Partes: 1, 2

Categoría II: Animal Miroxénico.

Son comparables a los animales convencionales mantenidos bajo condiciones sanitarias estrictas y estándares. Los mismos albergan una fracción inoculada de microorganismos no patógenos tomadas de la microbiota de un haloxénico; deben mantener o ser del mismo status de la Categoría I y además estar libres de:

• Listeria monocytogenes
• Bacillus piliformis (Clostridium piliformis)
• Estadíos intermedios de Céstodos y de Artrópodos parásitos obligados.
• Especies determinadas demandan la ausencia de los Virus: Ectromelia (Ratón) y Myxomatosis(Conejo).

Categoría III: "Animal Gnotobiótico con microbiota definida "

Son comparables a los animales derivados de cesárea (Axénicos) a los que se les introducen voluntariamente especies microbianas conocidas. Deben ser del mismo status de la Categoría II y además estar libres de:

• Bordetella bronchiseptica
• Toda Pasteurella
• Todas las Coccidias (Eimerias spp) y Helmintos patógenos

Además especies determinadas demandan la ausencia de:

• Streptobacillus moniliformis (Ratones y Ratas)
• Corynebacterium kutscheri (C. murium) (Ratones)
• Streptococcus pneumoniae (Cobayo y Conejo)
• Todas las especies de Mycoplasma (Ratones y Ratas)
• Treponema cuniculi (Sífilis del conejo/Conejo)

Categoría IV: Animal Heteroxénico (Libre de gérmenes patógenos, SPF)

Son comparables a los animales descritos como libres de gérmenes patógenos específicos (Specific Pathogens Free, SPF). Estos son derivados de un Axénico o Gnotobiótico que adquiere una microbiota proveniente de su medio, son mantenidos en Zonas Protegidas (sistemas cerrados). Deben ser del mismo status de la Categoría III y además estar libres de:

• Estreptococos (excepto Grupo D)
• Neumococos
• Helmintos
• Protozoos patógenos
• Virus que afectan estas especies

Además especies determinadas demandan la ausencia de:

• Todas las especies de Mycoplasma (Hamster y Cobayo)
• Fusiformis necrophorus (Conejos)

Categoría V: Animal Axénico (Libre de gérmenes, GF)

Son animales que no albergan ninguna especie microbiana viviente detectable. Los mismos son el resultado del uso de sistemas cerrados estériles y son libres de todo organismo demostrable (virus, bacterias, hongos, parásitos y organismos saprófitos). Son conocidos como animales "Germ Free" o "Axénicos", los cuales son derivados por histerotomía (cesárea) o histerectomía aséptica, criados y mantenidos en un aislador mediante técnicas "Gnotobióticas". Estos animales no siempre se obtienen en la práctica, debido a los agentes transmitidos verticalmente.

Este esquema de clasificación por categorías ha sido sujeto a revisiones regulares y a pesar de algunos cambios menores en cuanto al establecimiento y definición de las entidades microbianas (bacterias, hongos, parásitos y virus) que deben o no estar presentes según la categoría específica, el mismo ha resistido la prueba del tiempo (Laboratory Animals Information, 1987; Poole, 1987; Charles River Laboratory, 1990; Besselsen, 2002).

· Reseña histórica de los animales gnotobióticos

Los términos "Gnotobiología" y "Gnotobiótico" son derivados de las palabras griegas "gnotos": conocimiento y "bio": vida; significa "vida conocida".

La Gnotobiología es la ciencia de la producción de organismos (animales, plantas y humanos) colonizados con especies de microorganismos beneficiosos o dañinos que son conocidos tanto como puedan ser detectados por modernas técnicas de diagnóstico (Charles River Laboratory, 1962; Coates, Cooper, Heine, Kraft, Hedrich, 1992).

Animales gnotobióticos

Los animales gnotobióticos son libres de gérmenes, exceptuando la microbiota específica identificada que ha sido introducida intencionalmente. Son conocidos también como animales de microbiota definida, ya que han sido inoculados con una mezcla bien definida de microorganismos y mantenidos en aisladores para prevenir la contaminación por patógenos. Por tanto, un animal gnotobiótico es un sistema positivamente biológico definido, que comprende el huésped y los co-vecinos. Es una asociación de especies conocidas.

Estos animales son mantenidos en sistemas de aisladores, que han sido químicamente o físicamente esterilizados previo al uso. Igualmente el aire, el agua, el alimento y el encamado deben ser libres de gérmenes al entrar al aislador. Varios aisladores son utilizados en estos procesos.

Los animales gnotobióticos se usan para investigaciones específicas o como un núcleo para las colonias de reproducción, lo cual se conoce como Banco Genético (CCAC, 1984 a; Charles River Laboratory, 1990; Besselsen, 2002).

El término animal libre de gérmenes ("Germ-Free", en terminología inglesa) es comúnmente usado para designar un animal con ausencia de microorganismos, lo cual implica libres de bacterias, hongos, parásitos y virus. Las limitaciones de esta terminología son obviamente dependientes de la validez de las pruebas usadas (Fuller, 1968). Son conocidos también como Animales Axénicos. Este último fue el primer término científico usado para designar individuos de una especie libres de cualquier vida demostrable (Coates & Gustafsson, 1984; Trexler, 1987; Besselsen, 2002).

Principales hechos relacionados con la historia de los animales gnotobióticos

Históricamente, el mérito de la primera experimentación en el tema de libres de gérmenes debe dársele a E. Duclaux (1885), quien intentó cultivar frijoles y chícharos en un cultivo puro en un medio estéril. Pasteur al ver los resultados de su discípulo plantea: …"de haber tenido tiempo me hubiera gustado seguir los experimentos para saber si la vida sería posible en esas condiciones", no obstante dirigió toda su atención al problema de la vida libres de gérmenes, fue con Pasteur que se inicia el debate sobre la posibilidad de la vida o no, sin microbios. En la búsqueda de una respuesta los científicos comenzaron a relacionarse con la tecnología Gnotobiotécnica de libre de gérmenes. Al año siguiente (1886) su discípulo Nencki estimó que las bacterias no eran indispensables para la vida, ya que estas producían sustancias tóxicas y que los animales sin gérmenes debían vivir más tiempo que los contaminados (Laboratory Animals Information, 1987; Heinecke, 1990).

No fue hasta 1895 en que Nuttal y Thierfelder obtuvieron por primera vez dos curieles por cesárea mantenidos en una campana estéril durante 2 semanas sin contaminación. En 1899 Schothelius busca otro camino en sus investigaciones con gallinas libre de gérmenes y construye en su laboratorio un local cerrado con cristales a una presión de aire de 9m3 aproximadamente, del cual utiliza 0,5 m3 para crear un espacio donde pueda introducirse una persona y realizar el cambio de ropa. Esta descripción se conoce hoy en día con el nombre de "CUARTO LIMPIO" (Heinecke, 1990).

De aquí en adelante y hasta las tres primeras décadas del siglo XX el propósito primario de todas las investigaciones era dar respuestas a la interrogante de: "sí la vida era posible en ausencia completa de microorganismos" (Laboratory Animals Information, 1987).

A principios del siglo XX Eli Metchnikoff (1901-1903), director del Instituto Pasteur de París, plantea con relación a este tema: …"que la flora no sólo era innecesaria, sino que además era dañina al hospedero". Uno de los estudiantes de Metchnikoff, M. Cohendy (1908) es enviado a aprender las técnicas de la vida libre de gérmenes y en 1912 tiene éxitos en criar pollos libres de gérmenes, conjuntamente con Wollman (1914) en producir curieles libres de gérmenes.

Por otro lado, un estudiante de Cohend, el investigador alemán E. Küster en 1915 empleando un equipamiento especial diseñado por él, mantuvo cabras libres de gérmenes por 35 días contribuyendo de esta manera al establecimiento de la experimentación libres de gérmenes.

Este fue el primer aparato capaz de mantener un ambiente definitivamente estéril permitiendo la manipulación a través de mangas con guantes de goma y la salida y entrada de materiales; a este aparato más tarde se le denominó "AISLADOR" y es similar al equipamiento usado hoy para la obtención de animales gnotobióticos. Su trabajo también es importante al establecer los animales libres de gérmenes como un instrumento valioso en el estudio de la nutrición y las defensas del cuerpo (Laboratory Animals Information, 1987; Heinecke, 1990).

Este primer período sobre la vida libre de gérmenes denominado período Metodológico por Luckey, finaliza con los aportes de Cohendy, Kuster y Guyenot, este último obtuvo moscas libres de gérmenes. Ellos demostraron que la vida sin gérmenes era posible en las moscas, cabras y pollos (Heinecke, 1990).

De 1915 a 1934, existe un período de relativa inactividad, donde se plantea una nueva interrogante: ¿Vale la pena proseguir las investigaciones sobre la vida libre de todo germen demostrable?. Pero es con Küster que el campo de las investigaciones gnotobióticas entra en la era contemporánea.

Gustafsson en Suiza (1948), Miyakawa en Japón (1951, 1953-1958) y Reyniers (1932, 1933), Trexler (1957, 1959) en Estados Unidos, contribuyeron grandemente a la expansión de esta disciplina, con la confección de aisladores o cámaras de paredes rígidas elaborados particularmente con planchas de acero inoxidables, los cuales fueron usados para proteger espacios estériles de trabajo, en muchas de las primeras investigaciones con animales gnotobióticos. Posteriormente grandes progresos se han obtenido en la lactancia artificial, reproducción y crianza de ratones y ratas libres de gérmenes (Reyniers, Trexler, Ervin, 1946; Gustafsson, 1959) y el establecimiento de técnicas libres de gérmenes utilizando aisladores de Cloruro de Polivinilo (PVC) por Trexler y Reynolds (1957), siendo los mismos muy efectivos y donde su visibilidad e iluminación pueden ser controlada desde el exterior (Charles River Laboratory, 1962; Laboratory Animals Information, 1987).

El desarrollo de los experimentos sobre animales libres de gérmenes a partir de la tercera década del siglo XX estuvo decididamente influenciada por los avances tecnológicos sobre los sistemas de aislamiento. El sistema de simple cajas o campanas herméticas fue modificado por compartimentos más resistentes (de metal) y se comenzó a diseñar cilindros de acero inoxidable que eran posibles someterlo a la esterilización por vapor y por tanto, impenetrable a los microbios. Ya entre los años 1945-1960 se comienza la reproducción y utilización de los animales gnotobióticos y en 1961 comienza su comercialización (Laboratory Animals Information, 1987).

Desde esos tiempos una gran variedad de mamíferos, incluyendo las más comunes especies de laboratorio, los roedores, animales de granja y el hombre, han sido criado libres de gérmenes. Dentro de especies obtenidas, los cobayos son comparativamente fáciles de criar libre de gérmenes porque son bastante maduros al nacer y requieren poca o ninguna alimentación a mano. Son reportados pobres niveles de supervivencia para el conejo, otras especies como el perro, peces, monos, gatos, aves, carneros, chiva, cerdos y otras especies de granja han sido obtenidas libre de gérmenes pero por su gran tamaño son difíciles de mantener en aisladores por un largo período de tiempo (Coates et al, 1992).

Un importante uso de estos animales es el proveer el núcleo para las colonias libres de patógenos específicos (SPF) así como en el desarrollo de investigaciones toxicológicas y en la ciencia médica en general. Los animales libres de gérmenes se crían con el propósito de investigar el papel que juegan los microorganismos en la fisiología del organismo, es decir para estudiar al animal por sí, sin la interferencia de su microbiota (Coates & Gustafsson, 1984).

Animales libres de patógenos específicos

Los animales libres de patógenos específicos (Specific Pathogens Free, SPF, en terminología inglesa) se han convertido rápidamente en el estándar mínimo aceptado para la investigación y además están comenzando a ser exigidos por autoridades reguladoras como el status de los animales utilizados en las pruebas de evaluación de productos destinados para uso humano y veterinario (OMS/SIT/823, 1992; Institute of Laboratory Animal Resources [ILAR], 1996; Consejo Canadiense de Protección Animal [CCPA], 1998).

Los animales SPF son colonizados por una variedad desconocida de especies de microorganismos Sin embargo, son definido como libres de uno o varios microorganismos (patógenos) específicos. Por tanto, un animal SPF es un sistema negativamente biológico definido, que comprende el huésped e inquilinos (microorganismos). Es una asociación biológica de una gran variedad de especies microbianas, pero con la explícita seguridad de que una o varias especies patógenas definidas no están presentes (CCAC, 1984 a; Charles River Laboratory, 1990; Besselsen, 2002).

Los animales libres de microorganismos patógenos específicos (LPE o SPF) se caracterizan por poseer una microbiota asociada no patógena y específica para la especie animal en cuestión. Se obtienen por cesárea o histerectomía aséptica, a partir de un animal axénico o gnotobiótico con microbiota definida y son transferidos a un aislador o a un sistema de barreras o zona protegida.

Ya una vez establecidos en una barrera libre de patógenos (Zonas Protegidas), los animales son reproducidos normalmente y una población libre de patógenos es constituida entonces; las nuevas generaciones de animales pueden estar libres de patógenos y mantenidos por sus padres (Charles River Laboratory, 1966; Lane-Petter, 1963 a; Arrington, 1972; Bailly, Bupont, Laroche, Raynaud, 1979; CCAC, 1984 a).

El concepto de LPE o SPF ha revolucionado indudablemente la producción de animales libres de enfermedades, sin embargo, este término no es específico y puede representar una variación en el status muy considerable pudiendo ser desde colonias con una microbiota definida a colonias las cuales han sido libres sólo de uno o dos patógenos conocidos. La designación LPE es en consecuencia de mayor valor en tanto se obtenga una información completa de cual o cuales patógenos la colonia estará libre (Perrot, Richard, Veillet, 1993).

En estudios realizados por Nelson (1960) en animales SPF encontraron que los cambios más favorables son: el aumento del vigor y una mayor tasa reproductiva al compararlos con los animales convencionales. Los ratones SPF son conocidos por ser superiores en experimentos de largos períodos de tiempo, ocurriendo pocas muertes inexplicables (Poole, 1987).

Principales aspectos relacionados con las barreras utilizadas en la cría y mantenimiento de los animales SPF.

Las barreras utilizadas en la cría y mantenimiento de los animales SPF pueden tomar cualquier forma, pudiendo ir desde una lámina plástica flexible (Aislador) hasta un sistema completo de paredes, equipamiento y otros (Zonas Protegidas). La magnitud de esta barrera o zona protegida puede variar, siendo desde un simple local con visor y autoclave hasta un sistema complejo con múltiples locales y pasillos (Brick, 1968; ILAR, 1973; Mahouy, 1978).

Los sistemas de barreras para mantener una colonia SPF son una combinación de factores constructivos, tecnológicos y métodos operacionales que se estabilizan en un ambiente cerrado donde se minimiza la presencia de patógenos o de microorganismos no deseados infectando la población animal (ILAR, 1976).

La producción a gran escala de animales SPF es factible llevarla a cabo en un sistema de barreras. El término general de barrera o zona protegida abarca uno de los mejores métodos para controlar el ambiente en un espacio determinado y para esto se hace necesario contar con diferentes aspectos que deben mantenerse controlados, estos son:

• Temperatura, humedad relativa y luz
• Filtración del aire con presión, lo cual está dado por la inyección del mismo a través de un filtro HEPA con una eficiencia de un 99,9 %. Esta sobrepresión de aire se ajusta en la instalación para prevenir la contaminación (diferencias de presiones / Presión (+)).
• Sistemas de autoclaves, baños germicidas, cilindros de transferencias (Transfer) y taquillas filtros.
• Esterilización del agua (usualmente por filtración, aunque el tratamiento con ozono, la acidificación o halogenización pueden ser empleados o combinaciones de diferentes métodos).
• Esterilización del alimento, encamado y otros insumos (usualmente pasándolos por una autoclave de doble puerta atravesando una pared barrera).
• Esterilización de ciertos utensilios (regularmente realizado por desinfección química empleando potentes desinfectantes, pasándolos o transfiriéndolos hacia el interior de la instalación a través de cilindros de transferencias (transfer) o baños germicidas).
• El personal debe ser altamente calificado y responsable. Sus movimientos dentro de la instalación deben ser pausados y controlados, entrando una vez al día a través de tres entradas. En la primera se quitarán la ropa de calle, realizarán algunos lavados y necesidades fisiológicas (Taquilla Sucia), en la segunda se bañarán de forma completa con agua esterilizada y jabón bacteriostático (Ducha) y en la tercera se vestirán con ropa adecuada de trabajo esterilizada (Taquilla Limpia). La ropa debe cambiarse cada vez que se utilice debiendo ser esterilizada antes de su uso, se emplearán cubiertas de cuello y cabeza, mangas largas, máscaras para cubrir nariz y boca y se utilizarán botas y guantes. La higiene del personal es obligatoria y existirá un programa de salud que incluye: examen médico, análisis de laboratorio microbiológicos y clínicos y vacunaciones periódicas contra enfermedades infecto-contagiosas transmisibles.

(ILAR, 1968, 1973; Veterinary Resources Branch [VRB], 1976; FELASA, 1995, 1999, 2000).

Un último aspecto que se debe tener en cuenta y no por ello menos importante es que debe existir un cuidadoso y persistente monitoreo microbiológico para verificar el estado de salud del animal mantenido en los sistemas de barreras (CCPA, 1998).

III) Control microbiológico a los animales de laboratorio.

La salud de un animal está siempre en riesgo de adquirir una variedad de infecciones, tales pueden ser inaparentes o no por lesiones macroscópicas u obvias. La clínica de una infección puede no ser observada hasta que el animal es estresado, por ejemplo un procedimiento experimental (Kraft et al, 1992, 1993). La mayoría de las infecciones en roedores son subclínicas y a menudo ocurren modificaciones en los resultados de una investigación debido a infecciones naturales en ausencia de infecciones clínicas. Por eso, la ausencia de manifestaciones clínicas de una infección tiene un limitado valor diagnóstico. De ahí que sea imprescindible la prevención de la infección y no solamente la prevención de enfermedades clínicas (Rehbinder et al, 1996, Niclas et al, 2002).

Además de las consideraciones de bienestar, el principal objetivo de un control de salud antes y durante los experimentos, es definir el estado biológico de los animales para tener en cuenta la presencia o ausencia de ciertos microorganismos, lesiones y otras alteraciones como variables experimentales (Rehbinder et al, 1996).

El control microbiológico a los animales de laboratorio se recomienda para detectar la presencia de microorganismos no deseados o para conocer los cambios microbiológicos en el ambiente y así poder evaluar los procedimientos rutinarios de desinfección. El monitoreo periódico a los animales de laboratorio para determinar la presencia de su microbiota no patógena definida implantada voluntariamente o su microbiota no patógena para la especie obtenida espontáneamente o accidentalmente en contacto con el hombre es de gran importancia (Charles River Laboratory, 1966, 1990; ILAR, 1973; Rehbinder & Hansen, 1993).

Existen cuatro razones básicas para incluir un microorganismo particular en un monitoreo de salud:

1. Los microorganismos pueden influir en los resultados de la prueba en los cuales los animales son usados.
2. Los microorganismos tienen una influencia negativa en el status de los animales.
3. Los microorganismos pueden infectar otras especies, incluyendo al hombre.
4. Los microorganismos tienen una influencia negativa en el resultado de la producción de los animales.

(Hansen, 1989).

En un monitoreo biológico para organismos específicos no deseados, existen consideraciones generales, así como aspectos a tener en cuenta como es la frecuencia de los muestreos, el tamaño de la muestra (número de animales a muestrear), el tipo de muestras, el método de examen o el procedimiento para detectar e identificar los organismos específicos, el conocimiento de la sensibilidad y especificidad de los métodos o test usados y el conocimiento de la prevalencia de los microorganismos (Charles River UK. Limited, 1985; Bondy et al, 1987, Armand Frappier, 1990; Gnotobiotes Standards, 1990; IFFA CREDO, 1990; HARLAN OLAC Limited, 1990/1998; HARLAN OLAC UK. Limited, 1998; HARLAN OLAC NEDERLAND, 1998; Hem, Hansen, Rehbinder, Voipio, Engh, 1994; Kraft et al, 1994; Thomann, Wyss-Spillmann, Homberger, 1994; UC Davis, 2004).

Por tanto, todo sistema de control, de monitoreo y de regulaciones que se establezca para la prevención de infecciones y para el control y mantenimiento del status higiénico sanitario de los animales es un aspecto fundamental y debe ser llevado a cabo con gran rigor técnico.

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Biografía del autor

Nombre y Apellidos			Layna de las Mercedes Riera Ojeda
Fecha y Lugar de nacimiento			24/09/1963	Ciudad de la Habana, Cuba
E-mail			, nivian[arroba]censa.edu.cu
Graduado, Fecha y Lugar			Licenciatura en Microbiología			1986	Universidad de la Habana (U.H)
Dirección particular			Calle 3era e/ 4ta y 6ta Edif. 2 apto 8 Rpto La Unión. Boyeros. Ciudad de la Habana. Cuba
Centro Trabajo			Centro Nacional para la Producción de Animales de Laboratorio (CENPALAB). La Habana. Cuba
Fecha incorporación			1986 (más de 20 años de trabajo en el sector)
Otros Títulos
Grado científico		Master en Microbiología Clínica			Fecha: 2001			Lugar: U.H
Categoría Docente		-			Fecha: -			Lugar: -
Categoría Científica o Tecnológica		Tecnólogo de 1er Nivel			Fecha: 2004			Lugar: CITMA. Cuba
Labor que desempeña		Especialista Integral en Microbiología. Jefa del Grupo de Mejora Continua de la Calidad
Líneas de Investigación que desarrolla y las investigaciones más importantes realizadas en los últimos 5 años.
Año	Líneas de trabajo e Investigaciones realizadas
1986-1990	Obtención y control microbiológico de diferentes especies de animales de laboratorio en condiciones gnotobióticas
1986-Actualidad	Estudios de la incidencia de entidades microbianas en animales laboratorio
1990-Actualidad	Normalización de sistemas inmunoenzimáticos ELISA para el diagnóstico bacteriológico en animales de laboratorio
1995, 1999 y 2004-Actualidad	Obtención y evaluación de vacunas bacterianas en animales de laboratorio
2000-Actualidad	Especialista principal en microbiología en la producción de animales gnotobióticos. Implantación del Sistema de Aseguramiento y Control de la Calidad en el CENPALAB
2005-Actualidad	Evaluación y Mejora del Sistema de Aseguramiento y Control de la Calidad en el CENPALAB

 

MSc. Layna Riera Ojeda

Centro Nacional para la Producción de Animales de Laboratorio (CENPALAB). La Habana. Cuba

Diciembre 2006