10 – Métodos para la extracción,
aislamiento y caracterización de
saponinas
Por lo general para la extracción de las
saponinas se llevan a cabo metodologías que difieren poco
entre sí. Casi siempre se parte del material vegetal seco,
pulverizado y se desengrasa con benceno o éter de petróleo (este paso no es imprescindible) y
se macera 48 horas con metanol, etanol o mezcla
hidroalcohólica. (4, 28, 33)
Para continuar la extracción se fracciona el
extracto alcohólico con n – butanol y agua, se
utiliza la fracción butanólica, a partir de la cual
se obtiene el crudo de saponinas. Otra vía pudiera ser
concentrar el extracto alcohólico y extraer con acetato de
etilo y butanol, en todos los casos se reporta que las saponinas
quedan en el extracto butanólico. (7)
En esta etapa el tratamiento del extracto con butanol
(que contienen la mayoría de las saponinas) con
éter dietílico provoca la precipitación de
la mezcla de saponinas puras. (33)
Existe otro método
informado en la literatura en el cual se
concentra a sequedad el extracto alcohólico y
posteriormente se fracciona con etanol acuoso 50% v/v y benceno,
quedando en la mezcla hidroalcohólica el crudo de
saponinas. (34)
Después de extraídas las saponinas, estas
se pueden separar por varias técnicas
de separación analíticas y preparativas, una
técnica muy usada es la cromatografía. (35,36)
Las saponinas se separan muy bien en
cromatografía de papel o cromatografía de capa
delgada. (14,36)
10.1-Características
espectroscópicas de las sapogeninas
esteroidales
Espectroscopia IR
Debido a que la cadena pirocetálica solo aparece
en las sapogeninas y sobre todo el anillo F que no lo contiene
ningún otro tipo de producto
natural conocido, se puede determinar la presencia de sapogeninas
esteroidales basado en la espectroscopia IR, basado en cuatro
bandas de la región 850 – 1000 cm-1 que
solo aparecen en el caso de dichos productos
debido a la presencia del anillo F y que además sus
relaciones de intensidades permiten reconocer si se tiene el
isómero neo o iso. Las
cuatro bandas en consideración apaceren en 860, 900, 920 y
985 cm-1, si la banda de 900 es más intensa que
la de 920 se tiene una isosapogenina y si las intensidades de
estas dos bandas se invierten se está en presencia de una
neosapognenina. (34,37,38)
- Espectroscopia RMN
RMN – 1H
En los espectros RMN – 1H son
característicos los corrimientos que ocurren en protones
de grupos metilos en
C18 ,C19, C21 y C27
El metilo del C18 aparece con un singuleto con
corrimiento químico sensible a sustituyentes en los
anillos C y D. De la misma forma aparace el metilo del
C19 siendo este sensible a sustituyentes en los
anillos A, B y C. El metilo del C21 se aprecia como un
dupleto que se acopla con el H20 (J3=6,5
+0,33 Hz) y su corrimiento químico es sensible a
sustituyentes en el anillo C. De igual forma el metilo del
C27 se presenta como un dupleto que se acopla con el
H25 (J3= 6,3 + 0.3 Hz) no siendo sensible a
sustituyentes remotos por lo que aparece en delta =0.79 ppm en
todos los compuestos de este tipo.
También es típico de este tipo de
compuesto la señal correspondiente a los dos
hidrógenos unidos al C26 Esta es una
señal compleja correspondiente a dos corrimientos
químicos (H 26 a y
H26 b ) y
prácticamente no varía en los compuestos de este
tipo.
En algunos espectros se superponen a esta señal
otra correspondiente a hidrógenos enlazados a carbonos que
se encuentran en posición a
respecto a átomos de oxígeno, pudiéndose en casos
favorables ser diferenciadas. El H 26 a (axial) aparece como un tripleto
alrededor de 3.32 ppm, su multiplicidad se debe a un doble
acoplamiento terminal y vecinal axial – axial
(J2 = J3 = 10.6 Hz), el H26
b (ecuatorial) aparece como un doblete
en los 3.5 ppm, su multiplicidad se debe al acoplamiento teminal
(J2 = 10.6 Hz) y vecinal ecuatorial – axial
(Jea3 =2.6 Hz). El H16 a en estos compuestos aparece en 4.4 ppm como un
cuarteto debido al acoplamiento con protones 15 b ecuatorial, 15 a y
17 b (cuasiecuaotrial).
(39,40)
- Espectrometría de
masa.
Esta técnica también se aborda ampliamente
en la literatura, se han estudiado los mecanismos posibles, en la
mayoría de los cuales se plantea una fragmentación
primaria en el sistema
espirocetálico característico de estos compuestos ,
de lo cual se derivan muchas posibilidades, siendo común
en la mayoría de las sapogeninas una señal en m/z
115 y otra en 139 .
11- Estudio fitoquímico de
saponinas.
En la realización del mismo se desarrollaron dos
metodologías para la extracción y
caracterización de saponinas.
Metodología Nro 1
Obtención del crudo de
saponinas
Se maceraron 100 gramos de la droga seca y
molinada de la planta en 400 ml de etanol al 70 % durante 48
horas, se filtró y se repitió la extracción
con la misma cantidad de dicho solvente durante 24 horas. Se
reunieron los extractos y se concentraron a sequedad en
baño de agua.
El residuo obtenido se disolvió en 10 ml de agua
destilada, se colocó en un embudo separador y se extrajo
hasta el máximo agotamiento con n – butanol se
concentraron los extractos a sequedad en un rotoevaporador (HB4
Basic Kika Lbortechnik) hasta la obtención de un residuo
sólido.
Hidrólisis de las
saponinas.
Se pesó el residuo del extracto n –
butanólico y se disolvió en 20 ml de etanol, se
añadió igual volumen de
ácido clorhídrico 2 N y se reflujó durante 3
horas; se dejó refrescar para luego evaporar hasta la
tercera parte de su volumen inicial y se vertió sobre
igual volumen de agua fría. La solución acuosa
obtenida se extrajo con acetato de etilo y se concentró a
sequedad en un rotoevaporador (HB4 Basic Kika
Lbortechnik)
El diagrama de flujo
seguido para la obtención de los crudos de saponinas y su
posterior hidrólisis se muestran en Anexos (Fig
1).
- Metodología Nro 2
Obtención del crudo de
saponinas.
Se maceraron 100 g de la droga seca y molida en 300 ml
de cloroformo durante 48 horas, se filtró, el extracto
clorofórmico se concentró a sequedad en baño
de agua. El material vegetal se secó en estufa(MLW WSU
100, RDA) a 35 ° C y se extrajo en
Soxhlet con 500 ml de etanol hasta total agotamiento de la droga,
se filtró el extracto obtenido y se concentró a
sequedad en baño de agua. El residuo obtenido se
disolvió en 300 ml de agua saturada con 100ml de n –
butanol y se reflujaron con 300 ml de n – butanol durante 2
horas y 30 minutos. La mezcla obtenida se llevó a un
embudo separador y se separaron las dos fases, el extracto
butanólico se dejó reposar 24 horas para filtrar a
vacío sobre sulfato de sodio anhidro
(Na2SO4). Posteriormente se
concentró a sequedad el extracto butanólico y se
pesó. La hidrólisis se realizó exactamente
como la metodología anteriormente
descrita.
El diagrama de
flujo seguido por esta metodología se muestra en Anexos
( Fig. 2).
Los crudos obtenidos para ambas metodologías se
reunieron en una sola fracción para proceder a la
separación de los productos de interés.
- Identificación de las
saponinas
Para la adecuada identificaciòn se tomaron
muestras provenientes de las fracciones de interés
obtenidas mediante la obtención del crudo de saponinas y
su posterior hidrólisis, a las cuales se le realizaron los
ensayos
correspondientes para identificación cualitativa de los
siguientes metabolitos de interés:
- Ácidos grasos
- Tripterpenoides y esteroides
- Saponinas
- Azucares
- Sapogenina
Tabla Nro 1: Resultados de los ensayos
realizados para la identificación de saponinas.
Ensayo/Ext | Liebermann – Burchard | Rosemheim | Salkowsk | Espuma | Molish | Atrona | Vainillina | Woller | Sudan |
Crudo de saponinas | +++ | + | + | +++ | + | ++ | + | + | +++ |
Hidrolizado | +++ | + | + | – | – | + | ++ | + | ++ |
+++ Muy positivo o evidente. ++ Positivo.
+ Ligeramente positivo. – Negativo.
12- Estudios cromatogràficos
realizados
- Cromatografía en capa
delgada.
Cada una de las fracciones obtenidas por ambas
metodologías para la extracción de saponinas, se
analizaron por el método de cromatografía en capa
delgada (CCD) sobre sílica gel – 60, con el fin de
separar las sustancias contenidas en el crudo de saponinas e
identificar las sapogeninas presentes en los extractos post
hidrólisis.
Se empleó como fase móvil la mezcla
n-heptano: acetato de etilo (1:1) y como revelador una
solución de vainilla en ácido fosfórico al 1
% y se calentó en una estufa a 1050C durante 5
min.
Se utilizó un patrón de diosgenina para
corroborar su presencia en nuestra muestra, como fue observado
preliminarmente en estudios anteriores (37)
- Cromatografía Clásica en
Columna.
Se separaron los productos de hidrólisis
obtenidos por ambas metodologías mediante la
cromatografía en columna.
Se preparó la columna por vía seca y para
ello se añadió 20 g de sílica a la columna
humedeciéndola con n-heptano , cuidando la homogeneidad
del relleno. Una vez preparada la columna se añadió
una mezcla del producto de hidrólisis, disuelto en
n-heptano mezclado con sílica y se comenzó la
elución con los siguientes solventes: n-heptano,
n-heptano: acetato de etilo (1:1) ,n- heptano: acetato de etilo
(4:6), acetato de etilo, cloroformo: metanol (1:1), cloroformo:
metanol: agua (6:4:1) y cloroformo: etanol: agua (6:4:1),agua y
tolueno.
Cada una de las fracciones obtenidas, se siguió
por cromatografía en capa delgada sobre sílicagel
– 60 empleando como fase móvil n -heptano: acetato
de etilo (1:1) y como mezcla reveladora la anteriormente citada.
Se comparó con el patrón de diosgenina, analizando
los Factores de Retardo (Rf) de cada mancha y escogiendo aquellas
fracciones que se correspondían con los resultados
obtenidos para dicho patrón.
- Cromatografía de placa
preparativa.
Se analizaron las fracciones de interés
según los resultados obtenidos en la cromatografía
en columna.
Se preparó la placa preparativa utilizando
sílica gel sobre soporte de vidrio de 20cm X
20cm.
Las manchas se arrastraron disolviéndolas con una
mezcla de n-heptano: acetato de etilo (1:1), filtrando
posteriormente con papel de filtro para desechar los restos de
sílica gel.
El filtrado se dejó reposar por varios
días, observándose la precipitación de
diminutos cristales.
12.1 Resultados obtenidos en estudios
cromatográficos.
- Cromatografía en capa
delgada.
Se analizaron las diferentes fracciones obtenidas en
cada una de las metodologías desarrolladas. Los
cromatogramas obtenidos se muestran a continuación(Fig.
1)
A – Metodología Nro 1
B – Metodología Nro 2
m1-Residuo del extracto n-butanólico
(crudo de saponinas)
m2-Residuo del extracto
hidrolizado(sapogeninas)
Fig. 1-Cromatogramas obtenidos para el crudo de
saponinas y el hidrolizado en ambas
metodologías.
Como se puede apreciar no hubo una buena
separación de los productos obtenidos en el crudo de
saponinas, para ambas metodologías.
En el caso de las fracciones post -hidrólisis,
podemos apreciar con mayor nitidez la aparición de manchas
bastante definidas, de coloración verde.
- Cromatografía en
Columna.
Mediante esta técnica cromatográfica se
reunieron los hidrolizados obtenidos por ambas
metodologías con un peso final de 15.79g, para separar
adecuadamente los productos. Cada una de las fracciones eluidas
se analizaron por cromatografía en capa delgada,
especialmente las fracciones de acetato de etilo: n-heptano (1:1)
que fueron escogidas para continuar la separación debido a
la aparición de los productos de interés.(Fig.
2)
F1– Fracción eluida Nro 1
F2– Fracción eluida Nro 2
F3– Fracción eluida Nro 3
Fig. 2– Cromatogramas obtenidos para las
fracciones de interés, eluidas en la Cromatografía
en Columna.
Al analizar el recorrido de las manchas se puede
apreciar que hubo una buena separación de los productos,
obteniéndose tres manchas bien definidas y nítidas
en cada caso, de coloración que varía del verde al
amarillo verdoso.
Además se compararon de forma preliminar los Rf
para cada una de las manchas con un patrón de diosgenina
de valor de Rf =
0.51 , observándose similitud entre este y el valor de Rf
calculado para la mancha intermedia de las tres fracciones
escogidas(Fig. 3). Estas fracciones fueron reunidas en una
fracción total de 0.79g con el 5% de la muestra inicial
introducida en la columna.
Ft
–Fracción total P –Patrón
de diosgenina
Fig. 3 –Cromatogramas del patrón de
diosgenina comparado con el de una fracción total
eluída en la mezcla acetato de etilo: n –heptano (1:
1)
Las restantes manchas no pudieron ser analizadas por no
contar con disponibilidad de otros patrones
- Cromatografía de placa
preparativa
Con el objetivo de
arrastrar la mancha de interés eluida por la columna, para
su posterior análisis espectroscópico,
desarrollamos la técnica de cromatografía
preparativa.
Los resultados de la misma se muestran en la Fig. 4.
Como se puede apreciar obtuvimos franja de color amarillo
-verdoso luego de ser adecuadamente marcada, se arrastró y
tres franjas de colores : verde
oscuro, amarillo – verdoso y verde claro respectivamente.
La disolvió en la mezcla de acetato de etilo: n-heptano
(1:1).
Fig. 4–Cromatograma de la fracción
de interés eluida por la columna obtenida mediante una
técnica preparativa
Luego de ser decantado y filtrado con papel de filtro,
para eliminar los restos de silica, se dejó reposar
durante tres días, al cabo de los cuales observamos la
aparición de un precipitado blanco amarillento, con un
peso de 0.21g .Esto se corresponde con el 1.33% del hidrolizado
total introducido en la columna .
Este producto se comparó con el patrón de
diosgenina mediante cromatografía de placa delgada , bajo
las mismas condiciones cromatográficas empleadas
anteriormente .Como muestra la Fig 8 , el producto aislado
presenta un Rf muy similar al patrón .
Este producto aislado de la fracción post-
hidrólisis en acetato de etilo : n– heptano (1:1) se
corresponde con el 0.1% de la muestra inicial de 200g de planta
seca y molinada que se empleó en el estudio .
m– Producto aislado p–
Patrón de diosgenina
Fig. 5– Cromatogramas del producto aislado
y el patrón de diosgenina.
Se realizó la detección del punto de
fusión
a la muestra en una microplatina digital (elctrothermal 9200) y
el rango de valor detectado fue entre 206 y
209ºC.
- Estudios espectroscópicos
Una muestra de los cristales separados se analizó
mediante Espectroscopía UV disolviéndolos en
acetonitrilo y empleando un equipo(Spectronic
Genesys’’2) Además se tomó otra muestra
proveniente del mismo precipitado y se analizó mediante
Espectroscopía IR, empleando un equipo (FTIR Vector 22 de
la firma Broker), en pastilla de bromuro de potasio
(KBr).
13.1-Resultados obtenidos en estudios
espectrocópicos
- Espectroscopia UV
El espectro obtenido se muestra en Anexos (Fig.
9)
Atendiendo al espectro UV se puede sugerir la presencia
de transiciones ns * que corresponde con los grupos hidroxilos
alcohólicos, lo cual se puede corroborar con los
resultados del espectro IR .Adicionalmente se realizó
el ensayo de
identificación con sodio , este resultó positivo,
indicando la posible existencia en el compuesto de los grupos
mencionados.
- Espectroscopia IR
El espectro obtenido se muestra en Anexos (Fig.
10)
Al realizar el análisis del mismo pudimos
observar lo siguiente:
- 3449.82 cm-1, banda puntiaguda y ancha
indicativa de OH asociado y de una posible
superposición, lo que sugiere que el OH pueda ser
primario, secundario o terciario presentes en flavonoides,
alcaloides y triterpenos. Estas bandas aparecen entre
3800cm-1 y 3500cm-1, según la
literatura. - 2951.09 cm-1, banda alargada y estrecha
indicativa de la presencia de enlaces C SP3
–H. Estas bandas aparecen entre 3000cm-1 y
2800cm-1, según la literatura. - 1637.35 cm-1 , banda pequeña de
hombro ancho indicativa de la presencia de enlaces C- N. Lo
cual sugiere que el compuesto se encuentra en forma de sal .
Estas bandas aparecen en 1640cm-1, según la
literatura. - 1456.69cm-1, banda pequeña y
estrecha indicativa de la presencia de enlaces C=C. Estas
bandas aparecen en 1460cm-1, según la
literatura. - 1376.67 cm-1 , banda estrecha y puntiaguda
indicativa de la presencia de enlaces C sp2 –
H. Estas bandas aparecen en 1380cm-1, según
la literatura. - 1052.51 cm-1 , banda alargada y estrecha
indicativa de la presencia de enlaces C – O simple .
Estas bandas aparecen en 1050cm-1, según la
literatura. - 1241.52 cm-1 – 642.29 cm-1,
bandas características de la presencia del anillo
bencénico. Estas bandas aparecen entre 1000
cm-1 y 600 cm-1, según la
literatura. - 981.78cm-1, 920.14cm-1,
899.43cm-1, 865.17cm-1, cuatro bandas
características de sapogeninas esteroidales debido a la
presencia del anillo F. Estas bandas aparecen a
985cm-1,920cm-1, 900cm-1 y
860cm-1 respectivamente, según la literatura.
Además como la banda de 900cm-1 es más
intensa que la de 920cm-1 estamos en presencia de
una isosapogenina .
Luego de analizar nuestro producto aislado tanto por
métodos
cromatográficos como espectroscópicos , le
asignamos la estructura
química
de la diosgenina (Fig. 5) ,
sapogenina esteroidal de interés
farmacéutico notable , según se describe en la
literatura (39).
Fig. 5 Estructura química
de la diosgenina en la conformación iso .
Usos
En medicina
popular se emplea en el tratamiento del estreñimiento,
cistitis, uretritis, urolitiasis, edemas, resfriados, bronquitis,
gastroenteritis, diabetes,
parasitosis intestinales.
En uso tópico: gingivitis, estomatitis, forúnculos,
abscesos, reumatismo, heridas, grietas en los
labios,conjuntivitis.
Contraindicaciones
Litiasis
oxálicas.(6,11)
Formas galenicas. Posologia.
- Uso alimentario (planta fresca) En
ensalada
- Infusión: Una cucharada de postre por taza, 2-
3 veces al dia después de las
comidas.(6,11,39)
Presentación
Planta suelta.
Toxicidad
No se reporta toxicidad (6,11)
Efectos biológicos
atribuidos
Todas las saponinas son capaces de reducir la
tensión superficial y alterar la permeabilidad de las
membranas celulares.Su actividad antibacteriana se debe a la
formación de complejos con el colesterol presente en la
membrana celular. (39,40)
En el caso de las triterpenoidales, tanto las saponinas
crudas como las purificadas tienen acción
estimulante sobre el sistema nervioso
central, antipirética, sedante, expectorante,
antitusiva, previenen las úlceras provocadas por el
estrés,
aceleran la movilidad intestinal y muestran actividad
antiinflamatoria. Promueven la síntesis
de ARN y de proteínas.
(26,31)
También pueden ser usadas en la prevención
y terapia de la toxicidad clínica ya que pueden modular la
morfina y cocaina, inductores de la disfunción
dopaminérgica. (17)
En 1996 fue estudiado el papel de las saponinas en la
prevención del daño
producido por el Peróxido de Hidrógeno en fibroblastos del ratón,
así como los efectos inhibitorios de algunas saponinas
esteroidales sobre los espermatozoides humanos in vitro. (32,
33).
Se ha observado que la presencia de las saponinas
acelera el crecimiento de los embriones vegetales, lo que
paralelamente a su amplia distribución en el reino vegetal hace
pensar en un posible papel hormonal. (4)
Son poco absorbidas en los animales
superiores, por lo que actúan principalmente como
irritantes de las mucosas. Inyectadas directamente producen
hemólisis, diuresis y acciones
directas sobre todo el sistema nervioso
central que pueden ser letales. También provocan
degeneración de las células
hepáticas con la consecuente fribrosis cuando se
administran dosis altas. (4)
En 1997 se observó el papel que
desempeñaron las saponinas presentes en las fibras
dietéticas no digeribles en el secuestro de
ácidos
grasos biliares y esteroles necesarios, uno de cuyos efectos
principales es la disminución de la concentración
de colesterol sérico (34) y la mayor limitante en el
empleo de
estos compuestos es la toxicidad asociada con su potencial
hemolítico, para ello es importante conocer la posibilidad
y magnitud del cambio en la
actividad hemolítica de los crudos de
saponinas.
Varios estudios recientes tanto in vitro como in vivo,
han reportado las propiedades anticancerígenas de las
saponinas, también se ha propuesto que tengan
efectos
hipocolesterolémicos e inmunoestimulantes. El
mecanismo propuesto en la actividad anticancerígena es el
efecto antioxidante directo y citotoxicidad selectiva de
células, inmunomodulación, metabolismo
ácido y neutro del esterol y regulación de la
proliferación celular. Entre las propiedades
químicas de las saponinas su polaridad, hidrofobicidad y
naturaleza de
los grupos reactivos constituyen determinantes importantes de sus
propiedades biológicas. (35)
Por lo antes expuesto, se han hecho numerosos estudios
para la detección, aislamiento, obtención y
análisis de este tipo de metabolitos. (2, 31, 34, 36, 37,
38, 39,40)
Conservaciòn
La planta seca y molinada se conserva en bolsas
plàsticas a temperatura
ambiente por
el perìodo de un año(6)
- Se encontraron datos de gran
interés sobre la Portula oleracea L que pueden
utilizarse en estudios posteriores. - Se realizó la monografía de la Portula oleracea
L, la cual no aparece en ninguna farmacopea
internacional, estos resultados resultan novedosos para
la especie vegetal estudiada.
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Fig. 1-Metodología Nro1
Fig. 2-Metodología
Nro2
Ensayo de Sudán III (ácidos
grasos):
Permite reconocer en un extracto la presencia de
compuestos grasos, para lo cual a la alícuota de la
fracción en el solvente de extracción se le
añade 1ml de una solución diluída en agua
del colorante Sudán III o Sudán IV. Se calineta en
baño de agua hasta evaporación del
solvente.
La presencia de compuestos grasos se considera positiva
si aparecen gotas o una película coloreda de rojo en el
seno del liquído o en las paredes del tubo de ensayo,
respectivamente.
Ensayo de Liebermann- Burchard (triterpenos y/o
esteroides):
Permite reconocer en un extracto la presencia de
triterpenos y/o esteroides, por ambos tipos de productos poseer
un núcleo de androstano, generalmente insaturado en el
anillo B y la posición 5-6. Para ello si la
alícuota del extracto no se encuentra en cloroformo, debe
evaporarse el solvente en baño de agua y el residuo
redisolverse en 1ml de cloroformo. Se adiciona 1ml de anhidrido
acético y se mezcla bien. Por la pared del tubo se dejan
correr 2-3 gotas de ácido sulfúrico concentrado sin
agitar. Un ensayo
positivo se tiene por un cambio de coloración:
- Rosado- azul muy rápido.
- Verde intenso, visible aunque
rápido. - Verde oscuro- negro, final de la
reacción.
A veces ensayo queda en dos fases o desarrollo de
color. Muy pocas veces puede observarse el primer cambio. El
tercer cambio generalmente ocurre cuando el material evaluado
tiene cantidades importantes de estos compuestos. Esta
reacción también se emplea para diferenciar las
estructuras
esteroidales de las triterpénicas, las primeras producen
coloraciones azul a azul verdoso, mientras que para las segundas
se observa rojo, rosado o púrpura. Estas coloraciones
pueden variar por interferencias producidas por carotenos,
xantofilas y esteroides saturados que puedan estar
presentes.
Observación: Para realizar este ensayo no
puede haber agua en el medio de reacción, pues esta con el
ácido sulfúrico puede reaccionar de forma
violenta.
Ensayo de Espuma (saponinas):
Permite reconocer la presencia de saponinas, tanto del
tipo esteroidal como triterpénicas. De modo que si la
alícuota se encuentra en etanol, se diluye en 5 veces su
volumen en agua y se agita la mezcla fuertemente durante 5-10min.
El ensayo se considera positivo si aparece espuma en la
superficie del líquido de más de 2mm de espesor o
altura y persiste por más de 2 min.
Ensayo de Rosemheim ( triterpenos y
esteroides):
1ml de la fracción en cloroformo se mezcla con
1ml de ácido tricloacético al 90% en un tubo de
ensayos. Si hay dienos aparece una coloración azul o
violeta en el tiempo.
Ensayo de Salkowski ( triterpenos y
esteroides):
1ml de la fracción en cloroformo se coloca en un
tubo de ensayos con 1ml de ácido sulfúrico
concentrado. Un ensayo positivo se muestra con una
coloración amarillo rojiza.
Molish(azucares):
A 1 ml del extracto se le adiciona 0.5ml de una
solución de a – naftol al 5% en
etanol . Se mezcla y por la pared del tubo de ensayo se deja caer
2 o3 gotas de ácido sulfúrico concentrado . La
aparición de un anillo violáceo en la interfase
indica una reacción positiva.
Antrona (saponinas):
1 ml del extracto en agua se mezcla con 0.5 ml de
antrona al 0.01% en ácido sulfúrico concentrado
recién preparada .La aparición de un anillo azul en
la interfase indica una reacción positiva.
Vainillina(sapogeninas ):
A 1 ml del extracto se le adiona 0.5 ml de una
solución de vainillina al 1% en etanol y se acidifica con
ácido clorhídrico o sulfúrico concentrad. La
aparición de colores variables
indica una reacción positiva.
Ensayo de Woller (saponinas
triterpénicas):
1ml del extracto se trata con unas gotas de cloruro de
tionilo que contiene 0.1% de cloruro estáñico ,
férrico o antimónico anhidros . Se tapa el tubo de
ensayo y si en una hora hay cambio de coloración, indica
un ensayo positivo.
Fig. 3– Tamizaje fotoquímico realizado a
ambos extractos
Autor:
Lic. Tania L. Santos Morell.
Año 2004
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