Anaplasma marginale. Métodos empleados en el diagnóstico

1. Resumen
2. Generalidades de Anaplasma
   marginale
3. Biología Molecular de A.
   marginale
5. Diagnóstico
   de la enfermedad
6. Referencias

Resumen

Anaplasma marginale es una rickettsia del
genogrupo II de las Ehrlichias, que parasita los eritrocitos
maduros del ganado bovino y causa severas pérdidas
económicas fundamentalmente en las zonas tropicales y
subtropicales (Palmer y col., 1999). Este microorganismo
presenta múltiple variabilidad antigénica, de
morfología, virulencia, transmisibilidad
por garrapatas y habilidad para inducir protección cruzada
contra aislamientos heterólogos (Palmer y McElwain, 1995).
Se han caracterizado seis proteínas
de superficie de membrana de los cuerpos iniciales de este
organismo, portadoras de epitopes B y T, denominadas
proteínas mayoritarias de superficie (MSPs) y designadas
1a, 1b, 2, 3, 4 y 5. Estas proteínas son reconocidas por
anticuerpos neutralizantes y se encuentran en una estrecha
relación intermolecular en la superficie de la membrana de
los cuerpos iniciales.

Algunas de estas proteínas inducen una
protección total o parcial en animales
vacunados, aunque el nivel y la uniformidad de la misma, es
variable (Palmer y McElwain, 1995). A pesar de las cuantiosas
pérdidas económicas producidas todos los
años, a nivel mundial hasta el momento no se cuenta con un
método de
control eficaz
contra la enfermedad, por lo que resulta de gran importancia
desarrollar una vacuna capaz de prevenir la infección con
este patógeno y contar con técnicas
de diagnóstico más sensibles y
específicas que permitan la detección de animales
portadores para ser utilizadas en estudios
epizootiológicos y para el control de la enfermedad
(Echaide y col., 1998; Corona, 2005). A partir de estas premisas
nos proponemos como objetivo
exponer los resultados más importantes relacionados con la
anaplasmosis bovina y los métodos
utilizados en el diagnóstico de Anaplasma
marginale.

1. Generalidades de Anaplasma
marginale

1.1. Clasificación
taxonómica

Anaplasma marginale se consideró como un
protozoo hemático durante mucho tiempo. Las
investigaciones ulteriores demostraron que se
clasifica dentro del orden Rickettsiales, familia
Anaplasmataceae, género
Anaplasma (Ristic y Kreier, 1984). El análisis filogenético, utilizando
secuencias de la región 16S del ARNr, permitió
esclarecer la relación dentro de los genogrupos de las
especies de Ehrlichias, situando a A. marginale dentro del
árbol filogenético, en el genogrupo II

de las Ehrlichias, las cuales son patógenos de
animales y humanos que se transmiten por garrapatas (Biberstein,
1999).

Se conocen cuatro especies del género
Anaplasma, como agentes causantes de la anaplasmosis:
A. marginale, que es la más patógena para
los bovinos; A. centrale, causante de una relativa forma
benigna de anaplasmosis en bovinos; A. caudatum
también en ganado bovino y A. ovis, causante de un
padecimiento limitado a ovinos y caprinos (Ristic y Kreir, 1984),
siendo A. marginale la única especie identificada
en Cuba (Alonso y
col., 1989). La secuencia nucleotídica de la región
16S del ARNr de A. centrale está
estrechamente relacionada con la secuencia de A. marginale
con un 98.08 % de identidad
(Inokuma y col., 2001).

Dumler y col., (2001), propusieron que en la familia
Anaplasmataceae se incluyeran especies del género
Wolbachia, Ehrlichia, Cowdria y
Neorickettsia y conservar los géneros
Anaplasma y Aegyptianella dentro de la familia.
Propusieron, además que miembros del grupo de E.
phagocytophila, incluyendo E. phagocytophila, E.
equis, E. granulocítica humana (HGE),
así como E. bovis y E. platys debían
ser unidos con el género Anaplasma. Cada uno de
estos agentes persiste en sus respectivos hospederos mamíferos y se transmite dentro y no entre
las generaciones del vector biológico. Por otra parte, se
han encontrado genes homólogos entre los miembros de este
grupo, algunos de los cuales son miembros de familias de
multigenes que pueden estar arreglados en ² tandem² o dispersos en el cromosoma (Dame y
col., 1992; Walker y Dumler, 1996).

1.2. Caracteres morfofuncionales y
culturales

A. marginale es un microorganismo sin forma
definida. Se establecieron tres categorías de acuerdo a su
talla: El clásico cuerpo marginale, una forma intermedia
cuerpo inicial y la de tamaño pequeño conocido como
cuerpo polihédrico (Ristic y Watrach, 1963; Palmer y
McGuire, 1984; Ristic y Kreier, 1984).

En los hospederos vertebrados, Anaplasma spp.,
infecta a los eritrocitos maduros con la formación de una
vacuola derivada de dichos eritrocitos, alrededor del organismo
(Francis y col., 1979). Cada organismo tiene un diámetro
de 0.55- 0.85 m m y contiene los
cuerpos iniciales que consisten en agregados granulares densos
rodeados por una doble membrana de 40-50 m m de espesor. El microorganismo se replica
dentro del eritrocito por fisión binaria para formar hasta
ocho organismos individuales dentro de una vacuola simple (Ristic
y Watrach, 1963; Palmer y McGuire, 1984; Ristic y Kreier, 1984).
Posteriormente, los organismos salen del eritrocito, utilizando
mecanismos aparentemente no líticos e infectan los
eritrocitos aledaños (Erp y Fahrney,
1975).

El cuerpo inicial se encuentra dentro de los
glóbulos rojos en número variable y está
formado por material fibrilar y varios gránulos
electrodensos que contienen ADN, ARN y
hierro
orgánico, rodeados por una doble membrana. Estos cuerpos
iniciales, a la vez, son limitados por una vesícula
intracitoplasmática, constituida por una sola membrana, y
que también posee material fibrilar, nombrada cuerpo de
inclusión (Ristic y Kreier, 1984).

Nakamura y col., (1989) demostraron la presencia de
carbohidratos
en la superficie de los cuerpos iniciales de A. marginale,
pero al parecer éstos no son importantes en la
hemaglutinación de los cuerpos iniciales, ya que
cuando se trató con NaIO4 o neuroaminidasa, no
se encontraron diferencias con respecto al control. Esto sugiere
que aparentemente los carbohidratos de superficie de los cuerpos
iniciales no juegan un papel importante en la adhesión de
A. marginale. Cuando se trataron los eritrocitos
bovinos con a quimotripsina o
neuroaminidasa, fue evidente la pérdida de la
hemaglutinación, no así cuando se siguió el
tratamiento con tripsina y varias fosfolipasas, lo que
sugirió que el ligando del receptor de los eritrocitos
está compuesto parcialmente por proteína y/o
ácido siálico (McGarey y Allred, 1994).

Este hemoparásito se caracteriza además,
por producir catalasas, no producir pigmentos y no formar esporas
u otros estados de resistencia. Es
sensible a la tetraciclina e insensible a las penicilinas,
sulfonamidas, estreptomicina y arsenicales. Su infectividad puede
ser destruida al exponerlo a 60°C, al menos por 50 minutos y
a rayos X o a
sonicación a 35°C por 90 minutos. (Ristic y Kreier,
1984).

En Brasil se
detectaron y aislaron cepas de A. marginale con un
apéndice de inclusión. El mismo presenta
estriaciones longitudinales electrodensas y no se origina
directamente del cuerpo de la rickettsia, sino de un complejo
localizado en la unión entre la membrana de
inclusión y el apéndice. Este apéndice
permanece en las células
huéspedes, incluso aún después que A.
marginale abandonan los glóbulos rojos (Ribeiro y
Passos, 1996; Stich y col., 1997).

A. marginale se logró cultivar, pero por
cortos períodos de tiempo, mediante la propagación
del parásito en un cultivo de una línea celular
derivada de embriones de garrapata Dermacentor variabilis,
pero para poder mantener
el crecimiento se necesitaron realizar pases continuos, pues este
microorganismo requiere para su propagación de
células hospederas con una alta actividad de crecimiento y
multiplicación y un medio con suero fetal bovino (Hidalgo
y col., 1989). Sin embargo, Munderloh y col., (1996), lograron
propagar continuamente esta rickettsia en una línea
celular derivada de Ixodes scapularis, usando como
inóculo sangre de bovino
infectado. Un segundo aislamiento, derivado de vacas naturalmente
infectadas en Oklahoma, se propagó en la misma
línea celular de garrapata, lo que tiene potencialidad
para ser utilizado como antígeno para el desarrollo de
una vacuna mejorada contra la anaplasmosis en los Estados Unidos
(Blouin y col., 1998).

2.
Biología
Molecular de A. marginale

A. marginale presenta un ADN circular de doble
cadena, cuya talla total oscila entre 1 200 y 1 250 kpb,
determinado por los análisis de restricción
realizados al genoma de la cepa Florida, con las enzimas
Sfi I y Pac I. El análisis en electroforesis
de campo pulsante, de los productos de
las digestiones, realizadas al genoma de diferentes cepas, dio
como resultado la existencia de un considerable polimorfismo
entre estas, aunque la talla total del genoma es constante, con
un contenido de G + C de 56 %, lo cual se determinó por
análisis espectral (Alleman y col., 1993).

En este parásito se describen seis genes
(msp1a , msp1b , msp2, msp3, msp4 y msp5), que codifican para
las proteínas principales de superficie de los cuerpos
iniciales, que constituyen blancos de la respuesta inmune del
hospedero contra el patógeno (Palmer y McGuire, 1984;
Tebele y McGuire, 1991). Hasta la fecha varios de los genes que
codifican para las MSPs se han clonado, secuenciado y expresado
(Barbet y col., 1986; Allred y col., 1990; Barbet y Allred, 1991;
Visser y col., 1992; Oberle y col., 1993; Alleman y col., 1998).
Estos trabajos han revelado que algunos de estos genes son
polimórficos entre cepas y existen en familias de
multigenes.

El gen msp1a codifica para la
proteína de membrana MSP1a y se encuentra representado en
el genoma por una simple copia. Posee una gran similitud con los
genes de E. coli, en cuanto a las secuencias consenso de
la región promotora, sin embargo, no se ha detectado una
secuencia con similitud a la de Shine-Delgarno de E. coli
(Palmer y McGuire, 1990). Este gen presenta un alto polimorfismo
de talla entre los aislamientos de distintas regiones
geográficas, debido a que posee secuencias
oligonucleotídicas repetidas en tandem (Oberle y col.,
1988; Allred y col., 1990; Palmer y McGuire, 1990). Estas
secuencias se encuentran repetidas en el gen 2, 4, 6 y 8 veces en
los aislamientos Virginia, Washington, Idaho y Florida
respectivamente (Palmer y McGuire, 1990; de la Fuente y col.,
2002a; de la Fuente y col., 2002b).

A partir de estudios realizados a este gen, en el
aislado Habana de A. marginale pudimos comprobar la
presencia de 5 repetidos en tandem en dicho aislado (Corona y
col., 2004, Corona y col., 2005), de ahí el alto
polimorfismo de talla observado, por lo que se ha utilizado para
la diferenciación y detección específica de
aislamientos de A. marginale (Lew y col.,
2002).

Por su parte, el gen msp1b
está formado por una familia de multigenes, compuesta al
menos por cuatro copias (Camacho y col., 2000). Este gen
también presenta dominios de secuencias repetidas, al
igual que msp1a , aunque son de
menor extensión. Por ensayos de
RFLP, se demostró que esta familia de genes es
polimórfica entre aislados de regiones
geográficamente diferentes (Barbet y Allred, 1991). En
estos momentos se sabe que todas las copias del gen son capaces
de expresarse y que codifican para proteínas
estructuralmente únicas (Camacho y col., 2000).

El gen msp2 está formado por una familia
multigénica. Presenta una gran variabilidad
fundamentalmente en su extremo 5’ (Palmer y col., 1994) y
codifica para moléculas proteicas estructuralmente
distintas, las cuales presentan epitopes B diferentes, en las
regiones con alto polimorfismo de aminoácidos. Durante la
fase aguda de la enfermedad hay transcripción de
diferentes copias de este gen paralelamente (Eid y col., 1996;
French y col., 1998).

El gen msp3 forma parte también de una familia
multigénica, cuyas copias se encuentran ampliamente
distribuidas a través del cromosoma (Alleman y Barbet,
1996). El análisis de la secuencia de tres genes
reveló regiones conservadas y regiones variables
dentro del marco abierto de lectura de los
mismos. Este gen codifica para una proteína de 86 kDa, que
es considerada un antígeno inmunodominante (Palmer y col.,
1986; McGuire y col., 1991).

El gen msp4 se encuentra como una simple copia en el
genoma de A. marginale y codifica para una proteína
de 31 kDa (MSP4) (Oberle y col., 1988, Palmer y col., 1988).
Según nuestros resultados se obtuvo la
amplificación de este gen en tres aislados cubanos de A.
marginale con una talla de 800 pb (Corona y col., 2000).
Un rasgo peculiar de este gen, es que la secuencia de la
región 3' contiene repeticiones imperfectas invertidas que
exhiben abundantes estructuras
secundarias (Oberle y col., 1993). de la Fuente y col., (2002a),
han demostrado que este gen proporciona información filogenética sobre la
evolución de los aislamientos de A.
marginale, a diferencia del gen msp1a , que puede brindar información
filogeográfica, sólo cuando se analizan un gran
número de aislamientos de un área
geográfica.

El gen msp5 está representado en el genoma como
una simple copia, altamente conservada entre las cepas de A.
marginale estudiadas (Martínez y col., 2004, Corona y
col., ). La presencia del gen en todas las especies de
Anaplasma, incluyendo A. ovis, sugiere que este gen
es esencial en el ciclo de vida
del parásito, lo que avala el uso del mismo para el
desarrollo de procedimientos de
diagnóstico molecular. Se han identificado elementos de
control procariontes en la secuencia de este gen, los cuales son
funcionales en la bacteria E. coli (Visser y col.,
1992).