1. INTRODUCCION |
2. OBJETIVOS |
2.1 Objetivos General |
2.2 Objetivos Especificos |
3. MARCO TEORICO |
3.1 Desarrollo del Diente |
3.1.1 Lamina Dental |
3.1.2 Etapa del Brote del Desarrollo del |
3.1.3 Etapa del Casquillo del Desarrollo del |
3.1.4 Fase de la Campanilla de Desarrollo del |
3.1.5 Color |
3.1.5.1 Desarrollo del Esmalte |
3.1.5.2 Mineralización de la Matriz |
3.1.5.3 Histofisiología |
3.1.5.4 Ultraestructura de la |
3.1.5.4.1 Estadio Morfogenético |
3.1.5.4.2 Estadio de |
3.1.5.4.3 Estadio Secretor "Síntesis del Esmalte" |
3.1.5.4.4 Estadio de Maduración |
3.1.5.4.5 Estadio de Protección |
3.1.6 Prismas |
3.2 AMELOGÉNESIS IMPERFECTA |
3.2.1 Ciclo Vital de los Ameloblastos |
3.2.1.1 Etapa Morfogénica |
3.2.1.2 Etapa de Organización (Ameloblasto |
3.2.1.3 Etapa Formativa o de |
3.2.1.4 Etapa de Maduración |
3.2.1.5 Periodo de Protección |
3.2.1.6 Etapa Desmolitica |
3.2.2 Tipos de Amelogénesis |
3.2.2.1 Tipo Hipoplasico |
3.2.2.2 Superficie Irregular – |
3.2.2.3 Tipo Hipoplásico |
3.2.2.4 La Hipomineralización |
3.2.3 Microscopia Electrónica de la |
4. ARTICULOS INVESTIGATIVOS |
4.1 Enamelisina (Matriz Metalloproteinasa – 20) |
4.1.1 Introducciòn |
4.1.2 Materiales y Metodos |
4.1.3 Inmunohistoquimica |
4.1.4 Resultados |
4.1.5 Discusiòn |
4.2 La Sucesión de Longitud Llena, |
4.2.1 Procedimientos Experimentales |
4.2.2 Métodos de |
4.2.3 Aislamiento de ARN y |
4.2.4 Mapa Cromosomal del Gen de Ameloblastino de |
4.2.5 Resultado |
4.2.6 Expresión Tejido-Específica De |
4.3 Interacciones Proteina – A – |
4.3.1 Introducciòn |
4.3.2 Materiales y Metodos |
4.3.3 Detección Western de las |
4.3.4 Resultados |
4.3.5 Discusiòn |
4.4 Amelogenina, Señalan Mutación |
5. CONCLUSIONES |
6. BIBLIOGRAFIA |
6.1 Del Marco Teorico |
6.2 De los Articulos Investigativos |
7. ANEXOS |
INTRODUCCIÓN
Durante las semanas temprana que siguen el concepto de las
células
rápidamente que se dividen del embrión distinguen
en 3 células,
los tipos que forman la etapa trilaminar del disco del desarrollo:
ectodermo, mesodermo y endodermo. La amelogénesis
imperfecta, es una anomalía estructural hereditaria del
esmalte, que ocurre en la dentición primaria y en la
permanente. Se encuentra una forma hipomineralizada (defecto en
la maduración del esmalte), una hipoplásica
(esmalte delgado) y una hipocalcificada (defecto en la
mineralización primaria). En la forma hipoplásica,
hay una reducción cuantitativa del esmalte, con
mineralización normal; es poco frecuente y hay variaciones
en el aspecto y el genotipo. La transmisión autosómica recesiva se ha descrito en pocos
casos como una anomalía de esmalte delgado, rugoso,
amarillo pero duro. Se han descrito numerosos tipos de
amelogénesis imperfecta que se asocian con el cromosoma X,
debidos a defectos estructurales en el gen de amelogenina del
cromosoma X. Se ha demostrado que el gen se encuentra en el brazo
largo del cromosoma X, en el locus AIH3.
Dientes de color amarillo
intenso, con presencia de esmalte delgado y frágil,
compatible con amelogénesis imperfecta de tipo
hipoplásico. Se evidencia presencia de pocas caries. Hay
anomalía de forma dental generalizada, por la presencia de
molares con cúspide en punta, sin anatomía oclusal
definida, y tabla oclusal angosta. Los dientes son de
tamaño pequeño, tanto en la dentición
temporal como en la permanente. En este trabajo se irá a
tratar lo que es en sí la Amelogénesis Imperfecta,
sus principios y
consecuencias.
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL:
- Investigar y aprender la composición de los
dientes, los tipos de enfermedades que tiene la
cavidad bucal, en especial la Amelogénesis Imperfecta
que nos compete para nuestra carrera y empezar en firme para
tener una carrera exitosa.
OBJETIVOS ESPECIFICOS:
- Comprender la estructura,
composición, etapas de los dientes y su escasez en
alguna de estos componentes. - Reconocer la importancia de la cavidad bucal en el
proceso de
desarrollo y
de las tranformaciones que suceden para un bien o un
mal. - Comprender que la Amelogénesis Imperfecta es
el proceso de:
elaboración y mineralización de la matriz
orgánica. - Reconocer que el Ameloblasto es funcionalmente lo mas
importante para el desarrollo de los dientes y principal causa
por la cual se da la Amelogénesis
Imperfecta. - Identificar la estructura y
tamaño de los Ameloblastos. - Reconocer e Identificar los tipos de
Amelogénesis Imperfecta que hay con sus caracteristicas
fisiológicas.
3. MARCO TEORICO
- DESARROLLO DEL DIENTE
Durante las semanas temprana que siguen el concepto de las
células rápidamente que se dividen del
embrión distinguen en 3 células, los tipos que
forman la etapa trilaminar del disco del desarrollo: ectodermo,
mesodermo y endodermo.
Estos tipos de células continúan formando
todos los sistemas del
cuerpo en una manera ordenada. El ectodermo se convierte para
formar las estructuras
tales como la piel,
membranas mucosas, muchas glándulas (salivales
incluyendo); el mesodermo forma los huesos, el
músculo y el tejido fino conectivo, mientras que el
endodermo forma las varias estructuras
como los pulmones, y muchas otras estructuras
abdominales.
Durante las semanas 2 y 3 hay un espesamiento del
ectodermo en un canto ocurre a lo largo del disco trilaminar.
Este se espesa como resultado de la mitosis
crecientes dentro del ectodermo. Con el desarrollo adicional el
espesamiento prolifera hacia abajo en el mesodermo para formar el
tubo de los nervios: el sistema nervioso
presunto.
La invasión y la diferenciación
adicionales del ectodermo y en el mesodermo, en el extremo del
disco embrionario que debe convertirse en la pista, da lugar a
algunas células del origen ectodermal que se convierten en
mas como las células mesodermal. Estas células que
se llaman células ectomesenquimatoso, destacan su origen
mientras que reconocen que ahora están funcionando como
células del mesodermo. Las células del
ectomesenquimatoso serán responsables de todos los
elementos del músculo, del hueso y del tejido fino
conectivo de la cara y de las quijadas.
3.1.1 Lamina Dental
Entre las semanas 5 y 6, la cavidad bucal se llena casi
totalmente de la lengüeta que se convierte. El ectodermo que
alinea la cavidad bucal es delgadamente epitelio escamoso
estratificado. La división estarán los dientes
eventual en el adulto. Esto que espesa se describe como la
"lamina dental". Como invaden el ectomesenquimatoso subyacente y
ramifican casi inmediatamente para formar una estructura formada
invertida de "Y". La base de la Y se asocia a la superficie
epitelial y los dos brazos de la Y se embuten en el
mectomesenquimatoso subyacente. Un brazo de la Y, de lo mas cerca
posible a la mejilla y de los labios del embrión formara
el surco bucal, que separa el complejo del canto del diente
alveolar de los labios y de las mejillas. El otro brazo de la Y
continua invadiendo profundamente en el ectomesenquimatoso
subyacente y será la base para el desarrollo de los
dientes.
El ectomesenquimatoso que rodea la extensión
interna del ectodermo también experimenta actividad
miotica perceptible creciente. Como tal, hay una mayor densidad de las
células que rodean el ectodermo invasor.
3.1.2 Etapa del Brote del Desarrollo del
Diente
En 10 puntas en células de cada quijada (superior
e interior) en la extremidad del ectodermo invasor experimenta
mitosis
creciente. Esto da lugar a una "pista pequeña" o a la
formación del brote. La etapa del brote del desarrollo del
diente ahora delinea las células que van a hacer el
órgano dental. Estas células continuarán en
formar el esmalte del diente; mientras que esas células en
el ectomesenquimatoso adyacente formarán el esmalte
dental, la pulpa y el cemento del
diente.
En la etapa del brote hay una cierta
diferenciación que ocurre dentro de las células
ectodermal. Las células que están inmediatamente
adyacente a la lamina basal de que separan las células
ectodermal del polihedral dentro del liquido intercelular
creciente.
3.1.3 Etapa del Casquillo del
Desarrollo del Diente
Mientras que el nombre implica en esta etapa a el
órgano dental que se convierte a un "casquillo". Dentro
del centro del casquillo el ectomesenquimatoso incluido forma la
papila dental. En el diente completamente formado este
será la pulpa y el esmalte dental. El ectomesenchyme que
rodea el órgano dental también experimenta mitosis
creciente y forma una región (aunque es indistinto de los
tejidos finos
circundantes) llamada el "folículo dental". En el diente
completamente formado estas células formara el cemento, el
hueso alveolar y el ligamento periodontal.
Uno de los cambios dominantes vistos en esta
época del desarrollo del diente es la
diferenciación de las células del órgano
dental. Las células en la capa intima (adyacente a la
papila dental) se convierten en acolumnadas cuboidal o corto en
forma. Hay un aumento en los organelos sintetizados de estas
células (ej. Retículo endoplasmatico y aparato de
Golgi). Las células distinguidas se refieren mientras que
el "epitelio interno del esmalte (IEE)" y son los ameloblastos
presuntos que continuaran formando el esmalte.
Inmediatamente adyacente (dentro del órgano
dental) al IEE a la capa de células estratificadas
distintas. Estas células se refieren como el "intermedio
del estrato" (SI) y son las células especializadas que
utilizan la actividad sintetizada del IEE.
La capa exterior de células del órgano
dental se convierte en las células cuboidal cortas que se
llaman el "epitelio externo del esmalte" (OEE). Entre el OEE y
él SI al grupo de
células designadas el "retículo radiado" (SR)
distinga. Estas células son limitadas juntas por los
desmosomas numerosos y en la etapa actual del desarrollo
comienzan a secretar cantidades significativas de sustancia
extracelular. Este aumento en sustancia extracelular empuja las
células aparte. Sin embargo, donde son limitados por los
desmosomas siguen siendo firmemente adherente. Como tal, las
células toman en una estrella como aspecto (radiado), por
lo tanto el nombre.
Con el desarrollo del SR hay otro cambio de
concierto con mitotic creciente dentro del órgano dental,
en la apariencia del histological del órgano dental.
Aparece más de una "campanilla" ahora la forma.
3.1.4 Fase de la Campanilla de Desarrollo del
Diente
Durante este periodo hay una continuación del
diferenciación de la cuatro capa del órgano dental:
IEE, SI, SR y OEE. Al mismo tiempo la capa de
células de la papila dentales inmediatamente adyacente a
la membrana del sótano (qué separa el IEE de la
papila dental) la salida a las partes diferentes del
órgano dental, la forma final de cada diente es
determinada. La forma final del diente es determinada por la
forma de la unión entre el IEE y los odontoblastos (ie. el
dento presunto.unión de esmalte).
Las amelogeninas son proteínas,
que se encuentran en el esmalte dental y en el tejido vital que
sujeta al diente; el esmalte del diente es el tejido calcificado
mas duro, elaborado por el tejido epitelial; se diferencia
especialmente de los otros tejidos del
diente por ser de origen ectodérmico, los demás
tejidos del diente son de origen ectomesenquimatoso. La dureza
del esmalte es considerable ya que resiste el choque
masticatorio, lo cual es su principal función.
La composición del esmalte es aproximadamente de
94 % de sustancia inorgánica y un 6% de sustancia
orgánica y agua.
La sustancia inorgánica esta representada en
carbonato de calcio y fosfato de calcio. La sustancia
orgánica esta representada por unas proteínas
denominadas amelina y amelogenina. El ameloblasto tiene una mayor
actividad formadora hacia la parte oclusal o incisal disminuyendo
su actividad hacia la parte cervical, por esto el esmalte termina
en forma de filo de navaja.
La unidad estructural del esmalte es el prisma, que mide
aproximadamente 4 micras, las que se producen cada 24 horas por
un ameloblasto.
3.1.5 Color del Esmalte
El color de la corona cubierta de esmalte varia desde
blanco hasta grisáceo pasando por las gamas de amarillo.
Se ha sugerido que el color está determinado por la
translucidez del esmalte, de tal modo que los dientes amarillos
tienen un esmalte traslucido y delgado a través del cual
se ve el color amarillo de la dentina y que los dientes
grisáceos tienen el esmalte más opaco. El color del
esmalte también esta dado por la cantidad de
proteína en este y el grado de calcificación que es
importante para él diagnostico clínico de los
pacientes.
- Desarrollo del Esmalte
Durante la dentinogénesis los odontoblastos se
retiran centralmente, dejando por detrás dentina formada.
Los ameloblastos también se retiran, pero en dirección periférica, dejando
esmalte recién formado sobre dentina previamente formada.
Como el epitelio dental interno termina a nivel del borde
cervical, esta estructura determina la extensión de la
aposición del esmalte. La dentinogénesis comienza
en el estadio de campana tardío del desarrollo dentario.
Inmediatamente cuando comienza la amelogénesis, el germen
dentario es descripto como comenzando el estadio de corona del
desarrollo del diente.
La formación de cualquier tejido duro implica
esencialmente la producción de una matriz organiza dentro de
la cual se introducen sales minerales. El
esmalte difiere de otros tejidos duros en que es un producto
ectodérmico y posee una matriz orgánica distinta
con un patrón diferente de
mineralización.
La formación del esmalte es un proceso complejo
que comprende tres estadios. El primero es informativo e implica
la secreción de una matriz orgánica por parte de
las células diferenciadas a partir del epitelio dental
interno, a una velocidad
promedio alrededor de 0,023 mm por día. Esta matriz se
mineraliza casi instantáneamente, de modo que el esmalte
recién formado consta de alrededor de 65% de agua, 20% de
material orgánico (proteína) y 15% de material
inorgánico (apatita). La secreción de este esmalte
parcialmente mineralizado continua hasta que se ha formado casi
todo el espesor del esmalte, con algunas modificaciones de la
matriz. Cuando se segrega por primera vez, la matriz consta de
dos tipos de proteínas: una amelogenina hidrofobica rica
en prolina, con un peso molecular de alrededor de 25.000 daltons
y una fosfoproteina ácida glucosilada con un peso
molecular alrededor de 55.000 daltons llamada enamelina. Las
amelogeninas exceden a las enamelinas en un cociente de 19:1. Los
cristales depositados en esta matriz son largas placas delgadas
de hidroxiapatita cuya longitud se completa inmediatamente. A
medida que se segrega mas matriz, las proteínas del
esmalte muestran una reducción progresiva por
proteólisis extracelular, y los cristales aumentan de
ancho. De esta manera, la matriz del esmalte se mineraliza hasta
un 30% y posee consistencia blanda. La matriz sufre el segundo
estadio: la maduración, un proceso que comprende el
ulterior del crecimiento de cristales de mineral y la perdida de
agua y proteínas. La maduración comienza en el
centro de crecimiento en el momento en que el esmalte ha
alcanzado su total grosos a nivel del extremo cuspideo. Procede
siguiendo el mismo patrón de la secreción de la
matriz, comenzando en el limite amelodentario, radiándose
hacia la superficie externa en un arco cervical a una velocidad de
0,04-0,05 mm diarios mas rápido que la secreción de
la matriz. La remoción de material proteico durante la
maduración es selectivo, dado que se extraen todas las
amelogeninas, dejando sólo las enamelinas de mas alto peso
molecular fuertemente unidas a las superficies del cristal de
apatita. Se pierde alto de agua, de manera que ahora el esmalte
esta altamente mineralizado, pero aún es muy poroso. El
tercer estadio en la formación del esmalte resulta en el
agregado de mas mineral y en la perdida de porosidad. Durante la
dentinogénesis los odontoblastos se retiran centralmente,
dejando por detrás dentina formada. Los ameloblastos
también se retiran, pero en dirección periférica, dejando
esmalte recién formado sobre dentina previamente formada.
Como el epitelio dental interno termina a nivel del borde
cervical, esta estructura determina la extensión de la
aposición del esmalte. La dentinogénesis comienza
en el estadio de campana tardío del desarrollo dentario.
Inmediatamente cuando comienza la amelogénesis, el germen
dentario es descripto como comenzando el estadio de corona del
desarrollo del diente.
La formación de cualquier tejido duro implica
esencialmente la producción de una matriz organiza dentro de
la cual se introducen sales minerales. El
esmalte difiere de otros tejidos duros en que es un producto
ectodérmico y posee una matriz orgánica distinta
con un patrón diferente de
mineralización.
La formación del esmalte es un proceso complejo
que comprende tres estadios. El primero es informativo e implica
la secreción de una matriz orgánica por parte de
las células diferenciadas a partir del epitelio dental
interno, a una velocidad promedio alrededor de 0,023 mm por
día. Esta matriz se mineraliza casi
instantáneamente, de modo que el esmalte recién
formado consta de alrededor de 65% de agua, 20% de material
orgánico (proteína) y 15% de material
inorgánico (apatita). La secreción de este esmalte
parcialmente mineralizado continua hasta que se ha formado casi
todo el espesor del esmalte, con algunas modificaciones de la
matriz. Cuando se segrega por primera vez, la matriz consta de
dos tipos de proteínas: una amelogenina hidrofobica rica
en prolina, con un peso molecular de alrededor de 25.000 daltons
y una fosfoproteina ácida glucosilada con un peso
molecular alrededor de 55.000 daltons llamada enamelina. Las
amelogeninas exceden a las enamelinas en un cociente de 19:1. Los
cristales depositados en esta matriz son largas placas delgadas
de hidroxiapatita cuya longitud se completa inmediatamente. A
medida que se segrega mas matriz, las proteínas del
esmalte muestran una reducción progresiva por
proteólisis extracelular, y los cristales aumentan de
ancho. De esta manera, la matriz del esmalte se mineraliza hasta
un 30% y posee consistencia blanda. La matriz sufre el segundo
estadio: la maduración, un proceso que comprende el
ulterior del crecimiento de cristales de mineral y la perdida de
agua y proteínas. La maduración comienza en el
centro de crecimiento en el momento en que el esmalte ha
alcanzado su total grosos a nivel del extremo cuspideo. Procede
siguiendo el mismo patrón de la secreción de la
matriz, comenzando en el limite amelodentario, radiándose
hacia la superficie externa en un arco cervical a una velocidad
de 0,04-0,05 mm diarios mas rápido que la secreción
de la matriz. La remoción de material proteico durante la
maduración es selectivo, dado que se extraen todas las
amelogeninas, dejando sólo las enamelinas de mas alto peso
molecular fuertemente unidas a las superficies del cristal de
apatita. Se pierde alto de agua, de manera que ahora el esmalte
esta altamente mineralizado, pero aún es muy poroso. El
tercer estadio en la formación del esmalte resulta en el
agregado de mas mineral y en la perdida de porosidad.
| Esmalte en | Esmalte en | ||
Aminoácido | A | B | C | d |
Acido Aspartico | 43 | 39 | 61 | 96 |
Treonina | 38 | 36 | 42 | 52 |
Serina | 59 | 59 | 74 | 87 |
Acido Glutámico | 150 | 141 | 128 | 142 |
Prolina | 241 | 249 | 193 | 80 |
Glicina | 70 | 74 | 94 | 109 |
Alanina | 24 | 24 | 35 | 72 |
Cistina | 1 | 0 | 0 | 3 |
Valina | 41 | 37 | 42 | 55 |
Metionina | 42 | 41 | 28 | 10 |
Isoleucina | 35 | 34 | 35 | 31 |
Leucina | 95 | 100 | 96 | 93 |
Tirosina | 42 | 50 | 46 | 26 |
Fenilalanina | 24 | 21 | 29 | 36 |
Histidina | 55 | 53 | 39 | 23 |
Lisina | 18 | 17 | 29 | 53 |
Arginina | 24 | 24 | 29 | 33 |
Triptófano | No determinado | |||
Porcentaje de | 14.7 | 14.6 | 5.9 | 2.5 |
Composición en aminoácidos de muestras de
esmalte extraídas secuencialmente de un incisivo superior
primario de un feto que contiene tanto estadios madurativos como
formativos. (Valores
expresados como residuos/1000).
3.1.5.2 Mineralización de la Matriz
Orgánica
El deposito inicial de mineral (mineralización
parcial inmediata) se produce en la unión amelodentinaria
y los cristales crecen mas tarde, siguiendo su eje longitudinal,
por la progresiva adición de iones a su extremo terminal.
A este nivel se localizan la DSP y la tuftelina que tienen la
misión
de iniciar el proceso de mineralización debido a su
capacidad de unirse con el componente mineral. Se ha relacionado
a la tuftelina con la hipermineralización existente en la
unión amelodentaria. En la vaina de Hertwig y antes de la
formación del esmalte se expresa la
ameloblastina.
En estudios in vivo (utilizando el MET y el MEB) e in
vitro (utilizando amelogenina recombinante se ha podido demostrar
que, alrededor y entre los cristales iniciales de 1 a 3 nm de
espero se disponen formaciones esféricas (nanosferas) de
20 nm constituidas por amelogeninas (cada esfera esta integrada
por 100 monomeros de amelogeninas). Las nanosferas constituyen
hileras en forma de rosario que con el MET se observan como
estructuras electrolucidas y que previenen el crecimiento lateral
y la fusión o
fractura de estos cristales iniciales. Esta disposición
deja libre la superficie de dichos cristales próxima al
ameloblasto la cual va sucesivamente creciendo gracias al aporte
de Ca2+ y de PO43- que le van
suministrando los ameloblastos. La enamelina puede también
participar en esta malla reticular de materia
orgánica que de forma progresiva va configurando el
soporte del cristal.
La disposición descrita de estas proteínas
permite regular la morfología
y el tamaño del cristal, modulando e inhibiendo un
crecimiento anómalo del mismo o el contacto de su
superficie con otras sustancias, como la albúmina,
también presente en la matriz, y que es un conocido
inhibidor de la hidroxiapatita y del crecimiento del
cristal.
La actividad enzimática, primero de las
metaloproteasas y luego de las proteasas de serina, van
remodelando la matriz y degradando y eliminando el componente
orgánico. Ello hace posible el crecimiento controlado de
los cristales iniciales y trae como consecuencia que se
establezcan puentes o bandas entre los mismos, para mas tarde y
por coalescencia configurar los cristales definitivos. El proceso
de mineralización avanza con la sustitución
progresiva de agua y materia
orgánica hasta que el esmalte alcanza un contenido en
materia inorgánica del 95%.
En la ultima fase del proceso de mineralización
intervendría la ameloblastina que seria segregada por la
vertiente lisa de los ameloblastos y que vendría un
papel
fundamental en la configuración de los limites de los
prismas y en la constitución de la vaina del
prisma.
El aporte de calcio y fosfato para la formación y
el crecimiento de los cristales proviene de los ameloblastos. El
ultimo aporte de sales minerales proviene de los capilares del
saco invaginados en el órgano del esmalte. El estrato
intermedio selecciona el paso de iones hacia el ameloblasto,
fenómeno que estaría regulado por hormonas y
vitaminas
(deficiencias vitamínicas o endocrinopatias producen
perturbaciones que se traducen en anomalías estructurales
del esmalte). En el estrato intermedio se detecta fosfatasa
alcalina de forma significativa así como ATPasa
dependiente del calcio. Por ultimo los métodos de
autorradiografia cuantitativa del calcio al MET han puesto de
relieve dos
vías de difusión para este elemento:
- Una vía transcelular a través de los
ameloblastos hacia el esmalte en desarrollo. - Una segunda vía extracelular a través
de los espacios intercelulares.
En relación con el transporte de
calcio en el ameloblasto es importante destacar la significativa
presencia de la actividad enzimática ATPasa dependiente
del calcio que existe en distintos lugares de la celular: la
membrana plasmatica, el complejo de Golgi, las mitocondrias,
etc.
Existen también canales de calcio y distintas
proteínas (calbindina, calmodulina, anexinas, etc.)
implicadas en el transporte de
dicho elemento. El calcio que penetra por las membranas
basolaterales se uniría a la calbindina y seria expulsado
a la matriz del esmalte gracias a la ATPasa dependiente del
calcio, ubicada en la membrana que delimita el proceso de
Tomes.
El esmalte adulto de un elemento ya erupcionado continua
incorporando iones en su superficie, mecanismo conocido como
remineralización, que esta en relación directa con
el grado de permeabilidad del esmalte.
3.1.5.3 Histofisiología
El esmalte presenta características histofisiologicas que lo
distinguen de los demás tejidos dentarios. El
conocimiento de estas características estructurales,
físicas y químicas es indispensable para poder
comprender su comportamiento
biológico. Teniéndolo en cuenta es posible realizar
una correcta reparación de los tejidos perdidos, prevenir
la caries y evitar que el mecanismo destructor de la caries se
repita.
La actividad biológica fundamental en la que
participa el esmalte es la de ser el soporte y la estructura
donde se ejercen las fuerzas de la masticación generadas
por las contracciones musculares del aparato masticatorio. Dichas
fuerzas son de alrededor de 50 Kg. y en algunos individuos (los
esquimales), debido a variables
culturales que tienen que ver con la alimentación, dichas
fuerzas alcanzan los 150 kg. La fuerza mayor
se ejerce en el primer molar y la menor en los incisivos en la
que la fuerza
desciende hasta 10 kg. En relación con las fuerzas
masticatorias es importante saber que el esmalte, que es el
tejido mas duro del organismo, el mas frágil, presentando,
por ello, una gran tendencia a las macro y microfracturas. El
soporte dentario subyacente es el que le permite, además
de su sostén, una cierta elasticidad.
Debido a su alto contenido inorgánico el esmalte
es también particularmente vulnerable a la
desmineralización provocada por los ácidos
elaborados por las bacterias
existentes en la placa bacteriana. El resultado es la caries
dental y de ahí la importancia de eliminar la placa
adherida a la superficie libre del esmalte con un cepillado
correcto, para prevenir el inicio de la caries.
3.1.5.4 Ultraestructura de la
amelogénesis
Los estudios ultraestructurales de la formación
del esmalte han aportado mucho a la comprensión de este
complicado proceso. Las exigencias que impone el proceso de
fijación para la microscopia electrónica son tales, que muchos de estos
estudios han debido realizarse en material proveniente de
roedores. Afortunadamente, ya se han reportado suficientes
estudios realizados sobre material obtenido de primates para
poder
establecer similares.
3.1.5.4.1 Estadio Morfogenético
Durante los estadios de corona y de campana del
desarrollo dentario, las células del órgano dental,
junto con las de la papila dental, interactuan por crecimiento
diferencial para establecer la forma de la corona del diente.
Mientras se hallan implicadas en esta actividad morfogenetica,
las células del epitelio dental interno son cubicas con
núcleos grandes ubicados centralmente. Los Complejos de
Golgi se hallan en las zonas proximales de las células (el
extremo adyacente al estrato intermedio). Las mitocondrias y
otras organelas citoplasmaticas se hallan esparcidas en las
células.
3.1.5.4.2 Estadio de
Diferenciación
A medida que las células del epitelio dental
interno se diferencian en ameloblastos, sé elongan y sus
núcleos se desplazan para aproximarse hacia el estrato
intermedio. El Complejo de Golgi aumenta de volumen y migra
desde su posición proximal, para ocupar una parte
importante de la porción central de la célula.
La cantidad de retículo endoplasmatico rugoso aumenta
significativamente y las mitocondrias se agrupan en la
región proximal, aunque algunas se hallan dispersas en las
células. De esta manera, el ameloblasto se convierte en
una célula
altamente polarizada, con la mayoría de sus organelas
situadas en el cuerpo celular ubicadas distalmente respecto del
núcleo.
Los ameloblastos adyacentes se hallan alineados
estrechamente uno respecto del otro, y esta alineación se
mantiene mediante el agregado de especializaciones de contacto, o
Complejos de Unión, establecidos entre ellos. Estos
Complejos de unión rodean las células a nivel de
sus extremos distal (más cercana a la dentina) y proximal.
Tonofilamentos finos radian desde los Complejos de Unión
dentro del citoplasma de los ameloblastos, y se los distingue
formando barras terminales proximal y distal. Muy a menudo el
complejo de la barra terminal proximal aparece bajo el microscopio
óptico como una capa continua que separa los ameloblastos
del estrato intermedio, pero esta es una ilusión causada
por el microscopio
óptico.
Ultimamente ha quedado claro que existe una diferencia
funcional entre los complejos de unión proximal y distal.
Experimentos
en los cuales se usa peroxidasa de rabanito picante o lantano,
como trazadores demuestran que dichos materiales son capaces de
pasar entre las uniones proximales (permeables a ellos) hacia los
espacios paracelulares y, por lo tanto, las uniones son de la
variedad macular (puntual).
Ninguno de los dos trazadores, sin embargo pasa mas
allá de la unión distal, la cual pertenece a la
variedad zonular (que rodea a toda la
célula). El sellado del complejo de distal solo ocurre
a medida que los ameloblastos asumen su función
secretoria, dado que se ha demostrado que antes que comience la
secreción ellos son permeables.
La lamina basal sobre la cual se apoyan los ameloblastos
se desintegra después del comienzo de la
amelogénesis.
3.1.5.4.3 Estadio Secretor "Síntesis del
Esmalte"
La ultraestructura del recientemente formado ameloblasto
refleja su futura función sintética y secretora. La
síntesis de la proteína del esmalte verifica en el
retículo endoplasmatico rugoso desde donde pasa al
Complejo de Golgi, en donde se condensa y empaqueta en
gránulos secretorios rodeados por una membrana. Estos
gránulos migran a la extremidad distal de la célula, y
su contenido es liberado contra la recientemente formada la
dentina del manto. Hay poco o ningún intervalo entre la
secreción de la proteína del esmalte y la
aparición de esmaltes inorgánicos dentro de ella.
Estos cristales están empaquetados al azar en el esmalte
que se forma primero y se interdigitan con los cristales de la
dentina. Algunos consideran que los cristales de la dentina
forman los sitios de nucleación para los cristales del
esmalte.
A medida que se forma esta primera capa amorfa del
esmalte, los ameloblastos se alejan de la superficie de la
dentina y cada ameloblasto desarrolla una proyección
cónica corta conocida como proceso de Tomes. Aunque el
citoplasma de un ameloblasto se continua con el proceso de Tomes,
la distinción entre proceso y cuerpo celular esta marcada
claramente por el complejo de unión (la barra terminal).
El proceso contiene primariamente gránulos secretorios y
pequeñas vesículas, mientras que el citoplasma del
ameloblasto contiene abundantes organelas
sintetizadoras.
Una vez que se establecen los procesos de
tomes, la secreción de la proteína del esmalte por
parte de los gránulos secretorios se verifica a
través de estrechos canales que están localizados
primariamente en dos regiones dentro de estos procesos,
especialmente en sus extremos dístales y en la extremidad
proximal donde se unen procesos adyacentes. Sin embargo, los
tiempos se superponen un poco, de modo que la secreción a
nivel de la distal, formando de esta manera fositas amuralladas
ocupadas por el extremo distal del proceso.
Estas fositas después se llenan de
secreción desde una de las superficies del proceso de
Tomes. El proceso de Tomes crea una estructura en el esmalte. El
proceso de Tomes persiste hasta la formación de los pocos
incrementos finales de esmalte, que es también amorfo, y
se lo conoce como esmalte aprismático.
3.1.5.4.4 Estadio de Maduración
Una vez que se ha formado todo el espesor de la matriz
del esmalte, los ameloblastos sufren cambios ultraestructurales
significativos ligados a su nueva función de
maduración del esmalte. Hay una breve transición
que implica una reducción de altura del ameloblasto y una
disminución de su volumen y
contenido de organoides. Las organelas excedentes, asociadas con
la síntesis, sin encerradas en vesículas
autofagicas y son digeridas por enzimas
lisosomales. Este desarrollo es seguido por un desplazamiento en
muchas de las organelas que quedan en la parte distal de la
célula y por un plegamiento en muchas de las organelas que
quedan en la parte distal de la célula y por un
plegamiento complicado de la membrana plasmatica distal para
formar un borde estriado. Este borde estriado aumenta enormemente
la superficie de la extremidad del ameloblasto e indica que hay
rápido transporte de material a través de la
membrana plasmatica.
Ya se ha mencionado que durante la maduración,
hay cambios cualitativos y cuantitativos en el componente
orgánico del esmalte, y que el ameloblasto puede hallarse
implicado en la remoción selectiva de material
orgánico. Los estudios morfológicos han revelado
material parecido a la matriz del esmalte entre las
prolongaciones del borde estriado y dentro de las vacuolas
presentes en el ameloblasto. Otros estudios, en los cuales los
componentes orgánicos del esmalte se marcaron con
isótopos radioactivos, también indican que hay
material orgánico que sale de la matriz del esmalte
formada y que penetra en el ameloblasto en maduración
(absortivo).
Al igual que los otros cambios que ocurren dentro del
componente orgánico del esmalte, la maduración
también implica el rápido influjo de calcio y
fosfato. Esta acción permite el rápido crecimiento
de los cristales, que se verifica para ocupar los espacios
formados a medida que se remueven el agua y el
material orgánico. El proceso por el cual estos iones
inorgánicos son introducidos en un cierto momento dentro
del esmalte no se comprende del todo. Se ha observado que grandes
grupos de
ameloblastos en maduración alternan entre fases en las
cuales poseen una superficie distal-suave o la típica
superficie estriada. Parece que puede haber patrones
cíclicos de función celular (remoción
proteica e influjo de calcio), los que se relacionan con esas
características morfológicas. El esmalte adyacente
a los ameloblastos con superficies estriadas parece hallarse mas
densamente implicado en la captación de calcio. Se ha
sugerido que el desarrollo del borde estriado y la fosfatasa
alcalina a lo largo del mismo reflejan el rapido pasaje de iones
inorgánicos a través de la membrana celular durante
la maduración del esmalte.
El crecimiento de los cristales del esmalte ocurre como
se describe a continuación. Cuando los cristalitos
comienzan a aparecer tienen aproximadamente 3,1 nm de espesor y
29 nm de ancho y se hallan densamente empaquetados (1.240
cristalitos por m
m2). Tales cristales crecen entonces
rápidamente en ancho y más lentamente en espesor
hasta que llegan a un ancho promedio de aproximadamente 65 nm. El
crecimiento en espesor continua por un tiempo
más, hasta que se llega a un grosor promedio de 25 nm en
el esmalte maduro, el cual contiene aproximadamente 560
cristalitos por micrómetro cuadrado. Esta
disminución en el numero de cristalitos por unidad de
superficie es creado no solamente por el crecimiento de los
cristalitos, sino también por la fusión de
los cristalitos entre sí.
3.1.5.4.5 Estadio de Protección
A medida que la maduración del esmalte llega a su
termino, los ameloblastos pierden sus bordes estriados y segregan
un material entre el extremo distal de la célula, ahora
achatado, y la superficie del esmalte, el cual aparece
morfológicamente idéntico a una membrana basal.
También en este momento se forman hemidesmosomas a lo
largo de la membrana celular distal. Estas estructuras, junto a
la lamina basal, proveen de un medio de unión firme para
los ameloblastos a la superficie del esmalte, el cual es
especialmente importante para el establecimiento de la
unión dentogingival.
3.1.6 Prismas
El esmalte esta formado por bastones o prismas, vainas y
una sustancia interprismática de unión. Se ha
calculado que él numero de prismas del esmalte va desde
cinco millones, en los incisivos laterales inferiores, hasta doce
millones en los molares superiores. Los prismas no son
completamente rectos sino presentan algunas curvaturas, en
especial en la porción oclusal. La translucidez del
esmalte parece ser debida a variaciones del grado de
calcificación. Los prismas son los más calcificados
en cambio la
sustancia intercélular es menos calcificada que el prisma
y las vainas son ligeramente menos calcificadas de la sustancia
cementante.
El microscopio también muestra otras
estructuras del esmalte, al estudiar un corte por desgaste, estas
son las bandas de Hunter Schregaer, bandas de Retzius, laminillas
del esmalte. Algunas de ellas tienen poca importancia
clínica.
Las laminillas de esmalte son estructuras delgadas
foliculares que se extienden desde la superficie externa del
esmalte a la unión amelodentinal, su composición es
de material orgánico y bajo contenido mineral.
Se distinguen tres tipos de laminillas de
esmalte:
- Tipo A: Poco calcificada.
- Tipo B: Constituidas por restos de células en
degeneración. - Tipo C: Constituidas por resquebrajaduras que se
llenan de material orgánico presumiblemente originadas
por la saliva.
- AMELOGÉNESIS
IMPERFECTA
La amelogénesis es el proceso del esmalte que
comprende:
- La elaboración de una matriz orgánica
extracelular - La mineralización casi inmediata de la
misma.
Ambos procesos están íntimamente ligados
en el tiempo, luego de describir los ameloblastos que son las
células formadoras del esmalte. Los ameloblastos se
diferencian a partir del epitelio interno del órgano del
esmalte y alcanzan un alto grado de especialización. En el
proceso de diferenciación se requiere de la presencia de
dentina. Debido a ello, la diferenciación se inicia en la
región del futuro extremo cuspideo del germen dentario,
siguiendo la dentina en desarrollo y se propaga en
dirección de las asas cervicales hasta que todas las
células del epitelio dental interno se transforman en
ameloblastos. El extremo del asa cervical del órgano del
esmalte, determina la extensión de la aposición del
esmalte ya que los ameloblastos del epitelio interno solo llegan
hasta ese nivel.
Estructura y ultraestructuralmente, el ameloblasto
constituye la unidad funcional, dado que es la única
célula responsable de la secreción de la matriz
organiza del esmalte.
El esmalte que esta compuesto por dos clases de
proteínas: la enamelina y la amelogenina. A
ubicación de los disturbios genéticos que afectan a
formación del esmalte es conocida como amelogénesis
imperfecta.
Una proteína defectuosa en AI como la amelogenina
(controla la mineralización del esmalte).
El gen está localizado en un brazo corto de los
cromosomas X y en
la localidad correspondiente; no-cromosoma Y.
Ocurre en una proporción de 1/14.000 que se
forman varios tipos de herencia:
dominante ligada al cromosoma X, resecivo ligado a X, autosomica
dominante y autosomica recesiva.
El esmalte es el tejido ectodérmico que cubre la
corona anatómica del diente. Esta formado por el
órgano dental, el cual deriva de una proliferación
localizada del epitelio oral. Las células que forman el
esmalte, los ameloblastos, se diferencian dentro del epitelio
dental interno como una parte del órgano dental. Debido a
este proceso de diferenciación requiere la presencia de
dentina, este comienza en la región del futuro extremo
cuspideo de germen dentario; siguiendo la dentina el desarrollo,
y propagándose hacia abajo de las vertientes cuspideas
hasta que todas las células del epitelio dental interno se
han convertido en ameloblastos.
3.2.1 Ciclo Vital de los
Ameloblastos
Durante el desarrollo del germen dentario los
ameloblastos atraviesan una serie sucesiva de etapas, que abarcan
todos los cambios que sufren estos elementos desde que las
células poseen un carácter
absolutamente indiferenciado hasta que, tras diferenciarse y
madurar, desaparecen por completo. Cada una de las etapas se
caracteriza por presentar cambios estructurales citoquimicos y
ultraestructurales que dependen del estado
funcional, que poseen las células en relación con
los procesos de formación o maduración del
esmalte.
Las etapas o periodos que constituyen el ciclo vital del
ameloblasto, son las siguiente:
Etapa Morfogénica (preameloblasto)
Etapa de organización o diferenciación
(ameloblasto joven)
Etapa formativa o de secreción (ameloblasto
activo, secretor o maduro)
Etapa de maduración
Etapa de protección
Etapa desmolítica
El desarrollo de los ameloblastos progresa desde los
bordes incisales o cuspideos hacia el asa cervical, por lo cual,
en un solo corte histológico de la etapa aposicional
pueden observarse la mayoría de las características
histológicas del ciclo vital de los
ameloblastos.
Las células del epitelio interno del
órgano esmalte interactuan con las células
ectomesenquimaticas de la papila determinando la forma de
la CAD y de la corona.Los preameloblastos con células
cilíndricas bajas con grandes núcleos
ovalados, ubicados en la región central que ocupan,
casi por completo, el cuerpo celular. El Complejo de Golgi
y los centriolos están localizados en el extremo
basal de la célula (sector adyacente al estrato
intermedio), mientras que las mitocondrias se hallan
distribuidas uniformemente por todo el citoplasma. En el
extremo apical existen cisternas desarrollados de
unión intercelulares.En un corte histológico del germen
dentario, en estadio de campana aposicional, se localizan
cerca del asa cervical.El epitelio interno del órgano del esmalte
esta separado del tejido conectivo de la papila
dentaría por una delgada lamina basa, la lamina
basal ameloblástica (LBA), que contiene laminina,
colágeno tipo IV, ectanina, heparán sulfato y
fibronectina. La capa pulpar adyacente presenta una zona
acelular, clara y angosta que desde el punto de vista
histoquímico es metacromática y
alcianófila. Los preameloblastos muestran abundantes
prolongaciones citoplasmáticas, que se extienden
desde la superficie apical (limite con la papila dental)
hasta la matriz intercelular en la que penetran. Estas
prolongaciones entran en contacto con las células
ectomesenquimáticas de la papila, Posiblemente
podrían desempeñar un papel
importante en las interacciones
epitelio-ectomesénquima. En este periodo intervienen
distintos factores tales como el TGF-b , FGF y EGF que inciden
sobre la diferenciación general de las
células que forman el estadio de casquete del germen
dentario. En los preameloblastos (epitelio dental interno)
los receptores Nocth y EGF están disminuidos en
relación con las células del epitelio dental
externo del órgano del esmalte.En los preameloblastos de esta etapa
morfogenética se inicia la expresión y la
secreción de tuftelina, de sialofosfoproteina
dentanaria (DSP) y de ATPasa dependiente del
calcio.- Etapa Morfogénica
- Etapa de Organización (Ameloblasto
Joven)
En esta etapa que coincide con el periodo de campana,
las células del epitelio interno del esmalte, que siguen
expresando niveles bajos de receptores Nocth y EGF inducen,
mediante la elaboración de TGF-b , a las células
mesenquimáticas del tejido conectivo adyacente a
diferenciarse en odontoblastos. En este periodo los ameloblastos
cambian de aspecto: las células se alargan, cambian de
polaridad, las organelas y el núcleo se dirigen hacia
basal (estrato intermedio).
El citoplasma muestra un cierto
grado de desarrollo de RER (basofilia cada vez más
intensa), y del Complejo de Golgi, las mitocondrias se agrupan en
la región basal, y se observan numerosos microfilamentos y
microtubulos. Los ameloblastos se hallan alineados
estrechadamente uno respecto del otro, a través de
especializaciones de contacto o complejos de unión que se
localizan a nivel de los extremos básales y apicales de
las células. Se ha establecido que existen diferencias
funcionales entre ellas. Las uniones mas apicales son del tipo
macular (puntual) u permeables al paso de algunas sustancias
hacia los espacios intercelulares. Las uniones básales
pertenecen a la variedad zonular (rodean a toda la célula)
y son impermeables al paso de algunas sustancias hacia los
espacios intercelulares. Las uniones mas básales
pertenecen a la variedad zonular (rodean a toda la célula)
y son impermeables al paso de sustancias.
Los Tonofilamentos que se proyectan desde las uniones de
la membrana hacia el citoplasma de los ameloblastos, forman las
barras terminales apicales y básales. Existen desmosomas
bien desarrollados que se ven, tanto en la región apical,
como en la basal.
A zona clara y acelular entre el epitelio interno y la
papila dentaría desaparece quizás por el
alargamiento de las células epiteliales que se ponen en
contacto con las células de la papila, las cuales han
comenzado su diferenciación en odontoblastos. Hacia el
final del periodo de organización comienza la
secreción de dentina por parte de los odontoblastos.
Cuando esto ocurre se desarrolla una inversión de la corriente nutricia, al
quedar separados los ameloblastos de la papila dentaría,
su fuente primitiva de nutrición. Ahora su
nutrición
procede de los capitales del saco dentario que rodean al
órgano del esmalte y que penetran con el epitelio externo
por invaginación hacia el estrato intermedio. El cambio de
polaridad que el ameloblasto joven sufre en esta, esta
relacionado con una reprogramación de los mecanismos
celulares que controlan el trafico vesicular, dado que a partir
de esta fase, se va a desarrollar una intensa síntesis de
secreción de proteínas del esmalte. En los
ameloblastos jóvenes que todavía conservan la
capacidad de dividirse puede ya detectarse la presencia de
amelogenina.
3.2.1.3 Etapa Formativa o de
Secreción
El ameloblasto secretor es una célula
diferenciada, muy especializada que ha perdido la capacidad de
dividirse por mitosis. La población de preameloblastos constituye por
ello una fuente constante de provisión de
ameloblastos.
Los ameloblastos secretores son células
cilíndricas y delgadas de unos 60 m m de altura. Entre sus caras
laterales existen sistemas de
unión semejantes a los descritos en la etapa anterior,
observándose pequeños espacios interameloblasticos
hacia los que las células proyectan pequeñas
microvellosidades. Al MO el citoplasma es fuertemente basofilo,
debido a un ergastoplasma bien desarrollado (típico de
células excretoras), y el núcleo es grande con
cromatina laxa y un nucleolo evidente. El núcleo del
ameloblasto se encuentra ahora en el polo basal, o sea en el polo
opuesto a la futura CAD.
Al ser una célula secretora, desde el punto de
vista ultraestructural presenta las siguiente
características: abundantes mitocondrias (polo secretor);
Complejo de Golgi constituido por varios dictiosomas en la misma
zona; RER distribuido por toda la célula y más
desarrollado en el polo apical; microfilamentos de
tubulina, a
-actinina, vinculina y prequeratinas que se disponen a lo
largo de la célula constituyendo el citoesqueleto y cuya
integridad resulta necesaria para la diferenciación total
y la secreción de los ameloblastos.
En el citoplasma de los ameloblastos secretores se han
descrito vesículas denominadas cuerpos ameloblasticos o
cuerpos adamantinos que son formaciones de tipo granular,
consideradas como precursores intracelulares de la matriz
orgánica del esmalte. Se localizan cerca del Complejo de
Golgi en el cual tienen su origen. Poseen morfología
ovoidea y contienen un material granular muy fino, rodeado por
membrana.
El contenido de los cuerpos ameloblasticos no se conoce
con exactitud. Por una parte, se supone que su naturaleza es
proteica y que contiene constituyentes propios de la matriz
orgánica del esmalte. Algunos autores consideran que
podrían contener sales minerales cálcicas en forma
soluble. Los gránulos secretorios o cuerpos
ameloblasticos, una vez formados en el Complejo de Golgi, migran
hacia el polo apical de la célula, donde son liberados
contra la dentina formada. La secreción de
proteínas del esmalte y la aparición de cristales
inorgánicos dentro de ellas, es casi simultanea. Los
cristales del esmalte se forman primero se interdigitan con los
cristales de la dentina. A medida que se forma esta primera capa
amorfa de esmalte (esmalte aprismático), los ameloblastos
se alejan de la superficie de la dentina y cada uno desarrolla
una proyección cónica denominada proceso de
Tomes.
Los sistemas de unión más próximos
al polo apical, marcan con claridad el limite entre el cuerpo
celular del ameloblasto y el proceso de Tomes. Es decir, que el
ameloblasto secretor en esta etapa del ciclo se caracteriza desde
el punto de vista morfológico por la presencia del proceso
de Tomes, estructura responsable por la formación de
prismas y la disposición de los cristales dentro del
mismo.
En el proceso de Tomes la membrana ofrece dos patrones
de superficie: uno de ellos presenta invaginaciones, mientras que
el otro ofrece una superficie más lisa. La presencia del
proceso de Tomes supone la ruptura de la membrana basa, que se
produce por la acción lítica de enzimas
lisosómicas procedentes de los ameloblastos o por enzimas
derivadas del
odontoblasto. El citoplasma del proceso de Tomes contiene
gránulos secretores (cuerpos ameloblasticos),
pequeñas vesículas, mitocondrias y microfilamentos.
Las dos vertientes membranosas del proceso de Tomes representan
dos áreas distintas de secreción: a) el polo
secretor que presenta invaginaciones es el responsable de formar
el esmalte de la cabeza de los primas. Los cristales que se
depositan sobre la materia orgánica se disponen
perpendicularmente a la superficie del polo secretor; b) el polo
secretor de superficie lisa es el responsable de la
formación del esmalte de la cola del prisma adyacente. Los
cristales aquí depositados tienden a ser también
perpendiculares a la superficie.
Ambas secreciones y su posterior mineralización
darán lugar a la
organización de los primas y a la orientación
de los cristales en el seno de los mismos. La secreción de
la cola de un prima precede a la de la cabeza del siguiente, lo
que configura una fosita ocupada por el resto del proceso de
Tomes. Esta fosita se llena mas tarde con la secreción
elaborada por el polo secretor de la cabeza. Se desconocen si
existe mecanismos selectivos de polaridad en la
elaboración, transito y secreción, en el
ameloblasto, hacia cada una de las vertientes del proceso de
Tomes.
Se admite que en la formación de cada prisma
intervienen cuatro ameloblastos y que cada ameloblasto contribuye
a formar cuatro prismas.
La presencia y el desarrollo del proceso de Tomes,
están asociados principalmente con la formación del
esmalte prismático. Esto explica que el esmalte se
deposita inicialmente aprismático. También se suele
encontrar una fina capa aprismática en la superficie
externa del esmalte. Es decir, que el prima se forma solo cuando
la prolongación citoplasmatica apical está
presente.
Los ameloblastos están unidos por desmosomas a
las células del estrato intermedio. Al parecer cada
célula del estrato intermedio esta relacionada con seis
ameloblastos, a los que coordina en los desplazamientos que estos
efectúan en el proceso de formación de los prismas
del esmalte. El desplazamiento vertical hacia atrás de los
ameloblastos, seria semejante al que realizan también
otras células que forman tejidos duros, tales como los
osteoblastos y los odontoblastos. Sin embargo, los
desplazamientos laterales y, en algunos casos, en torsión
necesarios para formar algunos prismas podrían ser
únicos de los ameloblastos. Los ameloblastos
próximos a la cúspide son los primeros que alcanzan
la máxima diferenciación secretora para sintetizar
y segregar las proteínas especificas de la matriz del
esmalte.
La maduración se produce después de
haberse formado la mayor parte del espesor de la matriz del
esmalte en el área oclusal o incisal (en las partes
cervicales de la corona, la formación de la matriz
del esmalte todavía continua). En esta etapa los
ameloblastos reducen ligeramente su tamaño, aumentan
su diámetro transversal y su Complejo de Golgi y su
RER disminuye de volumen. Las mitocondrias se sitúan
en el polo apical y el numero de lisosomas y autofagosomas,
con un contenido semejante al de la matriz organiza del
esmalte, aumentan considerablemente. El proceso de Tomes
desaparece y en el polo apical surgen microvellosidades e
invaginaciones tubulares a las del osteoclasto.La presencia de estas estructuras demuestra que en
esta etapa las células tienen capacidad absortiva lo
que les permite participar eliminando agua y matriz
orgánica del esmalte.La eliminación del componente
orgánico facilita espacio para que se incremente el
porcentaje de componente inorgánico y se vaya
configurando el esmalte maduro. En esta etapa,
además de la reabsorción se ha comprobado que
disminuye, aunque no de forma completa, la
producción de las proteínas del esmalte. El
ameloblasto en esta etapa sintetiza abundante ATPasa
dependiente del calcio y numerosas enzimas lisosomicas y
progresivamente fosfatasa alcalina. El pH
existente en la matriz, junto al polo apical cuando la
acidez alcanza un determinado limite y puede
desmineralizarse los cristales de esmalte que se
están formando. Se ha sugerido que el contacto con
altas concentraciones de flúor podría
acidificar este micromedioambiente.En la fase de transición entre la etapa
secretora y la de maduración se ha demostrado que
muere el 25% de la población ameloblastica y durante la
etapa de maduración lo hace el otro 255. El resto de
las células (50%) debe ocupar el espacio previo
existente y de ahí el carácter mas aplanado
que presenta la morfología de los
ameloblastos.- Etapa de Maduración
Cuando el esmalte depositado se ha mineralizado en
su totalidad, el ameloblasto entra en su estado
de regresión. Los ameloblastos dejan de estar
organizados en una capa definida, ya no pueden distinguirse
de las células del estrato intermedio y, en
consecuencia, se fusionan con el resto de las capas del
órgano del esmalte. En los ameloblastos las
organelas disminuyen de volumen y el Complejo de Golgi
vuelve a su posición inicial en el polo basal, junto
a las células del estrato intermedio. Estos estratos
celulares no distinguibles constituirán, finalmente,
una capa estratificada denominada epitelio reducido del
esmalte o epitelio dentario reducido, cuya función
es la de proteger el esmalte maduro, separándolo del
tejido conectivo hasta la erupción del elemento
dentario. El ultimo producto de secreción de los
ameloblastos es la llamada cutícula primaria o
membrana de Nasmyth. - Periodo de Protección
- Etapa Desmolitica
El epitelio reducido del esmalte e induce la atrofia del
tejido conectivo que lo separa del epitelio bucal, de este modo
pueden fusionarse ambos epitelio. Las células del epitelio
dentario elaboran enzimas que destruyen el tejido conectivo por
desmólisis.
Si se produce una degeneración prematura del
epitelio reducido puede no haber erupción.
3.2.2 Tipos de Amelogénesis
Imperfecta
Las alteraciones que afectan a la formación del
esmalte pueden ser de origen genético o de origen
medioambiental dado que el ameloblasto es una célula muy
sensible a los cambios de su entorno. Los defectos pueden afectar
solo a una pequeña área de la superficie del
esmalte o, por el contrario, a todo el espesor del mismo. De
forma similar la alteración puede ser localizada afectando
a uno o dos dientes o generalizada afectando a muchas piezas
dentarías o incluso a toda la dentición. Los
defectos pueden ser, además, simétricos o
asimétricos respecto de la línea media de
dentición.
De entre los procesos arriba indicados aquellos que
cursan con un cuadro febril importante, como por ejemplo la
fiebre tifoidea, dan lugar a bandas mal formadas en la superficie
del esmalte que se originan durante el proceso de
amelogénesis. La administración de tetraciclinas puede dar
un origen a una banda de pigmentación gris o incluso a una
pigmentación total de la estructura del esmalte. Ello se
debe a la incorporación del antibiótico a los
tejidos que se están mineralizando.
La exposición
aguda o crónica al flúor en dientes en desarrollo
origina alteraciones importantes en la amelogénesis. Al
parecer el mecanismo es la degradación alterada de la
amelogenina por las proteasas en la fase de maduración y
formación del esmalte. Esto da origen a la
retención de la amelogenina y a la formación de
áreas de esmalte irregular.
Estructuralmente se observa una capa hipermineralizada
externa y una capa hipomineralizada ubicada mas internamente en
el esmalte. Desde el punto de vista clínico se observa un
esmalte moteado que aunque poco estético es resistente a
la caries al estar constituido los cristales por
fluorapatita.
En relación con las alteraciones genéticas
que conducen a la amelogénesis imperfecta se acepta que
esta denominación debe quedar restringida a defectos
congenicos que afecten solo a la formación del esmalte
(alteración de la amelogénesis no sindromica), y no
a aquellas alteraciones en la formación del esmalte que
acompañan a otros defectos metabólicos y
morfológicos presentes en otros sistemas corporales
(alteraciones de la amelogénesis sindromica).
No debe olvidarse que como el esmalte es de origen
ectodermico la alteración de su formación puede
acompañar a la alteración de otros derivados
ectodermicos, como el pelo, las uñas, la piel, etc. De
acuerdo con criterios clínicos y radiograficos se
distinguen tres grandes grupos en la
amelogénesis imperfecta: el tipo hipoplasico, en el que
existe una reducción cuantitativa del esmalte, pero con
una buena mineralización, el tipo hipocalcificado, en el
que existe una mineralización defectuosa, pero el volumen
adamantino es prácticamente normal y el tipo hipomaduro,
en el que se desarrollan distintas alteraciones en la
configuración de los prismas durante las ultimas etapas
del proceso de mineralización.
Entre los complejos sindromicos en los que existen
alteración en la formación del esmalte se
encuentran los síndromes de Aarskog y de Goltz cuya
transmisión hereditaria esta ligada al cromosoma X y el
síndrome Trico-dento-óseo cuya transmisión
es autosomica dominante.
La diferenciación hacia ameloblastos de algunas
zonas aisladas del epitelio radicular de Hertwig dan lugar a la
formación de nódulos de esmalte de 1 a 2 mm de
diámetro en las raíces. Dichas formas denominadas
perlas adamantinas o del esmalte se encuentran con mayor
frecuencia en las zonas de bifurcación de las
raíces de los molares permanentes.
3.2.2.1 Tipo Hipoplasico
La herencia
autosomica dominante, elabora en algunos casos por tratarse de
herencia dominante ligada a X.
Apesar de que la matriz es defectuosa, la
calcificación se establece correctamente.
El esmalte es irregular, delgado y con depresiones, mas
presenta dureza y absorbencia normal.
3.2.2.2 Superficie Irregular – Alteración de
Corona
El tipo dominante ligado a X es inusitado, visto que los
dientes de sexo masculino
tienen poco esmalte, o volumen como la corona se reduzca a la
dentina.
El sexo femenino
tiene una espesura de esmalte normal, con fisuras y surcos
verticales .
3.2.2.3 Tipo Hipoplásico
Características los dientes:
- Esmalte muy duro y fino.
- Dientes pequeños y con superficie
áspera. - Incisivo de forma cuadrada
Presentan:
- Abrasión en los dientes superiores
- Dientes opacos, mas con ligera variación de
color, común en los caninos.
No presentan:
- Dientes con bandas verticales de esmalte opaco
alternado con esmalte de m
coloración normal y
translúcido. - Esmalte uniformemente liso y duro, con ondulaciones
sutiles en su superficie. - Grande cantidades de matriz de esmalte poco
calcificada.
los cristales de esmalte no maduran .
El esmalte es afectado es el menos duro o esmalte de
Hipocalcificación.
La coloración varia de blanco a marrón
(malteado).
Esmalte es mas fino que lo normal.
Herencia recesiva ligada a X que afecta ambas
denticiones.
3.2.2.4 La Hipomineralización
Puede ser por herencia autosomica o recesiva.
El esmalte se forma en cantidades normales, una vez que
no existe defecto en la matriz.
El diente presenta consistencia de gris, mole y
opaco.
El esmalte se desprende de los dientes recién que
erupcionan rápidamente, dejando la dentina completamente
expuesta al contacto generando un alto grado de
sensibilidad.
Los dientes no presentan brillo.
Se afecta tanto la dentición temporal como la
permanente.
Las radiografías demostraron que la dentina es
mas radiopaca que el esmalte.
Este tipo de amelogénesis es causada
probablemente por una alteración del gene responsable de
la formación de la matriz de la dentina, impidiendo la
iniciación de procesos de calcificación
normal.
Sexo masculino: son lo mas afectados, presentando
dientes blanco – amartelados, que se oscurecen por la
absorción de pigmento.
Dientes frágiles con mucha
abrasión.
3.2.3 Microscopia Electrónica de la
Amelogénesis
En el estadio tardío de corona del desarrollo
dentario la mayoría de las características
microscópicas de la amelogénesis puedan verse en un
solo corte. Así, en la región del borde cervical,
las células cilíndricas cortas del epitelio dental
interno pueden identificarse claramente, apoyadas por una
membrana basal que las separa de la zona acelular de la papila
dental. Estas células poseen un alto contenido de
glucógeno. Periféricamente, respecto del epitelio
dental interno, se ubica el estrato intermedio, el
retículo estrellado y el epitelio dental externo, este
ultimo formando una barrera epitelial a los vasos
sanguíneos que tapizan la periferia del órgano
dental. El estrato intermedio se halla solo en relación
con el epitelio dental interno durante el desarrollo de la corona
(no existe en la vaina radicular). Sus células, que poseen
alta actividad de fosfatasa alcalina, deberían
considerarse junto con los ameloblastos como una sola unidad
funcional para la producción del esmalte.
A medida que el epitelio dental interno se localiza
coronalmente en un germen dentario en estadio de corona, sus
células se hacen cilíndricas altas y sus
núcleos se alinean en el extremo proximal de las
células adyacentes al estrato intermedio. En esta
región la zona acelular de la papila dental se ve que ha
ido desapareciendo a medida que los odontoblastos se han
diferenciado y comenzado la secreción de dentina.
Inmediatamente después de la formación de dentina
ha comenzado, hay una serie de cambios morfológicos
distintivos y casi simultáneos asociados con el comienzo
de la formación del esmalte, que tienen lugar en el
órgano dental. Las células del epitelio dental
interno, ahora llamadas ameloblastos, comienzan a segregar matriz
del esmalte, la cual se puede identificar fácilmente como
una capa intensamente teñida en cortes teñidos de
hematoxilina eosina. A medida que se forma este primer incremento
del esmalte, los ameloblastos comienzan a alejarse de la
superficie de la dentina, y enseguida cada célula forma
una proyección cónica corta. Estas proyecciones,
llamadas procesos de Tomes, entran en el esmalte recientemente
formado, dándole a la unión entre el esmalte y los
ameloblastos un aspecto de serrucho.
En este momento el órgano dental se colapsa. El
volumen, junto a la migración
hacia la periferia de los ameloblastos, hace que los vasos
sanguíneos se sitúen mas cerca de los ameloblastos
en el folículo dental. Esta nueva fuente de
irrigación de los ameloblastos desde folículo
dental, de la que había sido privada por la
formación de dentina. Se piensa que durante la
transición en el aporte nutritivo, los ameloblastos
dependen de su contenido de glucógeno.
A medida que prosigue la formación de la matriz
del esmalte, las células del epitelio dental externo, el
retículo estrellado y el estrato intermedio pierden
gradualmente sus identidades y forman una capa escamosa adyacente
a los ameloblastos. Con la terminación de la
formación de la matriz del esmalte, los ameloblastos se
acortan ligeramente, pierden los procesos de Tomes, y se implican
en la maduración de la matriz del esmalte. Una vez que la
maduración se ha completado, la capa ameloblastica
interna, junto con el epitelio estratificado adyacente (derivado
del estrato intermedio del retículo estrellado y del
epitelio dental externo) constituyen el epitelio dental reducido
(o epitelio reducido del órgano del esmalte) que cubre el
esmalte recientemente formado. Este epitelio es inactivo, pero
posee una función protectora. Si hay en él una
ruptura prematura, las células del tejido conectivo se
ponen en contacto con el esmalte y depositan cemento sobre el
esmalte, u ocasionan zonas de reabsorción localizada del
esmalte. En la mayoría de los cortes descalcificados del
esmalte maduro, se puede distinguir poco del tejido debido a que,
a medida que se mineraliza, su componente orgánico se
pierde progresivamente. Solo en el esmalte inmaduro o en el
esmalte muy cuidadosamente desmineralizado hay suficiente
material orgánico presente como para revelar
histologicamente la
organización estructural de este tejido.
4. ARTICULOS INVESTIGATIVOS
4.1 ENAMELISINA (MATRIZ METALLOPROTEINASA – 20)
LOCALIZACION EN LOS DIENTES EN DESARROLLO Y EFECTOS DEL pH Y DEL
CALCIO SOBRE LA HIDROLISIS DE LA AMELOGENINA.
Journal Dent
4.1.1 INTRODUCCION :
La amelogénesis es un complejo proceso que
está regulado por el órgano del esmalte . El
mencionado órgano del esmalte consiste en varios tipos de
células , incluidos los ameloblastos , los cuales son
células columnares grandes que permanecen en contacto con
el esmalte durante todo su desarrollo . Los ameloblastos pasan a
través de una serie definida de alteraciones
morfológicas conocidas como etapas de desarrollo de
diferenciación , secreción , transición y
maduración . Durante la etapa secretoria , los
ameloblastos , sintetizan y segregan proteínas de la
matriz del esmalte mientras se forman cintas de esmalte mineral .
Es durante esta etapa que la matriz del esmalte mantiene un pH
neutral el cual se ha medido entre pH 7.0 y pH 7.4 . El mineral
del esmalte es muy similar a la hidroxiapatita Ca3OH(PO4) , pero
también contiene bajos porcentajes de carbonato , sodio y
magnesio . Cada etapa sucesiva de desarrollo está asociada
con una disminución progresiva en el contenido de
proteínas del esmalte en formación y con un
incremento relacionado en su contenido mineral . El esmalte
completamente maduro tiene mas del 95% de su peso de contenido
mineral . Entonces , el esmalte en desarrollo es tejido
dinámico que empieza desde un material blando (como queso)
antes de lograr su completa maduración en la forma de un
tejido duro .
La amelogenina es la proteína mas
abundante presente en el tejido en formación , y su
secuencia aminoácida esta altamente conservada en las
especies mamíferas .
La amelogenina es hidrolizada por enzimas que
están presentes dentro del esmalte en formación .
El polipeptido de longitud completa está restringido
dentro de 40 m de la superficie del esmalte en desarrollo
, en tanto que los productos del
desdoblamiento proteolítico se observan atraves de todas
las capas del esmalte . Los productos de
desdoblamiento de la amelogenina tienen propiedades
bioquímicas diferentes de aquellas de las proteínas
intactas tales como una menor solubilidad y una afinidad
disminuida con los cristales de hidroxiapatita . Esto sugiere que
la función de la amelogenina intacta es separada y
distinta de los dos productos de desdoblamiento . La
localización de la amelogenina intacta relacionado
con la capa superficial del esmalte es corroborada por resultados
que muestran que la amelogenina hidroliza
proteínasas en cuestión de horas después de
su secreción entre la matriz del esmalte.
Los resultados de estudios inhibidores han clasificado
las enzimas presentes en el esmalte en desarrollo como una serie
de proteinasas , y metalloproteinasas . Una matriz
metalloproteinasa única (MMP) llamada enamelisina fue
clonada del órgano del esmalte de los porcinos . Y
recientemente , el homologo enamelisina humana (MMP – 20) fue
clonado de la papila dental . La familia MMP
está caracterizada por una estructura de dominio
común que incluye una señal péptida , un
propetido y un dominio
catalítico conteniendo un sitio para unión de zinc
. Excepto para matrilysina , la cual es la mas pequeña de
las MMP , las metalloproteinasas de la matriz contienen un
dominio como – hemopexin COOH- terminal . Las gelatinases y
membranas tipo MMPs contienen secuencias adicionales . MMPs se
hace catalíticamente activo en presencia de calcio luego
de la remoción de los propetidos . Las MMPs juegan un
importante papel en la remodelación y desarrollo del
tejido normal y están activas durante la
cicatrización de las heridas , involución uterina y
mamaria , angiogénesis y remodelación ósea
.
Si bien la enamelisina tiene un Mr que es similar al de
las stromelisinas y colagenasas , no es miembro de ninguna de
estas dos clases de MMPs . La enamelisina no contiene sitios de
glicosalacion N vinculados y su transcripción hasta ahora
se ha encontrado solo en tejidos asociados con dientes en
desarrollo . La enamelisina está regulada por el
desarrollo y su transcripción se ha identificado tanto en
el órgano del esmalte como en tejidos de la papila dental
de los dientes en desarrollo de los porcinos . Aquí
nosotros identificamos tres tipos de células responsables
de reproducir transcripción de la enamelisina y
demostramos que primera vez que la enzima esta presente dentro de
los dientes en desarrollo . Adicionalmente , caracterizamos la
relativa capacidad de la enamelisina recombinante (rMMP – 20)
para hidrolizar la amelogenina recombinante bajo
condiciones de variados pHs y concentraciones de iones calcio
.
4.1.2 MATERIALES Y METODOS
Hibridación In Situ.
Un fragmento 238 – bp cDNA codificando una
porción dominio como – hemopexin enamelisina del porcino
fue clonada en el vector pCR – Script SK y fue mineralizado con
las enzimas de restricción apropiadas para la
producción sense y antisense . Un molar M2 de un cerdo de
seis meses fue fijado con paraformaldehido al 4% en una
solución salina fosfato amortiguada de pH 7,0 y
descalcificado con EDTA al 10% a un pH de 8,0 . El molar fue
embebido en parafina y se prepararon secciones de 5,0 – m
. Después de la desparafinación , los
especímenes fueron tratados con
proteinasa K (10 – m / mL) durante 15 minutos a la
temperatura
ambiente y la
fosfatasa alcalina endógena fue inactivada mediante la
adición de 0,2 N de HCl . Las secciones de los tejidos
fueron hidrizadas con una solución conteniendo formamina
50% , 10 mM Tris – HCl (pH 7,6) , 200 – m / mL tRNA , 1 x
solución Denhardt , 10% dextran sulfato , 600 nM NaCl ,
0,25% SDS y 1 nM EDTA a 50°c durante 16 horas en una
cámara humificadora . Los especímenes fueron
lavados en 2 x SSC conteniendo formamide 50% y 55 grados
centígrados durante 30 minutos y luego enjuagados a
47°c durante 10 minutos en TNE 10 mM Tris – HCl , pH 8,0 ,
500 mM NaCl , 1 nM EDTA , Transcripciones no hibridizadas fueron
digestadas con 20 m/ mL. RNAse A en TNE a 37°c
durante 30 minutos . Nuevamente lavados en TNE a 37°c durante
10 minutos una vez con 2x SSC a 50°c durante 20 minutos y
finalmente dos veces con 0,2x SSC a 50°c durante 20 minutos .
Los teñidos de hibridazación in situ se
realizaron por medio del sistema Geniun
Detection . Transcripciones de enamelisina fueron detectadas con
un anticuerpo digoxigenina conjugada para fosfatasa alcalina de
acuerdo a las instrucciones del fabricante .
Western blots y simografia seguida por Western blotting
.
Incisivos sin erupcionar fueron extraídos de las
mandíbulas de porcinos y se raspó una capa
aproximadamente 30 m de esmalte exterior de la superficie
labial de 70 dientes de acuerdo a los métodos previamente
descritos . Aproximadamente una muestra de 60 mg de esmalte fue
disectada y homogenizada en 6 mL de 50 mM solución
amortiguadora carbonatada (pH 10,8) previamente a la
centrifugación . Se recolectó el sobrenadante y se
recentrifugó . Este proceso se repitió tres veces .
Los sobrenadantes fueron conjugados y concentrados a 0,6 mL por
ultrafiltración con una membrana Amicon YM – 3
.
Se produjo antisuero de conejo contra residuos 334 – 348
y 462 – 482 de las secuencias aminoácidas deducidas de
enamelisis como previamente se describió . Cada
péptido fue vinculado a amino – cellulofine para
purificación del antisuero por cromatografía por afinidad.
Western blots fueron realizados por la adición
del esmalte extractadas a un gel con carga amortiguadora (1% SDS
, 1 mM EDTA , 25% glicerol , 0,01 M Tris – HCl ) pH 8,0 el cual
fue entonces cargado con un gel acrilamide . Se realizó la
electroforesis bajo condiciones no reductoras de acuerdo al
método de
Maemmil (1970) . Las proteínas fueron transferidas a
membranas GVHP . Las membranas fueron inmunoteñidas por el
método
complejo biotin – Avidin . Los anticuerpos antipeptidos fueron
usados a concentraciones de 1 m / 10 mL .
La simografia se realizó de acuerdo al
método de Heussen y Dowdle luego de electroforesis y
remoción del SDS , el gel fue incubado durante 30 minutos
en el amortiguador a 37°c . Luego el gel fue
electrotransferido a una membrana GVPH , y la membrana se
sometió a Western blotting con antisuero purificado a
concentraciones de 4,0 m / 10 mL . Después de
electrotransferido , el gel se teñía con Coomassic
Brillant Blue de tal manera que pudiera visualizarse zonas de
actividad proteolítica . No toda la alfa – caseina
transfirió la membrana , entonces bandas negativas
representativas de la degradación de la caseina fueron
visibles luego de coloreado el gel .
4.1.3 INMUNOHISTOQUIMICA.
Marranitos de cerca de 3 kg fueron sometidos a
perfusión con paraformaldehido 4% y glutaraldehido 1% en
solución amortiguadora de fosfato de sodio , pH 7,4 .
Brotes de dientes molares deciduos fueron disectados de
descalcificados con EDTA 10% (pH 7,4) a 4°c durante cerca de
dos semanas . Los especímenes se
lavaron en el amortiguador fosfato , deshidratados en
foramide – dimetilk – NN graduado y embebidos en glicol
metacrilato a -20°c . Se cortaron secciones ultradelgadas ,
montadas sobre una rejilla de níquel y coloreadas con el
método colorante Silver imnunogold .
Expresión bacterial de rMMP – 20 porcino
.
Volúmenes de medio litro NCZYAmp inoculados con
células Azul – XL1 colonizando la expresión
construida fueron creciendo a 37°c en sacudidas orbitales
hasta que el OD a 550 nM alcanzara 1,0 IPTG fue entonces
añadido a una concentración final de 0,1 mM y los
cultivos crecieron por el tiempo de dos horas . Las
células inducidas fueron sometidas a centrifugación
, re – suspendidas en 6 M de guanidina – HCl , y sonicadas ( es
decir sometidas a la energía producida por ondas sonoras ) .
El resultado bacterial fue centrifugado y el sobrenadante pre –
filtrado con un filtro de 0,2 micrones y aplicado a una columna
agarose NTA . La columna se lavó y la enamelisina
recombinante fue removido con el uso de un solvente con 8M de
urea y 100 mm de imidazole.
Simografía de rMMP – 20 con un sustrato
amelogenina recombinante.
La amelogenina recombinante Murine fue purificado
como previamente se ha descrito y co – polimerizado en gel
poliacrilamide 12% conteniendo SDS 0,1 % Enemelisina liofilizada
se mezclo con una muestra amortiguadamente cargada (60 mM Tris –
HCl (pH 8,8) , sucrosa 30% , SDS 7% , 0,02 mg/mL de azul
bromofenol) e incubado a temperatura
ambiente
durante 10 minutos . La electroforesis se realizó a una
corriente constante de 20 mA por gel . Luego de la electroforesis
el gel fue lavado dos veces durante diez minutos en 50 mL de una
solución Tritón X-100 de 2,5% en 100 mM
amortiguador Tris – HCl (pH 8,0) Los geles fueron incubados de 16
a 24 horas a 37°c en 50 mM amortiguador Tris – HCl (pH 8,0)
conteniendo 10 mM CaCl2 . Se colorearon entonces con una
solución Coomassie Brilliant Blue (CBB) R – 250 ( 0,23%
CBB r – 250 , ácido acético 5,8 % y metanol 30% )
por 20 minutos y decolorada con metanol 10% y ácido
acético 10% hasta observar bandas claras de
hidrólisis de amelogenina .
4.1.4 RESULTADOS
Localización de la expresión enamelisina
mRNA..
Nuestra primera meta fue la de identificar los tipos de
células asociados con los dientes que fueron responsables
de la expresión de enamelisina . La hibridación
in situ se realizó en secciones muy delgadas del
molar M2 desmineralizado de un cerdo de seis meses . El molar M2
es el segundo molar porcino según lo definió
Robinson . El esmalte presente sobre el molar unerupcionado
estaba en la ultima etapa secretoria o de transición
temprana de desarrollo . El mensaje enamelisina fue prevalente en
las células ameloblastos del órgano del esmalte
como se observa por la intensa coloración en la prueba RNA
antisense ( figura 1. a ) La perdida perifolicular de tejido
conectivo fue negativa para la expresión enamelisina . El
uso de la prueba RNA senseno mostró una coloración
significativa de las células amelobastos o tejido que las
rodea ( fig 1. b) . Cuando se examinaron células de la
papila dental , la prueba antisense reveló que las
células odontoblastos expresaban fuertemente enamelisina .
( fig 1. c) No se vio ninguna coloración cuando se uso la
prueba sense ( fig 1. d) Entonces las células asociadas a
los dientes a las cuales producen la mayor cantidad de mRNA
amelisina fueron los ameloblastos del órgano del esmalte y
los odontoblastos de la papila dental . Ambos tipos de
células están en contacto con su respectivos
tejidos mineralizantes .
4.1.5 DISCUSION
Usando las pruebas RNA
enamelisina específicas y utilizando antisueros que
detectan enamelisina del porcino , nosotros demostramos por
primera vez que la enamelisina es producido por los ameloblastos
, y que la enamelisina es secretada de los ameloblastos en el
desarrollo del esmalte.
También se demostró que rMMP – 20 logra la
máxima actividad enzimática para un sustrato de
amelogenina recombinante bajo condiciones de elevado
calcio ( 10 mM ) y pH neutral . Aunque la enamelisina humana
previamente había sido clonado , no fue posible obtener la
cantidad de esmalte humano inmaduro necesaria para terminar estos
experimentos .
La alternativa porcina fue la mejor elección , dado que su
esmalte dental está bien descrito. Los resultados de la
hibridación in situ confirmaron resultados
mostrando que el mensaje enamelisina estaba presente en el
órgano del esmalte y en la papila dental de los dientes
porcinos en desarrollo . Estos resultados identificaron los
ameloblastos del órgano del esmalte y los odontoblastos de
la papila dental como las células tipo responsables de la
transcripción de elevados niveles del mensaje enamelisina
. Dado que los ameloblastos están en contacto con el
esmalte en formación , nos preguntamos si la
proteína enamelisina fue secretada en el esmalte en
desarrollo .
Los resultados de las pruebas
Western blor , simografía seguida por Western blotting e
inmunohistoquimicos demostraron que la enamelisina estaba
presente dentro de la capa superficial ( 30 m de
profundidad ) del esmalte secretorio ( fig 2-4 ) Los resultados
inmunohistoquimicos revelaron que la enamelisina estaba
localizado a vesículas secretorias dentro de los
ameloblastos , y , basados en la distribución de la enamelisina dentro del
esmalte en formación , parece que la enamelisina fuera
liberada en la cara secretoria del proceso de Tomes . (fig 4)
.
Dado que la enamelisina no contiene sitios de
glicosilacion N – vinculados , las diferencias entre bandas 46 –
Kda (fig 2) probablemente no fueron debidas a diferencias en
glicosilación .
Aunque no puede descartarse la posibilidad de
glicosilación 0 – vinculada , el Mr predicho del zymogen
fue 51,9 kDa con un punto isoeléctrico (pi) de 8,93 ,
mientras que el Mr predicho para la enamelisina activo fue 42, 5
kDa con un pi de 6,34 . Entonces , el predicho Mr , basado en
traslación conceptual de formas pro y activas de enamelina
están de acuerdo con los resultados Western blot . Es
entonces probable que las bandas 46 – kDa y 41 – kDa de las
figuras 1 y 3 correspondan al zimogen y formas activas de
enamelisina , respectivamente .
El Western blot demuestra también la presencia de
bajas bandas Mr ( figura 3 líneas 2 y 3). Previamente se
demostró colagenasa activa (MMP – 1) para sufrir un
proceso de fragmentación autoproteolíca en
diferentes sitios dentro de la región que conecta el
dominio catalítico con el dominio como – hemopexi . Dado
que ambos antisueros AbS1 y AbS2 fueron elevados contra peptidos
presentes en el dominio como hemopexin de la enamelisina , estas
bajas bandas Mr probablemente representen productos de
desdoblamiento enamelisina terminal COOH resultantes de
autoproteolisis . Esto podría explicar las bajas bandas Mr
observadas sobre los simogramas de las figuras 5 y 6 . Estas
bandas Mr probablemente resulten de un dominio catalítico
rMMP – 20 que ha sido desdoblado como hemopexin terminal COOH
.
Nótese que a diferencia de Western blot y
simogramas de esmalte extraído (figuras 2 y 3) no se
observó doble banda de 46/41 kDa sobre los simogramas que
evaluaban la actividad de rMMP – 20 ( figuras 5 y 6) Las mayores
bandas sobre los simogramas de las figuras 5 y 6 fueron
aproximadamente 55 kDa ,el cual fue el tamaño esperado
para fusión de la proteína rMMP – 20 (pro – rMMP-
20 mas el tag His) El componente SDS del procedimiento
simográfico previamente había demostrado desalojar
el propetido del dominio catalítico , creando una activa
pro – enzima . Nosotros especulamos que se requiere una enzima
diferente y distinta para desdoblar el propectido enamelisina
previamente a su activación in vitro . Entonces ,
esta enzima podría estar presente dentro de la matriz del
esmalte pero podría no estar presente en las preparaciones
rMMP – 20 altamente purificadas.
La amelogenina intacta previamente había
sido localizada dentro del esmalte recientemente formado a una
profundidad de aproximadamente 40 m , mientras que sus
productos de desdoblamiento proteolítico estuvieron
localizados a través del esmalte . Aquí nosotros
demostramos que la enamelisina está también
presente en la cara superficial del esmalte en formación
(fig 4) y puede , por tanto , estar involucrado en el
procesamiento de amelogenina . Si bien la enamelisina
posee una señal peptida , este no fue inmonulocalizado
para el ER (fig 4) . Las vesículas secretorias contienen
una alta concentración de proteínas para secretar .
En contraste , ER contiene niveles bajos y estables de
proteínas recientemente trasladadas . Entonces , las
relativamente bajas concentraciones de enamelisina presentes en
ER pueden explicar porque no pueden detectarse mediante técnicas
inmunohistoquimicas .
Durante el estadio de desarrollo , el esmalte dental ha
demostrado alternar entre un rango de pH de 7,2 a 6,2 . Varias
investigaciones previas han usado simografia para
evaluar los efectos de los diferentes pH´s y
concentraciones del ion calcio sobre la relativa
proteolítica de proteínas extraídas del
esmalte . Se uso la técnica de simografía porque es
sensitiva y porque separa las enzimas de acuerdo a su Mr . Por lo
tanto para comparar nuestros resultados con los de investigaciones
previas nosotros elegimos utilizar la simografía para la
relativa actividad enzimatica de la enamelisina bajo condiciones
de variados pH y concentraciones del ion calcio .
Usando proteínas e inhibidores y simografia ,
Overall y Limeabck (1988) fueron los primeros en mostrar la
presencia de metalloproteinasa (62 a 130 kDa gelatinases) en el
esmalte dental en desarrollo de los porcinos. Desde entonces
Tanabe y otros, caracterizaron una enzima 78/76 kDa con actividad
hidrolitica amelogenina la cual no fue completamente
inhibida por la presencia del quelador calcio EDTA . Moradian y
sus colegas también caracterizaron en 1994 , una
metalloproteinasa EDTA – inhibido 68/62 kDa dele esmalte de
bovino la cual demostró desdoblar la amelogenina .
Entonces varias metalloproteinasas están presentes en el
esmalte en formación , cada una de las cuales posee
diferentes preferencias de substrato y optimo pH . La misma
situación se presenta dentro de la dentina en
formación , dado que varia metalloproteinasas Ca2+
dependientes han sido localizadas dentro de este tejido . Si bien
hasta la fecha no se ha demostrado que la enamelisina esté
presente en la dentina , nosotros ahora sabemos que éste
es transcrito por odontoblastos los cuales están
adyacentes a la dentina en formación.
Nuestros resultados fueron los más consistentes
con los estudios simograficos de Smith y otros (1996) quienes
examinaron proteínas extraídas del esmalte de rata
. Los simogramas mostraron correspondencia con las bandas 46/41
kDa observadas en este estudio (fig 1 línea 1) .
También como se demuestra en el presente estudio (fig 5)
la proteína del esmalte de rata mostró una
actividad caseinolítica que era mayor que su actividad
gelatinolítica . El 46/41 kDa del esmalte de rata parece
estar asociado con una Mr baja de aproximadamente 30 kDa , la
cual también pudo observarse sobre los simogramas para
rMMP – 20 (figuras 5 y 6) .
Concluimos que la enamelisina es secretada por los
ameloblastos entre la matriz del esmalte durante la etapa
secretoria de desarrollo y que el pH neutral de estos tejidos
permite una optima actividad de la enamelisina .
Dado que los odontoblastos de la papila también
expresan altos niveles de enamelisina , nosotros creemos que la
enamelisina puede estar involucrada en el proceso de
formación de la dentina . Entonces , la enamelisina puede
jugar un importante papel en el desarrollo temprano de los
dientes al crear productos de desdoblamiento de proteínas
que son necesarios para una apropiada formación del
esmalte y la dentina.
4.2 LA SUCESIÓN DE LONGITUD LLENA,
LOCALIZACIÓN Y CROMOSOMAL QUE TRAZAN DE
AMELOBLASTOMA
The Journal of Biological Chemistry
El diente mamífero es una estructura
especializada que desarrolla una serie de interacción de
mesenchymal de epithelial recíproca que culmina en la
formación de tres tejidos mineralizados diferentes sin
embargo: esmalte, dentina, y cemento. El diente ha mantenido un
valioso sistema ejemplar
entendiendo regulación del gen específica,
morfogenesis, y mineralización. El esmalte es que un
epitelial oral derivó tejido mineralizado, mientras que la
dentina y cemento son formados por ectomesenchyme cresta derivado
nervioso craneal. Este ectomesenchyme cresta derivado del
nervioso craneal se deriva del neuroectodermo de rhombomere 2 del
hindbrain vertebrado. Como en hueso, la matriz del
premineralizado de dentina y cemento contiene una matriz rica en
colágeno que se mantiene a lo largo del tejido maduro. Sin
embargo, el esmalte difiere de estos otros tejidos del
mineralizer de dos maneras del importan: 1) la matriz de esmalte
epithelio derivada no contiene tipo I de colágeno; y 2) la
matriz orgánica de esmalte está esencialmente
perdida durante la maduración del tejido, produciendo un
tejido que está más de 98% mineral en la forma de
hidroxiapatita.
En la amelogénesis, la formación de
esmalte del diente, es dividido en las fases de desarrollo
discretas. Siguiendo una fase del presecretoria en el cual el
epitelio de esmalte interno recibe señales de desarrollo
del papillae dental, el epitelio de esmalte interno diferencia en
el ameloblasto secretorio. La matriz de esmalte, secretada por el
ameloblasto, está compuesta de dos clases de tipos de la
proteína las amelogeninas y las enamelinas. Las
amelogeninas son proteínas hidrófobas ricas en
prolina, histidina, y ácido del glutamico y comprenden
aproximadamente 90% de la matriz de esmalte es debido al RNA
mensajero.
El siguiendo 10% de la matriz de esmalte se compone de
enamelinas agrio y otro no las proteínas de las
amelogeninas como amelogeninasa. Una vez el espesor lleno de
matriz de esmalte se forma, los morfological significantes y los
cambios funcionales ocurren dentro del ameloblasto cuando
atraviesa la transición, maduración, y las fases
proteccionista de desarrollo. Así, el diente en
vías de desarrollo es un único órgano
mineralizando y proporciona un sistema de desarrollo
interesante.
Aunque unos dientes que se han identificado genes
específicos, no se definen bien los mecanismos precisos
del morfogenesis del diente, mineralización y el
patofisiologia de esmalte heredado y defectos deala dentina.
Nosotros hemos comenzado un proyecto del
genome por consiguiente con una última meta de identificar
nuevos genes involucrada en formación del diente que puede
ayudar explique los mecanismos de odontogenesis. Nosotros
escogimos usar el incisivo de la rata continuamente haciendo
erupción como un sistema ejemplar, porque la
sucesión de desarrollo completa de odontogenesis puede
analizarse en un solo diente. Como un acercamiento inicial,
nosotros construimos una biblioteca del
cDNA unidireccional que no calcificó la porción de
incisivo de 3 ratas viejas en 4 semana, clones de la secuencia, y
clasificó sucesiones
basadas en su homologia para saber genes. Un clon determinado
Y224 era el gen de la novela
más abundante expresado y era parcialmente
sucesión. Aquí, nosotros informamos el
secuencializacion de longitud lleno, célula la
expresión específica, y paterno de
localización de proteína de un ameloblasto
recientemente descritos gen específico que nosotros hemos
designado ameloblastina.
4.2.1 PROCEDIMIENTOS
EXPERIMENTALES
Sucesión de ADN análisis ambas cuerdas de la inicial Y224
inserción del cDNA sea secuencializada por el
dideoxynucleotido encadene método de la terminación
que usa la versión del secuenciador 2.0 ADN
(Aplicó Biosystems, modele 370A). Se sintetizaron
cebadores del olionucleotido específicos en un biosistemas
aplicados modele 380B sintetizador de ADN.
La proteína de Recombinante y producción
del anticuerpo. Una proteína del recombinante fue hecha
por subclonacion de un fragmento de Y224 que corresponde a +613 a
+1134 pares de la base en un vector de la expresión que
pone en código
seis residuos del histidina en el término de N de la
proteína del recombinante (pQE30, Qiagen). El plasma del
recombinante (pKQE-17) se transformó en competente
M15(pREP4) las células y la proteína eran inducido
con isopropyl-b
-s
-thiogalactopyranoside. La proteína del recombinate
que usó se purificó un
níquel-nitrilotriacetic ácido-agarose la columna de
afinidad (Qiagen).
Se hicieron anticuerpos de Polyclonal contra pKQE-17
usando procedimientos normales. Nueva Zelanda se inocularon
conejos Blancos con 500 ug de pKQE-17 en un volumen igual de
adjuvant de Freund´sincomplete (Duncroft Inc.). Se
realizó el aislamiento de IgG de suero usando una
proteína Un-agarose la columna (la Affi-gel TRAZA II,
Bio-Rad).
las sondas usaron para la Hibridación del situ.
El Y224 clon era linearized por BamHI y Xhol para el antisense y
producción de sonda de sentido, respectivamente.
Digoxigenin-UTP-etiquetado, solo-strandantisense y sentido que
las sondas de ARN fueron preparadas por T7 polymerase de ARN y T3
polymerase de ARN, respectivamente, usando un ARN que etiqueta
equipo (Boehringer Mannheim).
En hybridation del Situ.
Para en hybridation del situ, se anestesiaron 3-4 ratas
del sprague-dawley semana-viejas con hydrochloride del ketamine
(sigman) y perfused con 4% el paraformalaldehyde en
fosfato-buffered salino (pH 7.0) a través del ventricule
izquierdo, se cortaron mandíbulas, incluso los incisivo, y
decalcified en 10% EDTA (pH 8.0) durante 10 días y
empotró en parafina. En hybridation del situ el perfomed
estaba en 5 secciones del um. La hibridación de secciones
del tejido era perfomed en un hybridizationsolution (50% el
formamide, 10 mm Tris HCl (pH 7.6), 200 tRNA del ug/ml, 1 * la
solución de Denhardt´s, 10%dextran sulfato, 600 mm
NaCl, 0,25% SDS, y 1 mm EDTA)at 50 C para 16 h en una
cámara humedecida. Se lavaron diapositivas secuencialmente
en 2 * SSC que contiene 50% el formamide a 55 C para 30 min y
entonces enjuagó a 37 C para 10 min en TNE (10 tRIS del mm
HCl (pH 8.0), 500 mm NaCl, 1 mm EDTA. Se digirieron
transcripciones de Unhybridized con 20 ug/ml RNase UN (Sigma) en
TNE a 37 C para 30 min. Las diapositivas se lavaron agan en TNE a
37 C para 10 min, una vez con 2 * SSC a 50 C para 20 min y
finalmente dos veces con 0.2 * SSC a 50 C para 20 min. Se
descubrieron transcripciones específicas con anticuerpo
del phosphatase alcalino anti-digoxigenin-conjugado (Boehringer
Mannheim).
4.2.2 MÉTODOS DE
IMMUNOHISTOQUIMICA
Las secciones de parafina eran deparafinized y
hidrataron antes del inactivation de peroxidases endógeno
adiós 3% el peróxido de hidrógeno para 10
min. Las secciones se bloquearon con suero de la cabra normal, y
el immunolabeling de la tres-capa fue realizado. Para el
immunolabeling, un antígeno afinidad-purificó que
anticuerpo mono-específico levantado contra la pKQE-17
proteína del recombinant fue usado. las secciones se
incubaron con un biotinylated que el anticuerpo secundario
seguido por streptoavidin-peroxidase. Inmunolocalization fue
visualizado por diaminobenzidine (HistoMark, Kirkegaard y
laboratorios de Perry). Como un mando negativo, el anticuerpo
contra pKQE-17 era preabsorbed con la proteína de
fusión y se usó en el mismo procedimiento del
immunostaining descrito anteriormente.
4.2.3 AISLAMIENTO DE ARN Y ANÁLISIS
Total que RNAfue extraido de tejidos que usan un
método del ácido-guanidinium-phenol-cloroformo. Se
guardaron pelotillas de ARN a -80 C hasta analizó. Diez
micrograms de ARN total estaban separados en un 1% el agarose, 1
m formaldehído gel y transferido por acción del
capilar a las membranas de Nilón (Magna Nt, Separaciones
de la Micra Inc.). Un cDNA de cuerpo entero (Y224) la sonda se
etiquetó dCTP por un método del oligonucleotide
azar-imprimado y se hizo híbrido a 42 C.
4.2.4 MAPA CROMOSOMAL DEL GEN DE
AMELOBLASTINO DE RATÓN
El gen del ameloblastin fue trazado por análisis
de dos pone cruces del multilocus: (NFS/N o C58/J * el Mus
musculus musculus) * M, m. musculus y (NFS/N * el spretus del
mus) * spretus de M. o C58/J. Se han tecleado DNAs de estos
croses para más de 850 sitios, incluso el cromosoma 5
Equipo de los sitios (oncogene del equipo), Afp (un-fetoprotein),
Ibsp (sialoprotein del hueso), y Pdeb (phophodiesterase B) como
describió previamente. Se guardan datos de estas
cruces y se analizan usando el SITIO del programa
desarrollado por C. C. Buckler (Narional Institutes de Salud, Bethesda,
MD).
4.2.5 RESULTADO
Nosotros construimos una biblioteca del
cDNA unidireccional previamente de los tejidos no-calcificados de
incisivo de la rata y parcialmente el sequenced la 5
porción de las cuerdas codificando de aproximadamente 400
clones al azar seleccionados. El homology de la sucesión
investiga a través de la base de datos de
GenBank y PIR proteína base de datos
reveladas que la mayoría de los clones (aproximadamente
56%) representó genes previamente no identificados. Para
identificar nuevos genes involucrados en desarrollo del diente
que nosotros hemos enfocado primero frecuentemente en el mos
expresados genes de esto la población del cDNA previamente
no identificada.
4.2.6 EXPRESIÓN TEJIDO-ESPECÍFICA DE
Y224.
El análisis del borrón norteño de
ARN total extrajo del bazo de las ratas, rompa la cabeza, mire,
la glándula salival, corazón,
thymus, pulmón, kidneu, y incisivo revelaron ese mRNA para
Y224 fue descubierto por análisis del borrón
Norteño en otros tejidos mineralizados como boone y
cartílago (datos no
mostrados). Se identificaron dos transcripciones a
aproximadamente 2.0 y 1.6 kg. Un modelo
restringido idéntico de expresión del mRNA se
observó en tejidos del ratón.
Localización de Y224 que usa en
Hibridación del Situ.
Nosotros examinamos el modelo de la
expresión de clon que Y224 mRNA se limitó a la capa
de célula de ameloblast. Se observaron niveles
especialmente altos de expresión en el citoplasma del
distal de ameloblast secretorio. El incisivo del ratón
mostró expresión idéntica que usa el
antisense de la rata la sonda de ARN (datos no mostrados).
Subsecuentemente en hibridación del situ mostrado niveles
altos de expresión de Y224 en ambos en células del
linaje del ameloblast, nosotros nombramos su ameloblastin de
producto de gen y más allá caracterizamos el cDNA y
estudió la localización de su producto.
4.3 INTERACCIONES PROTEINA – A – PROTEINA :
CRITERIOS DEFINIENDO LA ORGANIZACION DE LA MATRIZ ORGANICA DEL
ESMALTE.
Journal dent
4.3.1 INTRODUCCION
El entendimiento o la comprensión del papel
fundamental de las proteínas del esmalte durante la
biomineralización de éste , es una meta avaramente
buscada . El esmalte se forma de modo completamente extracelular
, coincidiendo con la remoción de sus proteínas , y
con su remplazo por cristales de hidroxiapatita carbonatada . La
organización de la matriz orgánica del esmalte , su
desorganización por las proteasas y el crecimiento de la
fase mineral a expensas de la fase orgánica implican que
la formación del esmalte es un fenómeno
biológico extremadamente complejo el cual opera como
consecuencia de mecanismos de control
sincronizados y estrechamente regulados .
Hasta la fecha , un papel esencialmente
fisiológico para una proteína del esmalte durante
su formación se ha demostrado solamente para la
amelogenina . En el caso de la amelogenina , los
humanos afectados por un defecto hereditario del esmalte conocido
como amelogenesis imperfecta presentan un defecto en el
gel amelogenina localizado en el cromosoma – X . De este
defecto resulta la expresión reducida o eliminada de la
amelogenina , proporcionando un enlace genético
para la amelogenina como un componente esencial de la
matriz del esmalte . Así mismo experimentalmente se han
demostrado defectos similares en la formación del esmalte
en animales cuando
los niveles de la proteína amelogenina son
dramáticamente reducidos cuando el mensajero amelogenin
RNA fue tomado como objetivo para
el desdoblamiento por medio de ribozomas cabeza de martillo ,
corroborando entonces el papel requerido para las
proteínas amelogeninas durante la
organización de la matriz.
La ameloblastina , conocidas también como
amelinas o sheathlin , es una proteína extracelular que se
expresa en niveles elevados de ameloblastos secretorios y pos
secretorios . Todavía no se conoce el papel preciso de la
ameloblastina durante la formación de la matriz
orgánica del esmalte. Estudios realizados por Mac Dougall
y sus colegas han implicado un papel esencial a la ameloblastina
durante la formación del esmalte en experimentos de mapeo
genético los cuales colocan la gel ameloblastina en la
región critica de forma autosomal – dominantes de
amelogenesis imperfecta . Experimentos de
hidrización in situ localizan también al
mensajero ameloblastin RNA para células epiteliales
adyacentes a la superficie de la dentina recientemente depositada
a lo largo del tronco de la raíz y para células
enclavadas en el cemento celular . Hace ya algunas décadas
, Slavkin y Boyde (1974) propusieron un origen epitelial para el
cemento , y con el clonamiento de ameloblastinas , sus
predicaciones de productos del gen epitelial dentro del cemento
han sido comprobados . Adicionalmente a su papel en la
formación del esmalte , identificación de la
expresión ameloblastina durante la cementogenesis sugiere
que este puede ser también un gen candidato para formas
heredadas de disturbios en la diferenciación del
cemento.
Hasta la fecha no se ha probado de manera concluyente el
papel esencial del tuftelin en la formación de la matriz
orgánica del esmalte . El gen tuftelin o de la tuftelina ,
es altamente conservado a través de la evolución vertebrada . La tuftelina
permanece fuertemente implicado en la formación del
esmalte normal y en la pantogenesis de defectos del esmalte en
virtud de las características físicas y
químicas de esta macromolécula acídica y su
papel potencial en indicar la formación de
cristales.
El esmalte se forma completamente extracelular,
implicando que los constituyentes proteínicos del esmalte
deberán ser capaces de organizarse en una matriz
proteínica orgánica competente que dirija su
remplazo por la fase inorgánica . Las
características y las propiedades físicas y
químicas de la matriz extracelular del esmalte han sido
conocidas durante largo tiempo . Las recientes técnicas de
biología
molecular que ahora disponemos nos han proporcionado herramientas
experimentales para su ilustración . Por ejemplo , el soporte
experimental para la auto – organización de las
proteínas del esmalte proviene de los experimentos in
vitro en los cuales se ha demostrado que la
amelogenina M180 bacterialmente expresado altamente
purificado se organiza en estructuras que parecen nanosferas . La
corrobación del concepto de nanosferas generadas in
vitro proviene de la observación que también pueden
observarse estructuras nanosféricas ( microscópicas
) durante la formación in vitro del esmalte. En
1989, Fields y Song publicaron un método , referente a al
sistema híbrido ;dos levaduras , para examinar
interacciones proteína – proteína en levaduras
eucarióticas huésped . Este método usa
actividad - galactosidasa para indicar la avidez
de interacción entre dos proteínas y han sido
ampliamente utilizado para identificar interacciones
proteína – proteína ocurridas bien dentro del
núcleo o bien dentro del citoplasma de la célula .
Nosotros razonamos que el ensayo de
dos híbridos podría a su vez ser una herramienta
valiosa para estudiar las propiedades de la organización
de la matriz extracelular por las proteínas del esmalte .
Nuestros hallazgos se relacionan con las propiedades de
organización proteína – esmalte para posibles
papeles de la amelogenina ,tutfelin y ameloblastina
durante la formación del esmalte . Estos resultados no
proporcionan funciones
especificas para ninguna de las proteínas conocidas del
esmalte , si no más bien nos proporcionan evidencia in
vitro de que existen limitaciones a las interacciones
proteína – proteína que definen la
organización de la matriz extracelular del esmalte
.
Los resultados del presente estudio sugieren que la
capacidad de amelogenina y tuftelin para dirigir su propia
organización extracelular durante la
biomineralización del esmalte es una importante etapa en
la producción orgánica competente ,que dirija su
remplazo por la fase mineral.
4.3.2 MATERIALES Y METODOS.
Construcción de plasmido.
En otro articulo , se publicó una completa
explicación del ensayo
híbridos – dos levaduras y del plasmido madre ( pPC97 y
pPC86 ) usados en este estudio . Brevemente , el pPC86 el GAL4
plasmido dominio activado. Los polivínculos del pPC97 y
pPC86 son idénticos . La completa región codificada
de amelogenina y una isoforma de la amelogenina ,la
proteína amelogenina rica en leucina o LRAP o
tuftelin o ameloblastina fueron amplificadas de un plasmido por
métodos estándares y clonados en el plasmido pPC97
y pPC86, como se describió en el mencionado
artículo.
Los primers para la amelogenina amplifican el
cDNA correspondiente a los aminoácidos de 1 a 180 ( M180 )
y aminoácidos de 1 a 59 ( LRAP ) .Primers para tuftelin
amplificada en cDNA correspondiente a aminoácidos de 1 a
139 y primers para ameloblastina amplifican el cDNA
correspondiente a aminoácidos desde 1 hasta 422 ( incluida
señal péptida ) o aminoácidos de 27 a 422 (
excluida señal péptida ) . El pre – pro líder
de la amelogenina se ha omitido en este estudio en tanto
que la señal de secuencia péptida de ameloblastina
( aminoácidos de 1 a 26 ) si se incluyo en este estudio .
Los oligonucleotidos usados para PCR contienen sitios de
restricción que permiten un ambiente eficiente para sub
clonación del FNA generado ( tabla 1 ) .
Nosotros obtuvimos DNA a lo largo de los sitios de clonación de cada plasmido para confirmar
la correcta orientación y armazón del inserto cDNA
.
Tabla 1. Oligonucleotidos usados para la
construcción de GAL4 híbrido
plasmido conteniendo las proteínas de la matriz del
esmalte.
————————————————————————————————–
Amelogenin forward primer (Bam HI) Amelogenin Reverse primer (Sac I) Tuftelin Forwat primer (Bam I) Tuftelin Reverse primer (Sac I) Ameloblastin forwad primer (Sal I) Ameloblastin forwad primer (Bgl II) Ameloblastin reverse primer (Aat II) | TTCGGATCCCT.ATGCCCCTACCACCTa TTAGAGCTCTTAATCCACTTCTTC TTCGGATCCCC.ATGGTGTCCAGCCACTCA TTAGAGCTCTAGTCCTCTGTCTGCC GAGGTCGACA.ATGTCAGCATCTAAG TTCAGATCTCC.GTGCCGGATTTCCT TAAGACGTCAGGGCTCTTGGAA |
——————————————————————————————–
los sitios de restricción se subrayan , y un
período indica el comenzar de la sucesión
codificada.
La amelogenina , LRAP y tuftelin DNA fueron
clonados entre el sitio Bgl II/Sac de cada vector híbrido
y la ameloblastina DNA fueron clonados entre el sitio Sal 1 / Aat
II ( señal peptida incluida ) del vector pPC86. Plasmidos
híbridos positivos para antígenos – T p53 y SV40
fueron comparados a stratagene ( La jolia, USA) y los plasmidos
híbridos para H-ras y CDC 25 fueron proporcionados por los
doctores D Broeck y R Mosteller de la Universidad del
sur de California.
Actividad b – galactosidase.
Ensayos filtrados fueron usados para evaluar la
actividad – galactosidase ,un parámetro que
refleja directamente la fuerza de las interacciones
proteína – híbrido . Se hicieron transformaciones
de plasmidos dobles en el cultivo PCY2 de levadura .Se
establecieron colonias de levaduras doblemente transformadas y
tres colonias separadas fueron pasadas por papel de filtro y se
les permitió crecer durante dos días en un medio
seleccionado . Permeabilizamos las levaduras congelando el filtro
impregnado de ellas en nitrógeno líquido y luego
descongelándolas a la temperatura ambiente . El filtro se
coloca en un segundo filtro empapado con una solución
amortiguadora de fosfato a 0,1-M conteniendo 300 g/mL.
Galactopyranoside 5 – bromo – 4 – cloro – 3 – indolyl –
– D – (X-gal) y mercaptanoetanol – 0.27%. Los filtros se
dejaron desarrollar durante 48 horas un color azul , siendo este
cambio de color de una interacción positiva.
Adicionalmente , se obtuvieron datos cuantitativos
relacionados a la fuerza relativa de interacciones
proteína – híbrido por medio de ensayo de
cultivo (ONPG) .Usando este ensayo de cultivo líquido
concurrentemente examinamos todas las combinaciones
híbridas de construcciones y repetimos completamente el
experimento en tres ocasiones distintas.
En cada ocasión se cuantificarón medidas
espectrofotométricas contra construcciones de
amelogenina procesadas de longitud completa interactuando
consigo mismas (tabla 2) Se calculo el error estándar y la
medida para cada combinación doble – Transformante (tabla
2) excepto para la lectura de
H – ras interactuando con CDC25 , la cual mostró un color
tan intenso que fue difícil establecer una lectura
precisa .
4.3.3 DETECCIÓN WESTERN DE LAS
PROTEÍNAS.
Para evaluar las interacciones negativas podrían
deberse únicamente a la ausencia de proteínas
objetivo ,
analizamos construcciones de ameloblastos en su capacidad para
expresar fusión de proteínas . Usamos
métodos publicados en detalle para la detección de
proteínas . En resumen , las proteínas fueron
recuperadas de células de levaduras transformadas con los
plasmidos nombrados . Y cantidades equivalentes de
proteínas por cada muestra fueron cargadas y solucionadas
para tamaño por medio de SDS – PAGE 10% . El gel fue
electrotransferido para membrana fluoruro polivinilidine (PVDF) ,
extensivamente bloqueada con albúmina 1% y suero de cabra
1% y ebitotobes ameloblastina detectados por el uso de anticuerpo
policional de conejo fermentado contra ameloblastina recombinante
a una dilusión de 1 :200 a temperatura ambiente
durante toda la noche.
4.3.4 RESULTADOS
En la tabla 2 se presentan las interacciones entre tres
proteínas de la matriz del esmalte clonadas –
amelogenina (y LRAP) ,tuftelin y ameloblastina –
así como las combinaciones positivas de control. Los
datos presentados en la tabla 2 relacionan las fuerzas relativas
de interacciones (cuando se comparar con amelogenina
intacta intarectuando consigo mismo, con las cantidades grandes
indicando mayor avidez ) y registrando por el ensayo de
cultivo líquido para actividad – galactosidase .
Controles positivos fueron proteína supresora de tumores
p53 co-transformada con el antígeno TSV40 largo y H – ras
(tipo salvaje) co-transformado con la proteína CDC25 de
Saccharomyces cerevisiae . Controles negativos involucran
cada una de las construcciones híbridas proteína –
esmalte cotransformadas bien con pPC86 ( para el híbrido
pPC97 ) o pPC97 ( para los híbridos pP86 ) . Todas
combinaciones negativas de control no tuvieron actividad
- galctosiadase determinada por el ensayo de
cultivo líquido.
El ensayo de levadura dos – híbridos fue
realizado también sobre un filtro soportando tres colonias
de cada combinación de construcción probadas y los resultados
obtenidos fueron consistentes con los de ensayo de cultivo
liquido . Un color azul se desarrolló dentro de la primera
hora para la construcción H – ras co-transformada con la
construcción proteína CDC25 , y sobre un
período de dos horas para la construcción tuftelin
co-transformadora dentro de si misma . El azul se
desarrolló para la construcción de
amelogenina M180 co-transformada consigo misma y para
construcción p53 co-transformada con construcción
antígeno – TSV40 largo, durante un periodo de
aproximadamente ocho a diez horas . Un azul muy pálido
para la construcción de amelogenina M180
co-transformada con la construcción LRAP estuvo presente
después de 24 horas. No se desarrollo coloración
azul después de las siguientes 24 horas para iteraciones
involucrando ameloblastina o amelogenina co-transformados
con tuftelin y estas combinaciones tuvieron que registrarse como
resultados negativos . Las combinaciones negativas de control no
desarrollaron color azul después de 48 horas.
La detección Western del epitope ameloblastina se
logró por la fusión de la proteína
ameloblastina producida por el plasmido pPC97 ( la cual
incluía la señal de secuencia peptida ) ( figura 1
callejón 4 y figuras 2 callejones 2 y 49 ). El
análisis Western no pudo demostrar un producto para la
fusión proteína ameloblastina ( la cual incluye la
señal peptida ) subcionada entre el plasmido pPC86 (
figura 1 ,callejón 3 ) , y por esa razón se
preparó un segundo plasmido conteniendo ameloblastina el
cual no incluyo la señal de secuencia peptida . la falla
para detectar un producto proteíno – híbrido en
levaduras previamente había sido observada . La falla para
identificar la proteíno – híbrido no necesariamente
significa que el producto gen ameloblastina – híbrido no
éste presente . Para asegurar que la falla observada de
ameloblastina para autoorganizarse y su falla para interactuar
con ambos amelogenina o tuftelin fueron debidas a una
propiedad
intrínseca de la ameloblastina ( y no debidas a un
híbrido – proteína inestable , nosotros realizamos
interacciones ameloblastina usando solo aquellas construcciones
que produjeron un producto híbrido identificable en el
análisis Western . La detección Western de un
epitote ameloblastina se logró para la segunda
proteína fusión ameloblastina producida en el
plasmido pPC86 ( figura 2 , columna 3 y 4) La ameloblastina
construido en el vector pPC97 (incluyendo la secuencia líder )
se usó para probar interacciones con ambos
amelogenina o tuftelin . Plasmidos construidos produciendo
epitopes de ambos amelogenina M180 , LRAP , o tuftelin
interactuaron con al menos uno de los otros plasmidos construidos
, y , por esta razón se ha asumido la estabilidad de estas
proteínas – híbrido dentro del nucleoplasma de las
levaduras.
4.3.5 DISCUSION
El esmalte dental es un ejemplo bien reconocido de
proteína – matriz – biomineralización mediana. Se
ha considerado como un modelo útil a causa de sur relativa
simplicidad a niveles celulares y de proteínas cuando se
compara con las complejidades del hueso o la dentina . Las
proteínas predominantes dentro de la matriz
orgánica del esmalte son las amelogeninas y las
enamelinas , de las cuales el tuftelin es el único miembro
clonado de la familia
enamelin.
Las proteínas amelogenina ,tuftelin y
ameloblastina se expresan exclusivamente por células del
órgano interno del esmalte y segregadas entre la matriz
extracelular del esmalte en formación . La enfermedad
genética
conocida como amelogenesis imperfecta ha sido mapeada para el gen
amelogenina en una cantidad de familias . El hallazgo de
que los defectos en el locus amelogenin resultan en defectos en
la organización de la matriz del esmalte no debe causar
sorpresa , dado que regiones terminal – amino y péptido
carboxyl – terminal recientemente han demostrado que interactuan
uno con otro para facilitar que ocurra la auto
organización amelogenina . Los resultados
identificando propiedades de auto organización para
amelogenina son también sustentados tanto en
observaciones in vitro como in vitro acerca de que
las amelogeninas se organizan en estructuras
nanosféricas compuestas de cientos de molécula de
amelogenina . Investigaciones adicionales sobre las
propiedades de auto-organización de la matriz extracelular
dele esmalte recientemente se han identificado para tuftelin . El
tuftelin es un medio de la familia
anionica de proteínas conocidas como las enamelinas, y
más posiblemente similares a las proteínas
anionicas arquetípicas encontradas ubicuamente entre
varios esquemas de biomineralización . Recientemente ,
tuftelin ha demostrado que posee un dominio enriquecido en
residuos acídicos y un dominio de auto organización
, cada uno localizado en extremos opuestos de la proteína
back – bone , sugiriendo que limitaciones especiales sobre la
molécula del tuftelin pueden contribuir a su capacidad
para interactuar con los cristales del esmalte.
La reciente clonación de ameloblastina introdujo
una tercera clase de proteínas ameloblasto – especificas .
La naturaleza de
estas proteínas es actualmente tema de intenso interés y
estudio . Mientras que la amelogenina y el tuftelin
parecen estar restringidas en su expresión a ameloblastos
comprometidos en el esmalte en formación , la
ameloblastina se expresa por ameloblastos durante la
amelogenesis, así como por células de la funda de
la raíz epitelial de Hertwig durante la cementogenesis .
El patrón espacial de expresión sugiere que la
proteína ameloblastina participa en la génesis de
ambos tipos de tejidos . El patrón de
inmunodetección para la ameloblastina indica que este es
encontrado en la interface entre la porción de Tomes del
ameloblasto ( la extensión citoplasmática
ameloblasto involucrada con la secreción de la
proteína del esmalte) y la matriz orgánica de
esmalte recientemente segregada , pero no parece extenderse entre
la recientemente segregada y aún no mineralizada matriz
orgánica del esmalte . Se ha sugerido una función
de anclaje entre los ameloblastos y la matriz de esmalte para
ameloblastina basados sobre este patrón de
acumulación de proteínas.
Los resultados obtenidos en el presente estudio sugieren
que es probable que el papel de la ameloblastina sea distinto a
al de las enamelinas y amelogeninas . El papel de anclaje
mas que estructural es consistente con la expresión
continuada de ameloblastinas por células de la raíz
de Hertwig durante el proceso de cementogenesis .
En tanto una función especifica para la
ameloblastina en la cementogenesis está por demostrarse ,
Mac Dougall y sus colegas demostraron que la ameloblastina es un
gel candidato para la forma autosomal de la enfermedad
amelogenesis imperfecta hereditaria en por lo menos una familia afectada
al colocar el locus de ameloblastina en área genética
crítica para los defectos del esmalte . Estos
investigadores están continuamente evaluando el estatus
del cementum en esas familias .
El que la matriz orgánica del esmalte se
orgánica en el espacio extracelular implica que las
proteínas por si mismas contengan toda la información requerida para la
organización . Al igual que otras matrices
extracelulares ,es probable que la organización dependa de
las proteínas y la distribución tridimensional de las
proteínas dentro de la organización total de la
matriz . Descifrando el "código" que dirige la
organización de la matriz orgánica puede permitirse
la construcción de materiales diseñados que
imitarán de la matriz natural, proporcionando entonces
nuevas luces sobre la creación de materiales restaurativos
o matrices
regenerativas . Un aspecto muy notable de la matriz del esmalte
es el de que las proteínas comprendiendo los dominios de
auto organización de ambos, amelogenina y tuftelin
, no parecen tener ninguna afinidad unas con otras . La aparente
falta de interacciones amelogenina – a – tuftelin (en el
ensayo híbrido – dos levaduras ) sugiere que o bien un
"puente" de proteínas que está aun por
identificarse vincule amelogenina con tuftelin o bien que
estas dos proteínas ejercen su influencia sobre los
cristales en formación sin los beneficios de la
interferencia de una con otra . En este sistema de "dos fases"
para bio – actividad amelogenina y tuftelin parece no
estar influenciado por ameloblastina . El hallazgo tanto en
interacciones como de no interacciones proteína – a –
proteína entre las proteínas del esmalte sugiere
que ciertas restricciones actúan en la matriz
orgánica del esmalte durante su auto – organización
.
La amelogenina y la enamelina han sido
identificadas dentro de la misma vesícula secretora por
medio de inmunodetección de alta resolución ,
sugiriendo una intima relación para estas dos
proteínas dentro de la matriz orgánica del esmalte
. La ausencia de una aparente interacción entre las
proteínas amelogenina y enamelina puede permitir
que ellas sean co – segregadas en una vesícula sin
posibilidad de una organización o ensamble prematuro de
una con la otra . La formación de cristales de
hidroxiapatita en el esmalte de los mamíferos se ha atribuido a interacciones
específicas amelogenina – amelogenina ,
interacciones amelogenina – cristales y/o a interacciones
tuftelin – cristales . Se ha sugerido que las enamelinas a causa
de sus propiedades físicas y químicas actúan
como sitios de nucleación durante la
biomineralización del esmalte .
La proteína amelogenina purificada puede
dirigir la deposición mineral en los extremos de los
gérmenes de los cristales de hidroxiapatita sugiriendo
entonces el papel de la amelogenina en el crecimiento de
los cristales . La matriz de proteína del esmalte es
transitoria , siendo removida en forma progresiva en la medida en
que avanza el contenido mineral . En última instancia esta
matriz de proteína del esmalte proporciona la interface
definitiva entre los componentes orgánicos e
inorgánicos , dirigiendo la iniciación ,
propagación y terminación de los cristales
.
Previamente se demostró que la amelogenina
y el tuftelin se auto ensamblarán . El estudio presentado
aquí se demuestra la falla de la ameloblastina para auto –
ensamblarse . Adicionalmente nosotros no fuimos incapaces de
mostrar interacciones proteína – proteína entre
proteínas disímiles de la matriz dele esmalte ,
indicando que el sistema híbrido – dos levaduras es una
herramienta útil para el estudio de interacciones
proteína – matriz dele esmalte que permitan la
organización de la matriz . Aplicaciones futuras
podrían incluir expresiones de cDNA hechas en denticiones
en formación de los ratones en un intento por clonar otros
genes involucrados en la organización de la matriz esmalte
. Esta estrategia
podría resultar en el clonamiento de proteínas con
la capacidad par interactuar directamente formando un "puente"
con una de las proteínas conocidas de la matriz del
esmalte . Luces adicionales podrían arrojarse sobre el
enigma continuando de la biomineralización del esmalte de
los vertebrados cuando nuevas proteínas sean identificadas
por medio del ensayo dos levaduras híbrido y su papel
fisiológico pueda ser más claramente
identificado.
Bashir y sus colegas reportaron recientemente una
variación en la secuencia DNA tuftelin genómico de
bovino con la descrita por Deutsch . Estos investigadores
reportaron una proteína tuftelin faltándole los 45
residuos aminoácidos en el terminal carboxil como reporta
Deutsch . El tuftelin de Bashir tiene también una
diferente secuencia aminoácida predicha después del
residuo 297 . La variación en la secuencia puede
representar un polimorfismo en las fuentes de DNA
usadas pero sugiere la posibilidad de que puede haber más
de una secuencia carboxil terminal – aminoácido para las
tuftelinas de bovino . La falta de 45 residuos aminoácidos
en el terminal carboxil podría tener efectos
insignificantes sobre la auto – organización de tuftelin ,
puesto que estos residuos parecen no tener ningún papel en
mediar la interacción tuftelin – tuftelin . No obstante ,
una diferente secuencia proteínica después del
residuo 297 puede tener algún impacto en la capacidad de
tuftelin para auto organizarse.
4.4 AMELOGENINA, SEÑALAN MUTACIÓN DEL
PEPTIDO: CORRELACIÓN ENTRE LAS MUTACIONES EN EL GEN DEL
AMELOGENIN (AMGX) Y MANIFESTACIONES DE LA AMELOGÉNESIS
IMPERFECTA X-UNIDO
Genomics
Imperfecta de Amelogenesis (AI) es una colección
de desórdenes genéticos que afectan la
formación de esmalte del diente. Hay varias formas
clínicas y modos de herencia de AI incluso el autosomal
recesivo, autosomal dominante, y se X-unió formas. El gen
del amelogenin, localizó en los p22.1 – 22.3 región
del cromosoma de X, se ha mostrado para ser deformado en varias
familias con AI X-unido. Un poco de heterogeneidad
genética entre las formas X-unidas de AI puede existir
subsecuentemente que la enfermedad se ha trazado a un nuevo sitio
en el brazo largo del cromosoma de X en una familia con XAI.
nosotros hemos investigado el gen del amelogenin ahora en una
familia con la forma del hipoplastic de XAI. El esmalte del
diente de varones afectado en esta familia es duro y glaseado,
con una superficie lisa, pero así que adelgaza que los
dientes no se encuentran a los puntos del contacto y el color de
los dientes varía de amarillento-blanco poner amarillo.
hembras del portador en la exhibición familiar las
manifestaciones menos severas de la enfermedad con islas de
normal alterno y el esmalte afectado. Este más exacto se
ha atribuido al inactivation del azar del cromosoma de X
célula diferenciando para volverse ameloblasts.
Genomic ADN se preparó de los individuos afectado
y normales en la familia y de los mandos normales. Cebadores de
PCR que flanquean cada uno de los siete exons del gen del
amelogenin y una región 5´ del sitio de salida de
transcriptional eran construted del sepa sucesión del
nucleotide del gen del amelogenin. Todo el exons y 170 bp
5´ del sitio de salida de transcripción fueron
amplificados por PCR de muestras de ADN derivadas de un
varón afectado, usando 10 pares del cebador. Se
amplificaron Amelogenin gen segmentos de 1 ug de genomic ADN que
usa 0.035 unit/ul de amplitaq en 50 mm KCl, 10 mm TrisHCl, pH
8.3, 1.5 mm MgCl, 125 mg/ml la albúmina de suero bovina,
200 uM cada dATP, dGTP, dCTP, y dTTP, y 1 uM cada cebador en un
volumen de 150 ul, recubrió con 1-2 gotas de aceite
mineral. Las condiciones de PCR eran 94 C para 1 min, templando
para 1 min a las temperaturas en mesa 1, y 72 C para 2 min
durante 30 ciclos seguidos por extensión a 72 C para 7
min. Nested PCR was performed to amplity exons 4,5 and 6 using
primer pairs that do not amplify the homologous gene on the Y
chromosome. Los productos de PCR eran vectores del
cloned y sujetaron al análisis de sucesión de
sólido-fase.
Secuencia Amplificada | Primer | Secuencia | Annealing Temperature | Tamaño del producto |
Upstream region | AI 01 | GCCGAATTCCATATGCACTAATCACAAC |
|
|
| AI 02 | GAATGTATTCAGTGCAAGTTTCTG | 60 | 219 |
Exon 1 | AI 11 | GATATAGAATTCAGCTTATAGTTGGAAG |
|
|
| AI 12 | TTTTAAAAGGAATGCAGAGAAAG | 55 | 162 |
Exon 2 | AI 21 | CCGGAATTCAGAAAGAGATTTGAAAAGTGG |
|
|
| AI 22 | GTCCAAGTTTGTGAAATTGGACCGTG | 55 | 166 |
Seragation Analysis | AI 23 | GATTTGAAAAGTGGATGTTGAC |
|
|
| AI 24 | TGCAAGGGGTGTTTTACTCA | 55 | 120 |
Exon 3 | AI 31 | TATGAATTCTCCTCCCCTCCTCCCTGTA |
|
|
| AI 32 | GAGCCCAGGGCATTGTTAACGCAAA | 60 | 136 |
Exon 4 + 5 first | AM 5 | ACAGCTGGTTGGAGTCACCTGAGCCATT |
|
|
| AM 6 | TCGACTACCTTTGTAGCCTGTTCAG | 55 | 935 |
Exon 4 + 5 nested | AI 41 | ACACAGTGCCTGTCACACAGGAAGCA |
|
|
| AI 52 | CGGCCTGCAGGGAATAAGGAACAAAATGTC | 60 | 272 |
Exon 6 first | AM 7 | ACAGCTGGTTGGAGTCACCTGAGCC |
|
|
| AM 8 | TCGACTACCTTTTGTAGCCTGTTCAG | 55 | 940 |
Exon 6 nested | AI 61 | TCCGAATTCTCTGGTTGGAGTCACCTGAGCCAA |
|
|
| AI 62 | GCACCATTTTCACAGGATTTGCATTG | 60 | 539 |
Exon 7 | AI 71 | GGAACATTTGTAAATTATTTTAACTG |
|
|
| AI 72 | AATCTGCAGTTCCTACCTGATTCAACAATCA | 55 | 260 |
Cloned Secuences | JS 1 | GAGCGAATAACAATTTCACACAGG |
|
|
| JS 2 | GCCAGGGTTTTCCCAGTCACGA | 55 |
|
Una 9-bp tachadura se observó en exon 2 del gen
del amelogenin en una muestra de ADN de un varón afectado.
Esta tachadura no estaba presente en ADN prueba de los mandos
normales. El siguiendo siendo seis exons así como los
upstream de la región del gen del amelogenin eran
idénticos a la sucesión normal.
El análisis de la segregación de la
mutación se realizó en la familia para determinar
que la ocurrencia de la tachadura pone en correlación con
la enfermedad. Diez nanograms de genomic como los que ADN fue
amplificado describieron sobre usar 0.2 uM de los cebadores AI 23
y AI 24 en un volumen de 10 ul, recubierto con una gota de aceite
mineral. El cebador AI 23 era kinased con (y-P) ATP (Dupon)
usando T4 kinase del polynucleotide. Dos microliters de cada
reacción de amplificación estaba separado en un
desnaturalizar 6% la gel del poluacrylamide. El diagnóstico de los fragmentos de la
tachadura se demostró en muestras de ADN de los dos de los
varones afectado. Las hembras de portador de fice eran
heterozzygoys para la mutación con uno anormal y un
producto de amplificación normal, mientras los dos varones
sencillos y las dos hembras del noncarrier tenían
fragmentos del normal-tamaño. La tachadura de 9 bp en exon
2 del gen del amelogenin pone en correlación así
con el hypoplasia de esmalte en esta familia. La mutación
ha quitado el codons para el isoleucine de los
aminoácidos, leucine, phenylanine, y alanine: En cambio,
un nuevo codon del threonine se crea.
Se espera que esta tachadura tenga consecuencias del
serius al nivel de la proteína. Exon 2 al gen del
amelogenin pone en código un 16 amino-ácido el
peptide señalado. Los peptides señalados incluyen
tres dominios distintos típicamente: y el
amino-término cobró región de 1-5 residuos
positivamente (n-región), una parte central,
hidrófoba de 7-15 residuos (h-región), y un dominio
carboxy-terminal más polar de 3-7 residuos
(c-región). La mutación presente se predice para
quitar tres hidrófobo y un residuo neutro en la
h-región, y en cambio un residuo polar se introduce. Se
han mostrado las tachaduras de aminoácidos en la
h-región o substitución de residuos
hidrófobos con cobrado a los resultados en peptides
señalado exportación-defectivo. la región
hidrófoba restante del amelogenin del mutante que el
peptide señalado es que sólo residuos del fice
anhelan, y contiene un residuo polar. La mutación es por
consiguiente probable dañar el fuction del amelogenin el
peptide señalado, produciendo translocation de la
proteína defectivo durante la traducción. Los
miembros afectado del esmalte de diente de exhibición
familiar investigado que es corretly mineralizaron, pero de
thicknees reducido. Este phenotype de una proteína
requirieron para la formación de esmalte.
Hay sólo tres casos informados de mutaciones en
peptides señalado humano que produce condiciones
patológicas familiares. Un desuna el diathesis sangrante
es el resultado de la substitución de un arginine para un
glycine en el peptide señalado de factor de la
coagulación X. El factor del mutante que X fue mostrado
para ser correctamente translocated en el reticulum del
endoplasmic, pero los peptide señalados deformados no
pueden ser quitados por peptidase señalado. Otra
mutación, destruyendo el sitio del cleabage para el
peptidase señalado, ha sido informada por Ito y
co-obreros. Ellos han identificado una mutación en el
peptide señalado de preprovasopressin en el plasma en una
familia con insipidus de la diabetes central.
El tercio informó mutación del peptide
señalada que causa enfermedad se parece la mutación
en el estudio presente, como él el islocated en el centro
hidrófobo del peptide de signo de preproparathyroid. La
mutación es un T a transición de C que reemplaza el
ánimo neutro el cysteine ácido con el arginine del
aminoácido cobrado. Esta mutación daña el
translocation y/o procesando de la hormona del preproparathyroid
naciente en una familia afectados por
hypopaathyroidism.
Nosotros hemos informado un XAI previamente el
charaterized familiar por hypomineralization del esmalte. Los
miembros afectado de esa familia tienen esmalte de espesor normal
pero pobremente mineralizaron y por consiguiente más suave
que normal. La mutación en esta familia es una 5-kb
tachadura, quitando 5 de los 7 exons del gen del amelogenin. El
codificando permaneciendo la sucesión se limita a 18
codons; 16 de éstos ponen en código el peptide
señalado. Esta mutación destruye así
completamente el fucntion de la proteína del amelogenin.
Hypomineralization del esmalte en individuos afectado en este
familu está de acuerdo con esta observación tiene informe otra
familia con XAI. Los miembros afectado en esta familia exhiben
hypoplasia y hypomineralization, pero los síntomas
varían entre los miembros familiares afectado. La causa de
la enfermedad en esta familia es una tachadura de un cytosine en
exon 5 de la mutación. los autores estiman que un producto
de la proteína de 74 aminoácidos se pone en
código, faltando más de 200 aminoacidos de la
proteína del amelogenina intacta. Una mutación
idéntico a esto también ha sido informado por otro
grupo.
Los resultados presentes, junto con los informes del
previoys de mutaciones en el gen del amelogenin, implican la
proteína del amelogenin en el proceso del mineralizarion
normal así como en la formación de esmalte de
espesor normal, desde los casos de XAI clasificados como
hypolastic o hypomineralized es asociado con mutaciones en el
mismo gen. Más allá los estudios moleculares de
pacientes con formas diferentes de imperfeta del amelogenesis
mejorarán el sistema de la clasificación
clínico presente. Es más, las investigaciones de
pacientes con phenotypes clínico diferente proporcionan
valiosas visiones en los mecanismos la formación
subyacente de tejido duro dental. Aumentado entendiendo de la
biología
de esmalte del diente puede permitir el desarrollo de
técnicas por la regeneración de tejido duro dental
dañado.
- CONCLUSIONES
En este trabajo podemos concluir que:
- En el desarrollo del esmalte, los odontoblastos se
retiran centralmente, dejando por detrás dentina
formada. Los ameloblastos también se retiran, pero en
dirección periférica, dejando esmalte
recién formado sobre dentina previamente
formada. - La formación del esmalte es un proceso
complejo que comprende tres estadios. El primero es informativo
e implica la secreción de una matriz orgánica, la
matriz sufre el segundo estadio: la maduración, el
tercer estadio en la formación del esmalte. - La amelogénesis es el proceso del esmalte que
comprende: la elaboración de una matriz orgánica
extracelular y la mineralización casi inmediata de la
misma. - El ciclo vital del ameloblasto se constituye de la
siguiente manera: etapa morfogénica (preameloblasto),
etapa de organización o diferenciación
(ameloblasto joven), etapa formativa o de secreción
(ameloblasto activo, secretor o maduro), etapa de
maduración, etapa de protección, etapa
desmolítica. - La Amelogénesis Imperfecta tiene tres tipos,
los cuales son: tipo hipoplásico, tipo de
hipomineralización y alteración de
corona.
6. BIBLIOGRAFIA
- DEL MARCO TEORICO
- Motor de Busqueda "Altavista"
http://www.altavista.com
Internet
- Histopatologia Bucal
Autor:
Año: 1991
- Histologia de Tenlate