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Vitaminas Hidrosolubles (página 2)



Partes: 1, 2

Muchos de los métodos
mencionados han sido adoptados, al menos en parte, en
países con tecnología
alimenticia altamente desarrollada. Sin embargo, no hay un
enfoque uniforme y pocos países tienen una política de
fortificación definida. (3)

Desde hace aproximadamente 50 años se han venido
desarrollando programas de
fortificación de alimentos en
países en vías de desarrollo y
se han logrado considerables progresos en la reducción de
las deficiencias de los nutrientes.

Entre los criterios que han sido aplicados para proponer
la fortificación de alimentos con objetivos de
salud
pública, se señalan los siguientes:

  1. Necesidad demostrada de nutrientes en uno o mas
    grupos de la
    población.
  2. Existencia de un alimento como vehículo para
    que los nutrientes lleguen hasta la población en
    riesgo.
  3. Garantía de la ingestiones adecuadas del
    nutriente añadido al alimento, cuando se consume en
    cantidades normales por parte de la población en
    riesgo.
  4. Equilibrio en la cantidad del nutriente
    añadido para evitar efectos nocivos al individuo
    que ingiera gran cantidad del alimento fortificado.
  5. Utilidad biológica del nutriente bajo la forma
    añadida y estable en el alimento seleccionado como
    vehículo. (3,13)

Desde los años 70 se comenzaron a fortificar los
alimentos en países de América
Central, tales como Guatemala,
Costa Rica,
Honduras y El Salvador. Varios países han experimentado la
fortificación de harinas de maíz y de
trigo con hierro,
tiamina, riboflavina y niacina y mas recientemente con
ácido fólico y vitamina A. En el año 1998 se
inició la fortificación con vitaminas en
alimentos, particularmente en harinas, en el Sur de
África, específicamente en Zambia y en la
actualidad otros países africanos y asiáticos
fortifican sus alimentos con vitaminas. (6)

La fortificación de cereales con hierro y
vitaminas también se ha puesto en práctica en estos
países para contrarrestar las deficiencias de estos
nutrientes en las poblaciones más necesitadas. (6,
11)

  • Aspectos Instrumentales de la Electroforesis
    Capilar:

Los equipos desarrollados por la industria
instrumental recién aparecieron en 1988 y no fue hasta el
año siguiente, donde se mostraron los extraordinarios
avances de este novedoso método
analítico. Los equipos de electroforesis capilar
están conformados por dos compartimientos
electroforéticos unidos por un capilar, conectados a su
vez a una fuente de alta tensión de 20 a 30 Kv. Parte del
capilar es sometido a la luz UV con un
detector unido a un registrador, que grafica la absorbancia en
función
del tiempo de
corrida y a un sistema de
administración de datos (Figura
1).

Figura 1. Esquema de un equipo de
electroforesis capilar.

Tomado de:

En la EC la solución amortiguadora usualmente se
desplaza a través del capilar bajo la influencia de un
campo
eléctrico. Este fenómeno es llamado flujo
electroosmótico o electroendosmótico (FEO). Las
moléculas cargadas son separadas debido a las diferencias
en sus movilidades electroforéticas y tienden a migrar
hacia el electrodo que posea la carga opuesta a ellas. Cuando el
tampón o solución amortiguadora es introducida
dentro del capilar, la superficie interna del capilar adquiere
carga, esto ocurre por la ionización de la superficie del
capilar o por la adsorción de iones del tampón; la
superficie de los capilares de sílica, posee grupos
silanoles (Si – OH) que son ionizados a grupos cargados
negativamente, grupos silanoatos (Si – O-) , a
pH mayores a
3.

Las cargas positivas de los iones del tampón son
atraídas por los grupos silanoatos formando una fina capa
en la pared del capilar, como se muestra en la
figura 2. Estos cationes no son suficientes para neutralizar
todas las cargas negativas de la pared del capilar, por lo que se
forma una segunda capa externa de cationes. La capa interna
está más atraída a los grupos Si –
O- y se denomina "capa
fija"
. La otra capa de cationes no está
tan fuertemente atraída por estos grupos, ya que se
encuentra más alejada de ellos y se le denomina
"capa móvil" .
Estas dos capas conforman lo que se conoce como la
"doble capa" de cationes.
Cuando se aplica el campo eléctrico, la capa móvil
se desplaza hacia el electrodo cargado negativamente. Una vez que
estos cationes son solvatados arrastran a la mayor parte de la
solución amortiguadora, causando el FEO. (1, 7, 9,
14)

Figura 2. Flujo
Electroosmótico.

Una de las etapas básicas en la separación
en EC es la elección de la solución amortiguadora,
ya que la sensibilidad del FEO al pH requiere buffers que
mantengan el pH constante. En esta técnica se pueden usar
una amplia variedad de buffers desde pH 2.5 hasta 10, los
más usados son el buffer fosfato pH 2.5 y 7 y el borato pH
9, en diferentes concentraciones, el impacto del pH en el analito
pude producir complejos que facilitan su detección;
también se pueden agregar, al buffer, ciertos aditivos que
permiten acelerar la velocidad de
la corrida o bien modificar la estructura
interna del capilar para detectar compuestos
aniónicos.

La electroforesis capilar es una excelente
técnica cualitativa, tomando en cuenta los espectros de
las especies de interés; o
bien cuantitativa tomando en cuenta alturas y áreas de
pico, ya que estas son proporcionales a la concentración.
El análisis cuantitativo de las muestras se
hace inyectando un estándar de concentración
conocida de cada compuesto de interés y se miden las
alturas o áreas de cada pico resultante. Una vez realizado
este procedimiento, se
inyecta la muestra de concentración desconocida y se miden
las alturas o áreas de los picos; entonces la
concentración de la muestra se obtiene comparando las
alturas o áreas de ésta con las del
estándar. En los cálculos de integración para electroforesis capilar se
utilizan integradores electrónicos o computadores tal como
se usa en HPLC o cromatografía de gases.

En el caso de un análisis cualitativo se hace,
igual al caso anterior, inyectando un estándar y se
registra el espectro de cada pico resultante en la longitud de
onda específica del compuesto y se compara con el del
patrón. (9, 14, 16)

Materiales y Método.-

Para los análisis se utilizó un equipo de
EC marca Hewlett
Packard con Detector de Arreglo de Diodos. La
metodología de análisis
consistió en pesar aproximadamente 1g de muestra de
premezcla vitamínica con la que se enriquece una de las
marcas de
harina de maíz mas reconocidas del país. Esta
muestra fue tomada directamente de la línea de producción de la empresa
productora de harina. La extracción de las vitaminas de la
muestra se realizó con una solución de HCl 0,1N
agitando manualmente, cada muestra se inyectó directamente
por presión
(1000mbar*s) en el capilar de sílica fundida
(75m m de diámetro interno y de
) en el equipo, se aplicó un voltaje de 25 kV y la corrida
se mantuvo a 30°C de temperatura. (15,
17)

Durante el desarrollo del método, se utilizaron
diferentes buffers, con la finalidad de estudiar el comportamiento
de las vitaminas ante cada uno de ellos y la influencia de
dirección del FEO en la corrida. Se
empleó, buffer borato 20mM pH 9.0 y acetato 10mM, para FEO
normal y acetato 10mM con CTAB (bromuro de cetiltrimetilamonio)
0,5mM (pH 5.5) para FEO reverso.

La identificación de las vitaminas para cada caso
se realizó como a continuación se
describe:

Análisis con buffer borato 20mM pH 9.0, FEO
normal:
con este buffer la identificación de las
vitaminas se realizó a 266nm de longitud de
onda.

Buffer acetato 10mM pH 5.0, FEO normal: con
este buffer la identificación de las vitaminas se
realizó a 266nm para las vitaminas B1 y B3 y en 444nm
para la vitamina B2.

Buffer acetato 10mM con CTAB (bromuro de
cetiltrimetilamonio) 0,5mM (pH 5.5), FEO reverso:
igual al
caso anterior.

En todos los casos la identificación de cada una
de las vitaminas se hizo comparando los espectros UV de los picos
obtenidos en el análisis con los de los patrones (Figuras
4,5 y 6).

Resultados y
Discusión.-

La respuesta del detector: electroforegrama (Figura 3),
muestra que se logra una separación rápida y
satisfactoria de todas las vitaminas analizadas, utilizando
buffer borato 20mM, pH 9.0, a una longitud de onda de 266nm. El
primer pico que se observa corresponde a la vitamina B1 que posee
carga positiva, luego se detecta la vitamina B3 que es neutra y
por ultimo la vitamina B2, que a pesar de ser neutra en su
estructura original, puede formar un complejo de borato cargado
negativamente por el uso de buffer borato en la corrida, lo que
permite separarla de la vitamina B3.

Figura 3. Electroforegrama de
vitaminas hidrosolubles, buffer borato 20mM pH 9.0,
detección 266mn.

Figura 4: Espectro tipo de Vitamina
B1

Figura 5: Espectro tipo de Vitamina
B2

Figura 6: Espectro tipo de Vitamina
B3

Para el caso de buffer acetato, los resultados
experimentales (figuras 7 y 8) muestran que tanto para FEO normal
como para reverso, no se logra la separación de las
vitaminas B2 y B3, por esta razón se detectaron en dos
longitudes de onda, 266nm y 444 nm, esto gracias a que el
detector de arreglo de diodos permite hacer un barrido desde
190nm hasta 650nm. Al comparar los espectro de cada vitamina
obtenido en la muestra con la de los patrones, se verifica que
cada pico corresponde a las vitaminas de interés. En el
caso de FEO reverso se puede verificar que las vitaminas son
detectadas de manera contraria, es decir, la vitamina B1 que
posee carga positiva es detectada de ultimo en la corrida y luego
las neutras, de igual manera no se logran separar las vitaminas
B2 y B3.

Figura 7. Electroforegrama en 266 nm,
buffer acetato 10mM (pH 5.0). FEO normal.

Figura 9. Electroforegrama en 266 nm,
buffer acetato 10mM con CTAB (bromuro de cetiltrimetilamonio)
0,5mM (pH 5.5). FEO reverso.

Figura 8. Electroforegrama en 444 nm,
buffer acetato 10mM (pH 5.0). FEO normal. Detección de
B2

Conclusiones.-

Empleando la electroforesis capilar se pueden
identificar, mediante los espectros, las vitaminas B1, B2 y B3
con alta resolución de picos; en las longitudes de onda en
las que estos compuestos absorben. La detección de las
vitaminas se logra de acuerdo a la migración
de cada una a lo largo del capilar ya que el FEO las arrastra con
él. La vitamina B1 posee una carga positiva, por lo que
debería ser detectada de primero en la corrida; por otra
parte, las vitaminas B2 y B3 poseen carga neutra, por lo que se
detectarían después de la vitamina B1.

Cuando se habla de FEO normal este es el comportamiento
que se espera, sin embargo, cuando se tiene un modificador de los
grupos silanoles, como es el caso del buffer acetato + CTAB, se
observa un comportamiento reverso. Esto ocurre porque al agregar
al buffer una sal de amonio los grupos silanoles se modifican y
adquieren carga positiva, haciendo que los aniones del buffer
sean atraídos por estas cargas, estos aniones del buffer
son atraídos entonces por el cátodo reversando
así el FEO y detectando las especies cargadas
positivamente de último en la corrida.

Por medio de la EC con FEO normal se pueden separar
satisfactoriamente las vitaminas B2 y B3, compuestos neutros,
sólo con utilizar un buffer que permite la
formación de un complejo de borato con la vitamina B2
cargado negativamente. Con buffer acetato, en FEO normal y
reverso, no se logra esta separación, sin embargo, las
vitaminas pueden ser detectadas en dos longitudes de onda
diferente. En el caso de las vitaminas B1 y B3 pueden ser
detectadas en 266nm y la vitamina B2 en 444nm. La desventaja de
este método es que en 266nm los picos de las vitaminas B2
y B3 están solapados, por lo que si se desea cuantificar
se debe hacer una corrección en las alturas de los
picos.

En líneas generales la EC es una técnica
versátil que permite obtener picos con alta eficiencia
resolutiva en utilizando diferentes modos de separación,
de acuerdo a las necesidades del analista, sin necesidad de un
sistema de presión como en HPLC, además de una
reducción en los costos de
análisis debido a las pequeñas cantidades de
tiempo, soluciones y
muestra utilizados. (4)

Es muy importante destacar que esta metodología
se puede adaptar a el análisis de vitaminas en otras
matrices, bien
para su determinación en las harinas (producto
final) que se enriquecen con la premezcla vitamínica, como
para otros alimentos o también en
fármacos.

Referencias
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Autor:

Lic. Anhely Millán Osuna

Valencia, Estado
Carabobo, Venezuela. Diciembre 2003

Partes: 1, 2
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