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Anaplasma marginale. Métodos empleados en el diagnóstico (página 2)



Partes: 1, 2

 

2.1. Proteínas
de los cuerpos iniciales

Como se ha mencionado anteriormente, se han
caracterizado seis MSPs, denominadas: MSP1a, MSP1b, MSP2, MSP3,
MSP4 (Palmer y McGuire, 1984) y MSP5 (Tebele y McGuire,
1991).

Estas proteínas presentan un polimorfismo
variable entre distintos aislamientos de A. marginale. Se
encuentran en una estrecha relación intermolecular en la
superficie de membrana de los cuerpos iniciales (Vidotto y col.,
1994) y además pueden contener estructuras
helicoidales con segmentos transmembrana, dominios para la
constitución de complejos
multiméricos y regiones que funcionan como secuencia
señal (Barbet y Allred, 1991; Tebele y McGuire, 1991;
Palmer y McElwain, 1995; Alleman y Barbet, 1996). La
inmunización del ganado con membranas de A.
marginale
que contienen las proteínas de superficie
induce inmunidad protectora contra la enfermedad clínica
(Tebele y McGuire, 1991).

La proteína MSP1 fue originalmente descrita como
AmF105 (Palmer y McGuire, 1984) y está compuesta por dos
subunidades MSP1a (105 kDa) y MSP1b (100 kDa), unidas por enlace
disulfuro. Se ha demostrado que el complejo y las dos subunidades
separadas, median la adherencia a los eritrocitos bovinos
(McGuire y col., 1984), esto sugiere que MSP1a y MSP1b funcionan
como adhesinas y se podrían requerir para la
invasión de los eritrocitos, ya que anticuerpos
específicos para MSP1 bloquean la unión de
A. marginale a éstos. Además estos
anticuerpos opsonizan los organismos vivos para la fagocitosis de
los macrófagos (Cantor y col., 1993). Por otra parte la
inmunización del ganado bovino con la proteína MSP1
nativa confiere un 100 % de protección contra la
rickettsemia aguda y la enfermedad (Palmer y col., 1986; Palmer y
col., 1989).

La inmunización del ganado bovino con la
proteína MSP1 nativa purificada confiere protección
contra la rickettsemia aguda. Sin embargo, a diferencia de estos
resultados, cuando se utiliza la proteína nativa, la
inmunización con las proteínas recombinantes MSP1a,
MSP1b o la combinación de ambas, no induce
protección significativa (Palmer y McElwain, 1995). La
MSP1b recombinante utilizada en los ensayos
fallidos de inmunización se derivó de una copia del
gen, el único miembro de la familia
secuenciado hasta este momento (Barbet y Allred, 1991).
Actualmente se sabe que existe coexpresión de al menos dos
copias diferentes del gen, en la fase aguda de la anaplasmosis y
la expresión de proteínas MSP1b con epitopes B
variables
(Camacho y col., 2000).

La proteína MSP2 está presente en la
membrana como un tetrámero adyacente a las
proteínas MSP1, MSP3 y MSP4. Sus subunidades están
unidas mediante puentes disulfuro, es relativamente
inmunodominante y posee un peso molecular de 36 kDa (Palmer y
col., 1988; Palmer y McElwain, 1995). Esta proteína es
altamente polimórfica, con presencia de epitopes
conservados (Palmer y col., 1994), aunque presenta epitopes B
diferentes, en las regiones polimórficas. Se ha demostrado
la expresión de diferentes variantes antigénicas de
esta proteína, durante la rickettsemia aguda (Eid y col.,
1996). La conservación de la estructura
genómica para la generación de variantes de MSP2 y
de epitopes CD4+ en A.
marginale
y A. centrale indica que estas dos especies
presentan un repertorio similar de epitopes MSP2 al sistema inmune y
esto puede ser responsable de la eficacia de
protección contra A. marginale cuando se
prueban vacunas de
A. centrale (Brayton y col., 2002; Shkap y col.,
2002).

La MSP3 está codificada por una familia
multigénica, es también inmunodominante durante las
infecciones natural y experimental. Tiene un peso molecular de 86
kDa y se puede encontrar además en A. centrale y
A. ovis (Palmer y McElwain, 1995). Es estructural y
antigénicamente diferente entre cepas de A.
marginale,
presenta polimorfismo de talla entre aislamientos
geográficamente diferentes (Alleman y Barbet, 1996) y es
expresada por un simple ²
locus² , en el cual la
variación de los genes msp3 expresados es generada por
recombinación utilizando seudogenes (Meeus y col.,
2003).

La proteína MSP4 de 31 kDa, es altamente
conservada entre los distintos aislamientos de A. centrale
y A. marginale. Esta proteína contiene bloques de
aminoácidos relacionados con la proteína MSP2
(Alleman y Barbet, 1996). Sus epitopes conservados son de gran
importancia tanto para el diagnóstico como para el desarrollo de
una vacuna (Tebele y McGuire, 1991; Oberle y col., 1993). Se ha
comprobado que funciona como adhesina al igual que la MSP2 y las
subunidades del complejo MSP1 y que tanto la nativa como la
recombinante protegen a animales
inmunizados en retos con cepas homólogas (McGarey y col.,
1994).

Otra de las proteínas, con una talla conservada
entre todos los aislamientos y presente en todas las especies
conocidas de Anaplasma spp., es la MSP5. Tiene un peso
molecular de 19 kDa, es de poca complejidad estructural y muy
importante en el ciclo de vida
celular, aunque se desconoce exactamente su función.
Se encuentra formando un dímero en la membrana, cuyas
subunidades se unen por puentes disulfuros. La proteína
nativa y la recombinante muestran un epitope reconocido por el
anticuerpo monoclonal AnaF16C1 (Visser y col., 1992), presente en
los estadios del parásito en la garrapata y en la forma
intraeritrocítica, utilizándose en ensayos de ELISA
competitivo, para la identificación de los animales
infectados persistentemente (Knowles y col., 1996). Este epitope
induce altos títulos de anticuerpos en todas las especies
infectadas, incluyendo bovinos, chivos y carneros (Visser y col.,
1992; Ndung´u y col., 1995; Knowles y col., 1996; Munodzana
y col., 1998; Torioni y col., 1998).

La conservación de la talla molecular de MSP5
entre cepas (Corona 2005), tiene un contraste marcado con el
polimorfismo observado para otras MSPs de A. marginale,
principalmente MSP1a (Allred y col., 1990; Corona y col. 2005) y
MSP2 (Oberle y col., 1988).

Kano y col., (2002), realizaron la
caracterización antigénica de aislados de A.
marginale
de diferentes regiones geográficas de
Brasil y en
todos los aislados estudiados estuvo presente la proteína
MSP5, lo que coincidió con previos estudios realizados que
demostraban la conservación de esta proteína en
aislamientos de América, África e Israel (Visser y
col., 1992; Knowles y col., 1996; Vidotto y col.,
1998).

Oliveira y col., (2003), sugieren que esta
proteína puede ser utilizada como antígeno para el diagnóstico
serológico debido a la conservación de los epitopes
para las células B
entre diferentes aislamientos estudiados, corroborando la
hipótesis de que este polipéptido
tiene una función fundamental en el ciclo biológico
del hemoparásito, estando presente durante las fases aguda
y crónica de la infección bovina (Knowles y col.,
1996).

3. Características de la
enfermedad

3.1. Incidencia mundial de la
enfermedad

La anaplasmosis bovina es una enfermedad
económicamente importante por los enormes gastos que
ocasiona, principalmente en las regiones tropicales y
subtropicales, incluyendo los Estados Unidos,
donde se reporta una mortalidad anual entre 50 000 a 100 000
animales muertos, con un costo de hasta
300 millones de dólares (Palmer y McElwain,
1995).

Un estudio realizado en el norte de Veracruz (México),
mostró que el 69 % del ganado estaba infectado (Cossio y
col., 1997). Esta alta prevalencia está asociada con un
significativo rango de transmisión, pues el 26 % del
ganado que murió en México durante 1995, fue debido
al movimiento de
ganado susceptible a áreas con alta prevalencia de la
enfermedad y por la subsiguiente transmisión de la misma.
Tasas similares de infección, entre el 73 % y 78 % se han
calculado con anterioridad para el ganado de St. Lucia
(Hugh-Jones y col., 1988) y el Salvador (Payne y Scott, 1982),
respectivamente.

La enfermedad se reporta en muchas áreas del
mundo, existiendo datos de la
presencia de anaplasmosis bovina en la India
(Chitravel y col., 1998) y otras regiones de Asia y el
Pacífico, donde es considerada una enfermedad
endémica, causante de pérdidas considerables en el
ganado importado, pues las razas de ganado responden de una
manera muy diferente a una misma infección (http://www.fao.org/docrep/V8300S/v8300sOp.htm).

En Argentina, en el año 2000 se reportó la
existencia de un rebaño donde el 50 % de los animales
tenía anticuerpos contra A. marginale por la prueba
de aglutinación en tarjeta y en el año 2003 se
reportó una alta incidencia de la anaplasmosis, a pesar de
no ser una enfermedad de declaración obligatoria (Spath,
2003). En Colombia
está considerada como de una gran importancia, ya que
constituye una restricción para el incremento de la
productividad
ganadera del país (Benavides y col., 2000; Hans,
2001).

La anaplasmosis bovina se detectó en Suiza, en
una explotación ganadera en dos sitios diferentes, con un
8.2 % de muestras positivas por ELISA (Kinhm, 2002). En South
África se reportó un 50-75 % de prevalencia de
infección (Masika y col., 1997). En Venezuela se
observó una muy alta incidencia de la enfermedad (Melendez
y Forlano, 1997) y en el estado de
Paraná, en Brasil, se reportaron valores de
87.6 % de animales positivos en una región donde la
anaplasmosis es endémica (Vidotto y col.,
1998).

En Cuba, durante
los primeros años de la década de los 90 la
anaplasmosis bovina se presentaba como una de las primeras causas
de mortalidad en el ganado adulto. Solamente en el año
1993 se estimó una pérdida superior a los dos
millones de dólares (según datos de la Dirección de Medicina
Veterinaria de
Cuba).

A comienzos de la década del 2000 se observa un
cambio
positivo con relación a la enfermedad, reportándose
en los comienzos de este año una morbiletalidad de un 10 %
por la enfermedad (Informe Primer
Trimestre, IMV 2000). Esta situación esta dada porque a
partir del período especial, en nuestro país
existió un cambio en el componente racial de la ganadería,
con el predominio de animales más resistentes a las
garrapatas, unido a la incorporación de nuevas
tecnologías en el control de
ixodidos, como la vacunación contra Boophilus
microplus
con la vacuna recombinante Gavac, y la
combinación de ésta con baños garrapaticidas
programados. Esto permitió disminuir la población del vector hasta niveles que
garanticen la premunición en los animales menores de nueve
meses, aspecto este que resulta importante estudiar desde el
punto de vista epizootilógico, para lo cual se hace
imprescindible contar con técnicas
diagnósticas sensibles y específicas.

3.2. Transmisión

El estudio de la transmisión de A.
marginale
es de fundamental importancia para establecer un
control efectivo de la enfermedad. Son amplias y muy variadas las
formas en que puede transmitirse el parásito y dependen de
la presencia de vectores
(biológicos y mecánicos), la existencia de animales
susceptibles y de condiciones ecológicas favorables
(Palmer y McElwain, 1995).

Esta enfermedad puede ser transmitida por
artrópodos hematófagos tales como algunos
géneros de garrapatas (Yeruhan y Braverman, 1981),
principalmente Boophilus spp. y Dermacentor spp.
(Kocan y col., 1986; Zaugg y col., 1986; Potgieter y col., 1993),
moscas de establo, Stomoxys calcitrans (Yeruham y
Braverman, 1981) y mosquitos Siphona spp. y
Psophona spp.; tábanos, Tábanus spp.
(Ristic, 1968) y por la forma iatrogénica que
también juega un papel muy importante en la
diseminación de la enfermedad a través de material
quirúrgico contaminado (Palmer y col., 2000). A pesar de
esto, Kessler, (2001), planteó que la capacidad de
transmisión de Anaplasma marginale por insectos
hematófagos debe ser objeto de posteriores estudios, antes
de considerarlos como vectores epidemiológicamente
importantes.

Las vías más importantes de
transmisión de la enfermedad son: la mecánica en la que se introducen
directamente los eritrocitos infectados, ya sea por
inoculación natural a través de picaduras de
artrópodos hematófagos parasitados o
artificialmente con objetos punzantes contaminados (Richey y
Palmer, 1990) y la transmisión vertical de tipo
placenta-feto, cuando
la madre sufre anaplasmosis aguda (Zaugg, 1990). Este autor
demostró que A. marginale, podía, en el
segundo y tercer trimestre de gestación, atravesar la
barrera placentaria e infectar al feto y que probablemente esto
no sucedía dentro de los eritrocitos, sino que era una
fase extraeritrocitaria del parásito. Según Rey y
col., (2003), la vía de transmisión trasplacentaria
debe ser tomada en cuenta como factor de riesgo en zonas
donde la anaplasmosis es endémica.

Kessler, (2001), reportó sus consideraciones
acerca de que las garrapatas del género
Boophilus son el vector biológico principal de la
transmisión de la anaplasmosis en Brasil, teniendo en
cuenta que la transmisión iatrogénica
(transfusiones de sangre,
intervenciones clínicas a la masa bovina, y la
vacunación masiva) puede ser evitadas con las medidas
higiénicas. En Cuba, aunque no se han realizado estudios
de la transmisión de la enfermedad, el principal vector
involucrado en la transmisión parece ser garrapatas del
género Boophilus, teniendo en cuenta que este
género es el más extendido en nuestro
país.

Es necesario identificar los factores que influyen en la
transmisión y desarrollo de este patógeno en las
garrapatas para facilitar el mejoramiento de estrategias para
el control de la enfermedad (Walade y col., 1996). La
transmisión se logra fundamentalmente por transferencia de
garrapatas infectadas y puede ocurrir de forma intraestadial y
transestadial, para lo cual el macho juega un papel relevante en
este proceso (Zaugg
y col., 1986).

La transmisión del microorganismo
a través de las diferentes especies de garrapata puede
ocurrir de forma transestadial, es decir, de larvas a ninfas y de
ninfas a adultos (Kocan y col., 1981; Kocan y col., 1986).
Además puede ocurrir del estado de
larva a adulto sin reexposición en el estadio como ninfa y
por adultos machos que se transfieren del ganado infectado a otro
susceptible.

Algunas cepas de A. marginale infectan a las
garrapatas (Idaho, Virginia, aislados de Washington); sin
embargo, aparentemente otras no las infectan (Illionis, Florida)
(Smith y col., 1986; Wickwire y col., 1987; Zaugg y col., 1996),
por razones que no se conocen, pero que apoyan las evidencias
existentes de la variación antigénica del
parásito.

A diferencia de los pequeños cuerpos de
inclusión que contienen de cuatro a seis rickettsias en
los eritrocitos bovinos, grandes colonias que contiene muchos
organismos se observan en las garrapatas infectadas naturalmente.
El ciclo de desarrollo del microorganismo comienza en las
células del intestino medio con la subsecuente
infección de las células musculares del intestino.
El desarrollo final ocurre en las glándulas salivares,
desde donde la rickettsia se transmite al huésped
vertebrado. En cada sitio de desarrollo en la garrapata, A.
marginale
se multiplica dentro de inclusiones unidas a las
membranas, llamadas colonias. Cada ciclo involucra dos estadios:
una forma reticulada o vegetativa y la forma densa infectiva. La
forma reticulada que se divide por fisión binaria es
observada primero, dentro de las colonias, que posteriormente se
condensan para dar lugar al estado electrodenso capaz de
sobrevivir fuera de las células e infectar a otras (Kocan
y col., 1996).

En cuanto a la existencia de animales susceptibles se
describen infecciones subclínicas en búfalos de
agua, ovinos y
caprinos (Cossio y col., 1997). En bisontes se observó
parasitemia moderada con respuesta a anticuerpos
específicos, demostrándose la secuencia de
infección bovino-bisonte-bovino (Chitravel y col., 1998).
La rickettsia se detectó en la sangre de alces (Cervus
elaphus
) infectados, pero no se notó signos
clínicos de la enfermedad (Zaugg y col., 1996,
García y col., 1998). Estos resultan susceptibles a la
infección con A. marginale y A. ovis
y su sangre, infectada con ambos hemoparásitos es
infectiva para bovinos y chivos susceptibles, por lo que lo
constituyen un reservorio (Zaugg y col., 1996).

Todo el ganado es potencialmente susceptible a la
infección con Anaplasma marginale, aunque ciertas
razas desarrollan resistencia a las
garrapatas, e inducen un decremento en la transmisión. Los
portadores crónicos asintomáticos y otros animales
resistentes son responsables también de preservar el
agente etiológico en la naturaleza
(Blood y col., 1983).

Palmer y col., (2001), reportaron la presencia de
sólo un genotipo de A. marginale en los
bovinos infectados. de la Fuente y col., (2002b), han reportado
que en A. marginale ocurre exclusión de la
infección en los eritrocitos bovinos y en las
células de garrapatas, resultando en el establecimiento de
sólo un genotipo, siendo el primer reporte de
exclusión de la infección para A. marginale
y especies de Ehrlichias. Recientemente se demostró
que la exclusión de la infección con genotipos de
A. marginale también ocurre en garrapatas
experimentalmente infectadas, así como en bovinos y en el
cultivo de células de garrapatas, resultando en el
establecimiento de solo un genotipo por garrapata (de la Fuente y
col., 2003a).

de la Fuente y col., (2003b), demostraron que no ocurre
transmisión no sistémica de A. marginale
desde garrapatas infectadas a no infectadas, por lo tanto, esto
no parece ser un medio de transmisión de A.
marginale
. La infección en las garrapatas machos no se
incrementa mientras conviven con las garrapatas hembras, por lo
tanto, la coalimentación de Dermacentor spp. adulta
parece no influenciar en la dinámica de transmisión de A.
marginale
.

3.3. Patogenia y síntomas
clínicos

A. marginale es estrictamente intracelular, un
parásito obligado que infecta al eritrocito bovino y que
raramente se observa fuera de las células. El organismo
penetra por invaginación al eritrocito sin que ocurra
destrucción de las células, se encierra en una
vacuola y se multiplica por fisión binaria en forma de
cuerpo de inclusión, pudiendo observar de dos a tres
cuerpos. El período prepatente durante la
incubación de la enfermedad es de dos a tres semanas y la
duración depende de la cantidad de organismo infectante
(Medellín, 2003).

La enfermedad se caracteriza por marcada anemia
hemolítica, altos niveles de rickettsemia,
disminución del peso, aborto y en
muchos casos la muerte en
animales de más de tres años de edad. La anemia
máxima ocurre de uno a seis días después de
la parasitemia y persiste por cuatro a 15 días, donde
hasta el 75 % de los eritrocitos se pierden de la
circulación. El período de convalecencia es de uno
a dos meses, y está acompañado por incremento de la
hematopoyesis y puede haber recurrencia de la parasitemia. Los
parámetros hemáticos retornan a los normales, pero
los organismos continúan presentes en la
circulación periférica. Los animales que sobreviven
a la infección aguda permanecen como portadores con
continuos ciclos submicroscópicos de rickettsemia que
pueden persistir durante toda la vida del animal (Viseshakul y
col., 2000).

En los portadores vertebrados, A.
marginale invade los eritrocitos maduros con la
formación de una vacuola, derivada de estos, alrededor de
los microorganismos (Francis y col., 1979). Se multiplica y
luego, nuevos organismos salen del glóbulo rojo,
utilizando mecanismos hasta ahora desconocidos pero aparentemente
no líticos (probablemente exocitosis) e infectan los
eritrocitos aledaños. Después que el
parásito entra al huésped bovino el número
de células rojas infectadas se duplica entre las 24 y 48
horas siguientes. La infección puede detectarse por
microscopía entre 20 y 40 días después de la
transmisión, dependiendo del número de
microorganismos transmitidos y de la virulencia del aislado
(Richey, 1981).

Un animal infectado no presenta síntomas
clínicos hasta que más de un 15 % de los
eritrocitos no hayan sido parasitados. En ese momento, la
parasitemia comienza a incrementarse geométricamente y
posteriormente los eritrocitos infectados se eliminan del
torrente circulatorio mediante fagocitosis por las células
del retículo endotelial del bazo, hígado y
nódulos linfáticos; induciéndose el
desarrollo de una fase de inflamación aguda. La subsecuente fiebre,
temperaturas de hasta 41° C, es el
primer síntoma clínico de la enfermedad (Richey y
Palmer, 1990). La respuesta febril es seguida de anorexia,
depresión y debilidad muscular,
acompañada de una acidosis severa. La destrucción
continuada de eritrocitos, sin liberación de hemoglobina,
trae consigo palidez mucosal, sangre acuosa y posteriormente
ictericia, pudiendo aparecer anticuerpos antieritrocitarios, lo
que puede exacerbar la anemia. Luego de esta fase aguda se
presenta la hiperaguda, donde ocurre una pérdida
dramática de peso, aborto de vacas preñadas, fallo
cardiopulmonar y muerte
(Alderink y Dietrich, 1981). Estas últimas consecuencias
ocurren con frecuencia al cabo de las 24 a 36 horas del pico de
parasitemia, donde hay infectados hasta un 90 % de los
eritrocitos (Richey y Palmer, 1990).

Los animales que sobreviven a esta fase disminuyen
drásticamente la parasitemia y desarrollan una marcada
respuesta regenerativa a la anemia. No hay evidencias de que
exista una supresión al nivel de médula
ósea. Los parámetros hematológicos retornan
gradualmente a valores normales luego de muchas semanas (Swift y
Thom, 1983).

El ganado recuperado puede permanecer infectado
persistentemente con bajos niveles de parasitemia, que
fluctúa por períodos largos de tiempo. A
estos animales se les denomina portadores asintomáticos de
la enfermedad, en los cuales la enfermedad es difícil de
diagnosticar por los métodos
tradicionales (Visshakul y col., 2000).

Estos animales afectados pueden desarrollar la forma
crónica de la enfermedad sin manifestaciones
clínicas. Esta forma además de presentarse como
secuela de la convalescencia de las infecciones agudas,
también puede ser el resultado de una infección
inducida con cepas atenuadas (premunización) (Palmer y
McGuire, 1995).

Las huellas postmortem que deja esta enfermedad son
atribuidas fundamentalmente a la anemia hemolítica severa.
El bazo frecuentemente está agrandado y se torna de
color rojo
marrón. Son comunes la hepatomegalia y un engrandecimiento
de la vesícula biliar, con bilis oscura. Si el animal ha
muerto en estadios tardíos de la infección aguda se
puede presentar el íctero (Richey y Palmer,
1990).

3.4. Inmunidad y resistencia

El ganado puede contraer la enfermedad a cualquier edad,
sin embargo la mortalidad y severidad aumentan con la misma. Los
terneros de menos de 6 meses exhiben una resistencia natural,
pues aún cuando se infectan, raramente exhiben los signos
clínicos (Alonso y Blandino, 1988). El ganado entre 6
meses y tres años comienza a incrementar el padecimiento y
ocurren más muertes con el avance de la edad. En general
la parasitemia y la anemia son menos graves en los animales
jóvenes, posiblemente debido a que la respuesta inmune
celular es mayor por la competencia del
timo, el sistema hematopoyético es más activo y por
el papel más activo de la hemoglobina fetal (Richey y
Palmer, 1990).

A. marginale induce en el organismo
respuesta humoral y mediada por células, sin embargo, los
anticuerpos al parecer juegan un papel menos importante
(Bautista-Garfias y col., 2000). Los animales infectados
desarrollan anticuerpos, fundamentalmente del tipo IgG e IgM, y
exhiben durante las últimas etapas de la infección
aguda una respuesta mediada por células, en la que
aparecen los macrófagos activados segregando
IFN-g , que estimula fuertemente la
proliferación de linfocitos de sangre periférica
(Galade y col., 1996). La respuesta celular se correlaciona
parcialmente con el desarrollo de la inmunidad. En contraste, la
respuesta humoral se correlaciona pobremente con el desarrollo de
resistencia. Sin embargo, existen antígenos claves de
A. marginale que estimulan la producción de anticuerpos neutralizantes,
por lo que la respuesta humoral juega algún papel en el
desarrollo de la inmunidad contra la anaplasmosis (Richey y
Palmer, 1990; de la Fuente y col., 2002a).

El estudio de los mecanismos inmunes protectores contra
A. marginale se focaliza fundamentalmente en la fase aguda
de la enfermedad. Palmer y col., (1999) plantearon la
hipótesis de que
la eliminación de A. marginale requiere de la
inducción de niveles altos de anticuerpos
de la subclase IgG2 dirigidos contra los epitopes B de
la superficie del microorganismo. Así mismo, sugirieron la
activación de los macrófagos, mediada por
células T CD4+, que llevan a la
opsonización, fagocitosis y destrucción del
patógeno (Bock y col., 1997).

El ganado que se recupera de una infección aguda
y que por tanto ha tenido una infección preinmune por un
aislamiento medianamente virulento de A. marginale o A.
centrale
desarrolla resistencia a una reinfección con
la misma cepa. En algunos casos el ganado recuperado queda
desprotegido o parcialmente protegido contra aislamientos
heterólogos (Richey y Palmer, 1990).

Factores solubles de células mononucleares
(linfocitos y monocitos) de la sangre de ganado infectado,
reducen la proporción de eritrocitos que contienen
organismos viables "in vitro", indicando que puede ocurrir
un mecanismo independiente de anticuerpos para el control de la
rickettsemia durante la anaplasmosis aguda (Wyatt y col., 1996).
A pesar de que ante la invasión de este parásito
median ambas respuestas, el sistema inmune del hospedero es
incapaz de eliminar completamente la infección en la fase
crónica de la enfermedad. Esto podría deberse a la
variabilidad antigénica de este microorganismo. Se ha
visto que tanto en la fase aguda como en la crónica hay un
comportamiento
de aumento y disminución de los niveles de eritrocitos
infectados, lo cual sugiere que participan los mismos mecanismos
de respuesta primaria del hospedero para controlar ambos ciclos
de rickettsemia (Kieser y col., 1990).

3.5. Epidemiología. Tratamiento y control de
la anaplasmosis

La existencia de inmunidad previa, la velocidad de
transmisión y la edad a la que ocurre el primer contacto
con el parásito (primoinfección), determinan el
efecto clínico que causará este contacto entre el
huésped y el parásito. El cuadro clínico
típico de la infección aguda por A.
marginale
ocurre únicamente en animales adultos
susceptibles cuando se transportan a regiones endémicas.
En los sitios donde las garrapatas son abundantes la
epidemiología de esta enfermedad se caracteriza por la
estabilidad enzoótica, que implica la presencia de un alto
porcentaje de ganado infectado, con la rara ocurrencia de la
enfermad clínica (Benavides, 1985). Esta relación
se mantiene debido a dos factores: la inmunidad pasiva
(anticuerpos), proveída por el calostro y la temprana
infección de los terneros, los que se demostró que
poseen resistencia innata hasta cerca de los nueve meses de edad.
Durante esta edad los animales adquieren la infección sin
presentar los signos aparentes de la enfermedad y la inmunidad
resultante, una vez establecida, es mantenida en el ganado adulto
mediante reinfecciones, sin síntomas clínicos
(Cetrá y col., 2000).

En regiones donde la población de garrapatas se
reduce artificialmente con un intenso control, se rompe el
equilibrio,
pues no todos los terneros se infectan antes de los nueve meses
de edad, creando así un segmento de ganado susceptible,
que muy posiblemente desarrollarán la enfermedad
clínica aguda cuando tengan contacto con el
hemoparásito tiempo después. Esta situación
es conocida como inestabilidad enzoótica, en la cual la
enfermedad se vuelve periódicamente aparente, coincidiendo
con períodos favorables para la reproducción de las garrapatas (Benavides,
1985).

Hasta la fecha no se cuenta con un procedimiento
efectivo para el control de la anaplasmosis en muchas
áreas, a pesar del incremento de los portadores, animales
susceptibles, vectores de transmisión y de las cuantiosas
pérdidas económicas que provoca (Palmer y col.,
1999). Los métodos de control para la anaplasmosis no han
cambiando marcadamente durante los últimos 50 años
e incluyen el control de los artrópodos, la
quimioprofiláxis, la vacunación, y el mantenimiento
de los rebaños libres de Anaplasma (Guglielmone y col.,
1996; Kocan y col., 2000).

En nuestro país el control de la anaplasmosis se
ha llevado a cabo fundamentalmente mediante tratamiento
terapéutico, uso de insecticidas y acaricidas y más
recientemente con el uso de la vacuna recombinante contra B.
microplus
(Gavac) (2do Taller Nacional de Control
de la garrapata, La Habana, Cuba, 2000).

En muchos casos la infección se controla, en
parte, por la
administración de bajas dosis de tetraciclina y se
estudió el efecto de ésta en el cultivo de
células de garrapata, quedando demostrada su utilidad para la
evaluación de nuevos antibióticos en
el control de la anaplasmosis (Blouin y col., 1998). En los casos
clínicos severos se hace necesaria la terapia de soporte,
mediante la aplicación de hidratantes,
antihistamínicos y analgésicos para eliminar de
manera efectiva los estados de portador (Medellín,
2003).

El ganado que se recupera de la infección aguda
desarrolla inmunidad protectora, que puede inducirse con vacunas
muertas (Montenegro-James, 1991). Sin embargo, la
producción de vacunas a partir del microorganismo muerto o
de su fraccionamiento, resultó poco conveniente e
incosteable, ya que no se había logrado establecer un
cultivo ² in vitro² donde pudiera replicarse el
parásito, lo que obligaba al uso de bovinos vivos.
Según Blouin y col., (1998), la propagación de
A. marginale en una línea celular derivada de
Ixodes scapularis, con potencialidad para ser utilizada
como antígeno, constituye un avance importante para el
desarrollo de una vacuna mejorada contra la anaplasmosis bovina.
Sin embargo, no se debe dejar de tener en cuenta la variabilidad
antigénica que se presenta en aislados de regiones
geográficamente diferentes.

4.
Diagnóstico de la enfermedad

El control de la anaplasmosis, además de requerir
de una vacuna efectiva, necesita de métodos de
diagnóstico que permitan conocer la prevalencia del
microorganismo en las diferentes zonas de los países
tropicales y subtropicales, además que permitan
identificar de forma segura a los animales portadores para el
movimiento de animales a zonas libres del hemoparásito
(Camacho y col., 2000).

El diagnóstico diferencial de fiebre, anemia
hemolítica aguda e icterus en el ganado adulto incluye
babesiosis, eperytrozoonosis, theileriosis, leptospirosis,
hemoglobinuria bacilar, hemoglobinuria postparto, toxicidad por
plantas y
ántrax. La ausencia de hemoglobinuria en caso de anemia
aguda, apoyada por la identificación positiva del
eritrocito parasitado, diferencia estas otras enfermedades
hemolíticas de la anaplasmosis clínica (Richey y
Palmer, 1990).

El diagnóstico de la anaplasmosis se dificulta
debido fundamentalmente a lo difícil de detectar los
portadores, ya que no hay síntomas clínicos que lo
diferencien de los bovinos no infectados y los cuerpos de
inclusión dentro de los glóbulos rojos no son lo
suficientemente numerosos como para ser detectados por los
métodos tradicionales (Aboytes-Torres y Buening, 1990;
Masika y col., 1997).

4.1. Identificación del agente

Entre los métodos utilizados para la
detección del agente podemos citar la
subinoculación de eritrocitos infectados en animales
esplenectomizados, la tinción de Giemsa a los frotis de
sangre, ELISA que detecta antígeno y las técnicas
moleculares, como hibridación de ácidos
nucleicos y PCR (World Organization for Animal Health,
2000).

4.1.1. Estándar de oro

Para la detección de animales infectados
persistentemente el método que
se considera el estándar de oro, consiste
en la subinoculación de eritrocitos infectados con A.
marginale
, a animales susceptibles esplenectomizados. Sin
embargo, este procedimiento no es práctico en las pruebas de
rutina (Luther y col., 1980) por la manipulación
quirúrgica que conlleva y porque proporciona poca información sobre los niveles de
parasitemia (Visser y Ambrosio, 1987).

4.1.2. Tinción con Giemsa a los frotis de
sangre

Entre otras técnicas utilizadas para detectar el
organismo se incluye la tinción con Giemsa a los frotis de
sangre (Gainer, 1961). Sin embargo, cuando el animal está
en la fase crónica o en el estadio de portador no expresa
un elevado nivel de parasitemia como para ser detectado por la
tinción (Trueblood y Palmer, 1998).

La tinción con Giemsa es un método
confiable, barato y capaz de detectar niveles de parasitemia de
0.1 a 0.2% (Eriks y col., 1989), o sea sólo pude detectar
niveles mayores a 106 eritrocitos infectados por
mililitro de sangre (Gale y col., 1996), además, resulta
tedioso, no apropiado para un gran número de muestras e
incapaz de discernir con facilidad cuando el eritrocito
está invadido por A. marginale o por A.
centrale
(Visser y Ambrosio, 1987).

La tinción mediada por anticuerpos puede ser
utilizada como una técnica de tinción alternativa.
Su mejor aplicación es para detectar A. marginale
en muestras de sangre tomadas post-mortem para lo que muestra ser
más sensible que la tinción con Giemsa para este
propósito (Johnston y col., 1980).

4.1.3. ELISA para detectar
antígeno

El ELISA para detectar antígeno se
desarrolló en el Laboratorio
Internacional para la Investigación de enfermedades de animales
en Kenya, y en la Universidad de
Washington, en los Estados Unidos, mostrando alta sensibilidad y
especificidad, además de poder ser
diseñado de diferentes maneras (Harlow y Lane,
1988).

El ensayo ELISA
desarrollado para detectar antígeno, utilizando
anticuerpos monoclonales para epitopes conservados de la
proteína de superficie MSP1, logró discriminar
entre anaplasmosis y otras enfermedades hemoparasíticas
clínicamente similares, sin embargo, la sensibilidad de
este ensayo no fue mayor de 0.01 (1,1 % de parasitemia), por lo
que la prueba no resultó idónea para la
detección de portadores (Trueblood y col.,
1991).

4.1.4. Técnicas moleculares

Las sondas de ácidos nucleicos, las cuales
hibridan solamente con su secuencia complementaria, constituyen
una prueba sensible y específica para el
diagnóstico (Engleberg y Eisenstein, 1984). Además
la intensidad de la señal de hibridación obtenida
se correlaciona con el número de parásitos, dando
información del nivel de parasitemia. (Barbet y col.,
1986; Wirth y col., 1986).

En el diagnóstico de A. marginale se han
utilizado sondas de ADN
genómico (Ambrosio y Potgieter, 1987) y recombinantes,
basadas en ADN (Visser y Ambrosio, 1987; Goff y col., 1988) o ARN
(Eriks y col., 1989), pero en ocasiones la limitada sensibilidad
de la sonda prohíbe la detección de portadores
sanos con muy bajo nivel de parasitemia (Shompole y col.,
1989).

Con una sonda de ARNm derivada del gen
msp1a , se logró mejorar
la sensibilidad detectándose niveles de parasitemia entre
0.0025 y 0.000025 % en los portadores sanos. Esto hace que la
prueba sea 4000 veces más sensible que la microscopia
óptica,
además de que es capaz de detectar la infección en
estadios tempranos, lo que resulta de gran importancia para
evitar las pérdidas que ocasiona esta enfermedad (Eriks y
col., 1989).

La sensibilidad de este ensayo resultó
útil para la detección de niveles de
infección en garrapatas y para la identificación de
ganado persistentemente infectado, además de determinar la
prevalencia e incidencia de garrapatas infectadas en áreas
enzoóticas. El uso de esta sonda ayuda a las estrategias
de control racional de la garrapata, combinado con la
vacunación, para reducir los daños de la enfermedad
(Goff y col., 1988).

Kocan y col., (1998), desarrollaron una sonda de ADN no
radioactiva para detectar A. marginale en ganado y
garrapata, mostrando igual sensibilidad y especificidad que las
sondas radioactivas, además de poder ser utilizada en la
hibridación "in situ ".

La sensibilidad y especificidad del PCR resultan de gran
valor para la
identificación de patógenos de vectores
artrópodos. Este método ha detectado R.
typhi
y B. burgdorferi en artrópodos,
además de ser utilizado para la identificación de
garrapatas infectadas con el aislamiento Virginia de A.
marginale
, usando cebadores diseñados a partir de la
secuencia nucleotídica del gen msp1b del aislamiento Florida. Puede ser utilizado
para estudios epizootiológicos de garrapatas de campo, en
la cual la infección puede ser difícil de detectar
por otros métodos. (Stich y col., 1991; Stich y col.,
1993).

La infección persistente de A. marginale
en ovejas fue caracterizada por Palmer y col., (1998), utilizando
el PCR (gen msp5), pudiendo observar un patrón de
persistencia similar al del ganado bovino. Figueroa y col.,
(1993), desarrollaron una PCR múltiple para la
detección de B. bovis, B. bigemina y A.
marginale
a partir de sangre de bovino, con buenos
resultados.

Torioni y col., (1998), optimizaron un PCR ² nested² acoplado con análisis de secuencia e hibridación
para identificar el gen msp5 de A. marginale, siendo capaz
de detectar hasta 30 eritrocitos infectados por mililitro de
sangre, lo cual lo hace de 10-100 veces más sensible que
los PCR previamente descritos, sondas de ARN y ensayos de
hibridación (Eriks y col., 1989; French y col., 1998; Gale
y col., 1996; Ge y col., 1996; Ge y col., 1997). El PCR
² nested² unido con la hibridación
resulta un método altamente sensible y específico
para detectar animales infectados con A.
marginale
.

Georges y col., (2001) desarrollaron un método de
hibridación reversa y PCR (RLB) de las regiones 16S
ó 18S del ARNr para la detección de
hemoparásitos en bovinos, demostrando una gran prevalencia
de infecciones mezcladas, lo que indica que animales infectados
con Babesia spp., estaban también infectados con
Theileria spp. ó Anaplasma spp. Un PCR
simple basado en el gen msp1a ha
logrado diferenciar A. marginale en Norte América,
pero no se ha probado con aislados de otros lugares (Palmer y
col., 2001).

Como parte de nuestros resultados en esta
temática, contamos con un ensayo de
PCR capaz de detectar hasta un 0.000025% de parasitemia (Corona,
2005) permitiendo diagnosticar A. marginale en
animales sin manifestaciones clínicas de la enfermedad, lo
cual significa contar con una poderosa herramienta para su
utilización en diferentes estrategias de monitoreo y
control de la enfermedad.

4.2. Diagnóstico
serológico

Las pruebas serológicas son de gran importancia
para estudios epidemiológicos con el objetivo de
caracterizar áreas de estabilidad e inestabilidad
enzoótica. La aplicación de estas pruebas resulta
relevante en lugares donde se practique el control intensivo de
garrapatas, en los centros de inseminación y transferencia
de embriones, así como en los lugares donde se produzcan
animales de elite o reproductores puros, relacionados
también con la industria
lechera ().

El diagnóstico serológico incluye pruebas
como fijación del complemento, aglutinación en
tubos capilares, aglutinación rápida en tarjeta,
ensayos de IFI, y las pruebas Dot-ELISA y ELISA. Las pruebas
serológicas como fijación del complemento y
aglutinación en tarjeta, son los métodos más
comúnmente utilizados para detectar animales infectados
con A. marginale en el campo y fueron métodos
aceptados para el movimiento de animales a nivel internacional
(Word
Organization for Animal Health, 2000).

Todos estos ensayos para la detección de
anticuerpos utilizan antígenos crudos obtenidos de A.
maginale
parcialmente purificado, lo que provoca que se
pierda la sensibilidad y especificidad que se requiere para un
diagnóstico eficaz (Montenegro-James y col., 1985, Kocan y
col., 1996). Una parte de los errores que se cometen con estos
ensayos, se debe a los resultados falsos positivos, causados por
la
contaminación con eritrocitos y la presencia de
anticuerpos antieritrocitos en el suero de algunos animales. La
frecuencia de anticuerpos contra los eritrocitos se ve
marcadamente aumentada en el suero de los animales vacunados con
vacunas derivadas de
sangre, tales como las que se utilizan para Babesia spp.
(Duzgun y col., 1988). Otra parte de los errores, se deben a las
reacciones falso negativas, provocadas en algunos casos por la
baja sensibilidad del método o porque algunos ensayos como
el de fijación de complemento, no detectan todos los
isotipos de las inmunoglobulinas (McGuire y col.,
1979).

4.2.1. Fijación del complemento

Esta prueba utiliza el proceso estándar de
fijación del complemento. El antígeno consiste de
cuerpos de Anaplasma que han sido separados del eritrocito
por lisis, aunque se utiliza también una técnica
que requiere solo pequeñas cantidades de los reactivos
(Avon, 1974)

La fijación del complemento ha sido uno de los
métodos más utilizados para detectar animales
infectados con A. marginale, en el campo (González
y col., 1978). A pesar de que esta técnica ha sido
utilizada por muchos años, existen evidencias de que le
falta sensibilidad y tiene errores por su limitada habilidad para
detectar bajos niveles de anticuerpos. Puede ser utilizada como
una prueba de monitoreo, pero no para los programas de
erradicación, ya que muchos animales infectados pueden ser
diagnosticados como negativos, pues no es capaz de detectar
anticuerpos contra A. marginale en animales portadores
(McElwain, 2000). Existen otras desventajas entre las que se
encuentran la complejidad y laboriosidad que requiere y la baja
especificidad y sensibilidad, sobre todo en países donde
hay presentes enfermedades hemoprotozoarias (Palmer y col.,
1986).

4.2.2. Pruebas de aglutinación

Se han descrito dos pruebas de aglutinación: la
aglutinación en tubos capilares y la aglutinación
rápida en placa (Amerault y col., 1972). En ambos casos el
resultado es leído como positivo o negativo, pero no
determina título de anticuerpos. Este último puede
llegar a rendir un 2 % de falsos positivos y 16 % de falsos
negativos en un estudio controlado. Esta técnica puede ser
desarrollada en el laboratorio o en el campo, dando el resultado
en muy pocos minutos, pero como se dijo anteriormente, existe un
gran problema con las reacciones no específicas (Teclaw y
col., 1985).

4.2.3. Inmunofluorescencia indirecta de anticuerpos
(IFI)

Esta prueba ha sido utilizada para el diagnóstico
de anaplasmosis y frecuentemente se ha considerado una prueba
sensible, sin embargo, por sus características en
ocasiones se considera no útil, pues pueden ocurrir
reacciones falsas positivas, que se atribuyen al largo
período de incubación de esta enfermedad (Goff y
col., 1988).

Goff y col., (1988) y Montenegro-James y col., (1985)
reportaron ensayos de IFI, los cuales presentan un número
alto de reacciones falsas positivas y un alto fondo de
fluorescencia. McGuire y col., (1984), realizaron una IFI donde
utilizaron como antígeno una muestra cruda de A.
marginale
, contaminado con membranas eritrocitarias, dando
una serie de resultados falsos positivos y falsos negativos en el
ganado infectado agudamente y en el convaleciente; en el ganado
persistentemente infectado arrojó un porciento de falsos
negativos. Así mismo, la IFI ha sido utilizada para
estudios epidemiológicos (Duzgun y col., 1988; Jongejan y
col., 1988).

4.2.4. Dot- ELISA y ELISA

Se han desarrollado pruebas ELISA para identificar
anticuerpos contra A. marginale en suero bovino (Duzgum y
col., 1988; Ndung’u y col., 1995; Knowles y col., 1996). El
ELISA es una prueba sensible, específica y brinda la
posibilidad de una mejor interpretación de los resultados, comparada
con las técnicas antes mencionadas (Duzgum y col., 1988).
En 1986, Palmer y McGuire realizaron un ELISA utilizando la
proteína MSP3, pero actualmente se ha comprobado que
ésta presenta epitopes comunes con A. ovis y no se
encuentra conservada entre los diferentes aislamientos de
A. marginale por lo que el uso, en el
diagnóstico en general, de la proteína nativa o
recombinante no es recomendado (Alleman y Barbet, 1996). El uso
de la proteína MSP5 como antígeno ha mostrado
buenos resultados en la detección de diferentes especies
del género Anaplasma (Ndung'u y col.,
1995).

Otros ensayos inmunoenzimáticos usan como
antígeno epitopes del polipéptido MSP1 (Trueblood y
col., 1991) y cuerpos iniciales de A. marginale,
dando este último reacción cruzada con A.
centrale
(Nakamura y col., 1989). Este tipo de
antígeno también se ha usado en pruebas Dot-ELISA
obteniéndose buenos resultados (Montenegro-James y col.,
1992).

Para mejorar los parámetros de sensibilidad y
especificidad se han desarrollado técnicas de
diagnóstico utilizando anticuerpos monoclonales (Trueblood
y col., 1991) y antígenos recombinantes (Knowles y col.,
1996; Torioni y col., 1998). El establecimiento de un ensayo de
ELISA competitivo (Torioni y col., 1998), utilizando la
proteína recombinante MSP5, permitió el incremento
de la sensibilidad a un 96 % y la especificidad de un 95 %,
pudiendo detectar las infecciones persistentes del
parásito, por lo que los autores sugieren esta
técnica para estudios epidemiológicos, programas de
erradicación y para la regulación internacional
para el movimiento del ganado. La utilización de un rMSP5
cELISA demostró que este es altamente específico
para el diagnóstico serológico de anaplasmosis en
ganado de Norteamérica.

Reyna-Bello y col., (1998), desarrollaron un ensayo
ELISA para el diagnóstico serológico de la
anaplasmosis bovina con la proteína MSP5 de A.
marginale
. El ELISA desarrollado con sueros de campo de
diferentes regiones geográficas de Venezuela mostró
una seroprevalencia de la enfermedad de un 47 %, lo que
coincidió con los resultados de los estudios
epidemiológicos realizados. Estos resultados confirman la
importancia de la MSP5 como un antígeno útil para
el diagnóstico serológico de la anaplasmosis
bovina.

Más recientemente, Bowles y col., (2000), han
desarrollado un ELISA comercial para la detección de
anticuerpos contra A. marginale y A. centrale en
Australia y Zimbabwe, mostrando una sensibilidad y especificidad
en Australia de 100 % y 83.3 %, respectivamente y en Zimbabwe una
sensibilidad de un 100 %, no siendo posible calcular la
especificidad por la poca cantidad de sueros positivos con que
contaban. Estos autores concluyeron que el ELISA es una
alternativa útil para los estudios epidemiológicos
cuando se compara con la prueba de aglutinación en
tarjeta. Braz Junior y col., (2002) desarrollaron un sistema
ELISA para la detección de anticuerpos anti A.
marginale
con un 100 % de especificidad y un 94.87 % de
sensibilidad.

A pesar de los resultados obtenidos con los ensayos de
ELISA, se hace necesaria la existencia de una prueba
diagnóstica que se pueda realizar al lado del animal, que
resulte sensible y específica, para lo cual la
proteína MSP5 recombinante promete ser un fuerte candidato
(Corona, 2005), lo que permitirá un diagnóstico
rápido y efectivo de la enfermedad en el campo. Se deben
tener muy en cuenta las potencialidades que muestran el gen msp5
y la proteína MSP5 de Anaplasma marginale para la
determinación del agente y de anticuerpos contra
éste. Trabajos previos han demostrado que la
proteína MSP5 de A. marginale resulta de gran
utilidad en ensayos de formato ELISA (Torioni y col., 1998), ya
que elimina los problemas
señalados de los antígenos crudos, utilizados en
otras técnicas como la aglutinación en tarjeta y
que el gen msp5 es de gran utilidad para el diagnóstico
molecular, mediante PCR, en animales persistentemente infectados
(Torioni y col., 1998). Este gen y su producto de
expresión son recomendados en el monitoreo de animales
para el movimiento internacional de ganado y en programas de
control de la anaplasmosis bovina (Palmer y McElwain, 1995).

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Autor:

Belkis Corona,

Majela Rodríguez

Siomara Martínez

Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria
(CENSA)

Apartado 10, San José de las Lajas, La Habana,
Cuba.

 

Partes: 1, 2
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