de
sideróforos bajo las mismas condiciones de corrida y
elución (Yang et al; 1991).

Con relación al papel en la asimilación
del hierro por parte de la célula, se han realizado
bioensayos donde se comprueba que el sideróforo es capaz
de acoplarse al hierro para introducirlo en la
bacteria.

8.
ESTRUCTURA

Estructuralmente están formados por un
cromóforo fluorescente enlazado a una cadena
peptídica y difieren fundamentalmente en el tamaño
y composición de la misma (Xiao and Kasaalita,
1995).

El factor estructural común de los
sideróforos es el cromóforo fluorescente que ha
sido identificado como 2,3 diamino-6,7 dihidroxiquinolina y su
grupo o-dihidroxiaromático que se encarga de enlazar el
hierro (Demage et al; 1986).

Pseudomonas (Burkholderia) cepacia produce
diferentes tipos de sideróforos: piochelin (Sokol, 1986),
cepabactin (Meyer et al; 1989), ornibactin (Meyer et
al; 1995), cepaciachelin (Barelmann et al, 1996) y
ácido salicílico y tiene demostrado su papel rector
en el biocontrol de hongos fitopatógenos que provocan
enfermedades en diferentes cultivos de interés
agrícola

9.
PRODUCCIÓN DE SIDERÓFOROS A PARTIR DE B.
cepacia

Los sideróforos para su producción
necesitan de medios con bajo contenido de hierro y un pH entre
7-7,2 (Bahame and Schorth, 1989).

Para la mayoría de las Pseudomonas, la
temperatura óptima para la producción de este
metabolito se encuentra entre 28 y 37 °C. Sin embargo, Bahame
y Schorth, (1989) plantean que para algunas especies de este
género esta producción se inhibe a temperaturas
mayores de 33°C.

Los medios de cultivos empleados para la
producción de cantidades suficientes de sideróforos
deben ser líquidos, pues facilitan la recuperación
del producto una
vez concluida la fermentación, debiendo garantizar que su
composición contenga bajas concentraciones de hierro
(Miranda, 1998). Esté cultivo puede realizarse en
condiciones de agitación o estático. En medio king
B, utilizando ambas condiciones el compuesto apareció
durante la fase estacionaría de crecimiento,
mostrándose como un metabolito secundario no asociado al
crecimiento (Hernández et al, 1999).

La producción de sideróforos a partir de
B. cepacia se obtiene mediante fermentación y para
ello se han utilizados fermentadores de 7 L nivel de banco evaluando
diferentes velocidades de agitación sobre el crecimiento
de B. cepacia 0057, así como la producción
de sideróforos (Figura 1; Tabla 1) con el medio de cultivo
King B (King y Rang, 1954) estos resultados coinciden con otros
medios reportados por Ortiz et.al 2000, quienes encontraron que
medios con sirope fructuosa son capaces de estimular la
producción de metabolitos secundarios como los
sideróforos

Hay que destacar que se obtuvo como resultado un
incremento en la velocidad
específica de crecimiento y en la producción de
sideróforos respecto a los cultivos desarrollados a nivel
de zaranda orbital por Sánchez et.al., 2003, debido
probablemente a los niveles de agitación empleados y la
aireación, favoreciendo así la
multiplicación microbiana. No obstante, el incremento en
los niveles de agitación no afectó ni los valores de
la constante de velocidad ni el rendimiento celular por los
valores
máximos de células
viables obtenidas (que fueron de 6,8 x 1010 , 4,5 x
1011 y 5,6 x 1011 UFC/mL para 100, 150 y
200 rpm respectivamente ya que no se hallaron diferencias
significativas entre dichos valores.

En cuanto a la producción de sideróforos
(Tabla 1) se observa que a las 18 horas de incubación hay
mayor contenido de metabolitos (sideróforos) en todas las
condiciones evaluadas. Sin embargo cuando se compararon entre
sí hay una mayor estimulación de producción
de sideróforos a 150 rpm, existiendo diferencias
significativas (P<0.05) entre esta, y las restantes
velocidades de agitación evaluadas.

Tabla 1. Producción de sideróforos
mediante fermentación con diferentes velocidades de
agitación.

Cuando se realizó un análisis de regresión
múltiple donde la variable dependiente fue contenido de
sideróforos y la variable independiente fue la
agitación, se obtuvo que dicha variable fue significativa
con el siguiente modelo:

Por lo que el modelo fue válido dado el
coeficiente de correlación.

Con estos resultados se pudo determinar
analíticamente que la velocidad de agitación
máxima es de 158 rpm para obtener los mejores niveles de
producción de sideróforos en la región
estudiada, resultados que se corroboraron en la
experimentación al obtener a las 18 horas mayores
rendimientos de sideróforos (D.O.=40±0,05) en tres
corridas realizadas. Con estas condiciones se procedió a
obtener sideróforos y evaluar su efecto biológico
"in vivo" e "in vitro" ante Phytophtora
infestans, demostrando el papel de estos metabolitos en el
control del hongo fitopatógeno (Miranda et al.,
2000).

8.
IMPORTANCIA DE LOS BIOPREPARADOS DE ORIGEN BACTERIANO EN
DIFERENTES CULTIVOS DE INTERÉS
AGRÍCOLA.

En Cuba en los
últimos años se ha favorecido el desarrollo de
numerosos trabajos de búsqueda, selección
y aplicación de bacterias con propiedades beneficiosas a
las plantas, surgiendo así biopreparados a partir de
bacterias de los géneros Azospirillum (Velazco y
Fernández, 1992; Fernández, 1995),
Azotobacter (Dibut 2000) y Pseudomonas
(Hernández, 2000). Estos productos unidos a los obtenidos
a partir de hongos micorrizógenos se han convertido en un
importante renglón de investigaciones y
de aplicación de microorganismos en la
agricultura

Así, se ha demostrado la efectividad de los
metabolitos activos de B. cepacia en la
micropropagación y adaptación de plantas de cafeto,
se logra con el mismo sustituir las hormonas del
medio de cultivo y estimular el crecimiento
vegetal

En papa se ha informado el efecto antagónico, de
biopreparados a partir de cepas de Pseudomonas, contra
Phytophtora infestans. En plantas ornamentales,
también se ha corroborado el efecto benéfico de los
mismos (Cortés, 1999). Meyer et al., 1995
informaron la actividad antagónica de sideróforos
producidos por cepas de B. vietnamiensis y B.
cepacia contra varios hongos fitopatógenos, tales como
Rhizoctonia, Heliminthosporium, Fusrium y
Pitium

Asimismo, Maurhofer et al, 1992 demostró que la
cepa CHAO de P. fluorescens controlaba varias enfermedades
en plantas mediante la producción de pyoluteorin y 2,4
diacetylfloroglucinol, ejemplo Pitium ultimatum en pepino.
Por otro lado, se ha demostrado que cepas de B. cepacia
controlan el ataque de Fusarium al maíz y plantas
hornamentales (Hebbar et al, 1992; 1998)

En los cultivos de gladiolos blancos sanos e infectados
con Fusarium sp se pudo constatar el efecto bioestimulador
y biocontrolador de biopreparados basados en sideróforos
obtenidos bajo estas mismas condiciones. Se realizó un
experimento donde este biopreparado se formuló sobre un
soporte sólido, conteniendo el extracto crudo según
la metodología descrita por Hernández
(1998). La germinación de las semillas inoculadas con este
biopreparado tanto sanas como infectadas lograron salir del
período de dormancia primero que el control sin inocular
(Tabla 2).

Tabla 2. Efecto sobre la
germinación.

En el caso del control con semillas infectadas, solo
logra germinar el 6.66 %, pereciendo al cabo de los diez
días. Resultados similares encontró Álvarez
et al, 2000 quien demuestra que cuando hay ataque de
Fusarium en el cultivo del gladiolo se afecta la
germinación de la semilla y la posterior aparición
de la espiga.

Por otro lado se ha demostrado el efecto bioestimulador
de este bioperarado sobre otros parámetros
fisiológico del cultivo como es el caso de la altura
Hernández 1995, al inocular plantas de maíz con
biopreparados a base de cepa de Pseudomonas. Pazos (2000)
encontró incrementos en los parámetros al tratar
plantas de arroz con cepas nativas de Azospirillum
brasilense. Al parecer existe una relación directa
entre la altura y las variables de
la espiga, numero de flores y corno por planta para cada
tratamiento. En todos los casos se destacan los tratamientos
donde se aplicó el producto, no mostrando diferencias
entre semillas sanas e infectadas representado en la figura
3

Experimentos "in vitro" e "in vivo" han
demostrado que los sideróforos desempeñan un
importante papel en el biocontrol de diferentes hongos
fitopatógenos que atacan a cultivos de interés
económico. Los resultados obtenidos en este experimento
demuestran el efecto biocontrolador del biopreparado estudiado,
que incluye sideróforos, ante Fusarium
sp.

No obstante, se debe continuar los estudios del efecto
de este biopreparado empleando sideróforos y otros
metabolitos bacterianos con vista a esclarecer aún
más su papel en el biocontrol ante agentes
patógenos de aquellos cultivos de gran interés
agrícola, por lo que abre nuevas alternativas en la
producción de estos tipo de biopreparados de origen
bacteriano toda una vez que se establezca la producción de
estos componente de una forma consistente.

10.
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Autor:

Lilian Sánchez*

Annia Hernández**

Sucel Ortiz**

*Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (
CENSA)

* Instituto nacional de ciencias
agrícolas

Grupo Desarrollo.

Dirección de producciones
Biofarmacéuticas

Cuba.