Monografias.com > Sin categoría
Descargar Imprimir Comentar Ver trabajos relacionados

Importancia y uso actual de las técnicas moleculares en el análisis y tipificación de patógenos (página 2)



Partes: 1, 2

Técnicas moleculares

Las técnicas
moleculares actuales han sido desarrolladas, en solo pocos
años de investigación académica
básica en muchos campos de la ciencia, de
tal manera que en los últimos años, seis de
éstas técnicas han surgido como los métodos
para el análisis y tipificación de los
aislamientos bacterianos.

Ellas son la huella dactilar de plasmidos o PF, el
análisis de endonucleasas de restricción de
ADN de
plasmidos o REA; el análisis de endonucleasas de
restricción de ADN cromosómico utilizando enzimas de corte
y electroforesis convencional; el Polimorfismo de largos
fragmentos de restricción o RFLP utilizando
análisis de pruebas de
ADN; La electroforesis en gel de campos pulsantes o PFGE; y el
AP-PCR y otras técnicas relacionadas con la
tipificación basada en la amplificación de ácidos
nucleicos (Tenover et al., 1997).

La tipificación puede proporcionar información sobre la distribución de tipos microbianos en
poblaciones humanas y animales, lo cual
puede ser aplicado en programas de
vigilancia a nivel local, regional, nacional o global. De
especial interés
pueden ser el monitoreo de marcadores asociados con la
patogenicidad, inmunogenicidad o resistencia a
medicamentos, como se demuestra por ejemplo en la vigilancia del
cólera
con la emergencia de una nueva cepa epidémica en Asia.

En síntesis,
esta aplicación puede incluir análisis
periódicos para la detección de grupos de
patógenos con tipos similares y de origen común en
espacio y tiempo, para
mejorar las advertencias anticipadas de brotes
potenciales.

Asimismo, puede ayudar en la planeación
de servicios de
salud e
intervenciones preventivas como desarrollo de
vacunas y
programas de inmunización.

Estas técnicas también pueden ser usadas
en estudios clínicos para la delineación de
patrones de colonización y para la identificación
de fuentes de
transmisión de microorganismos infecciosos, lo cual puede
contribuir a un entendimiento de la epidemiología y
patogénesis ayudando con ello al desarrollo de estrategias de
prevención de enfermedades (Struelens y
MESGEM, 1996).

La
Huella Dactilar de Plasmidos (PF)

La huella dactilar de plasmidos fue la primera
técnica molecular utilizada como una herramienta de
tipificación. Los plasmidos son elementos de ADN
extracromosómico que están presentes en muchos
aislamientos clínicos y pueden ser identificados por
simples procedimientos de
lisis de células
seguidos de electroforesis en gel de los lisados. El
número y tamaño de los plasmidos presentes es
utilizado como base para la identificación de cepas. Esta
técnica de tipificación de cepas ha sido utilizada
con éxito
en el análisis de brotes de infecciones nosocomiales y en
infecciones adquiridas en comunidad
causadas por una variedad de especies de bacterias
gram-negativas (Tenover et al., 1997).

En general esta técnica es más utilizada
para estudios epidemiológicos que están limitados
tanto temporalmente como geográficamente y puede
complementar otras técnicas como la PFGE, para
proporcionar una base para diferenciar aislamientos que
están relacionados genotípicamente pero que
están separados epidemiológicamente por periodos
moderados de tiempo, como a varios meses (Tenover et al.,
1997).

Análisis de Endonucleasas de
Restricción de ADN de Plasmidos (REAP).

En la actualidad esta técnica es utilizada
principalmente como una alternativa para los aislamientos de
estafilococos que contienen frecuentemente plasmidos
múltiples, y para seleccionar especies de
Enterobacteriaceae que tienen a menudo grandes plasmidos
característicos.

Algunas cepas de bacterias contienen solamente un
plasmido grande, de un rango de tamaño de 100 a 150
Kilobases (kb). Debido a que es difícil de diferenciar
plasmidos en este rango de tamaño, especialmente los que
varían solamente de 10 a 15 kb, algunos investigadores han
adicionado una endonucleasa de restricción para aumentar
el poder de
discriminación de la electroforesis en gel
de agarosa. Esto puede ser útil cuando los plasmidos
grandes producen muchos fragmentos de restricción que
puede hacer la interpretación más difícil,
especialmente cuando están presentes plasmidos
múltiples grandes (Tenover et al.,
1997).

Actualmente, la REAP ha mejorado en su reproducibilidad
y poder de discriminación por lo que es la
técnica preferida de tipificación de plasmidos y es
de particular interés para la realización de
estudios epidemiológicos de infecciones institucionales
con organismos resistentes a múltiples
antibióticos. Utilizado conjuntamente con
delineación clonal por tipificación de ADN
cromosómico, es esencial para localizar la
diseminación de genes de resistencia antibiótica
móviles como los que codifican los beta-lactamasa de
amplio espectro (Struelens, 2001).

Análisis del Polimorfismo de Largos
Fragmentos Amplificados (AFLP)

Una de las técnicas nuevas y más
promisorias es el AFLP desarrollado por Keygene BV, Wageningen,
de Nueva Zelanda. Este método
combina una aplicabilidad universal con alto poder de
discriminación y reproducibilidad. Un gran número
de reportes describen el uso de esta técnica para plantas y mapeo
genético animal, diagnósticos clínicos,
estudios filogenéticos, y tipificación de bacterias
(Savelkoul et al., 1999).

Está basada en la detección de fragmentos
de restricción genomica por amplificación con
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y puede ser
utilizada para ADNs de cualquier origen o complejidad. La
técnica comprende tres pasos: 1) la restricción del
ADN y la ligazón de adaptadores oligonucleótidos,
2) la amplificación selectiva de juegos de
fragmentos de restricción, y 3) análisis del gel de
los fragmentos amplificados (Vos et al., 1995; Savelkoul
et al., 1999; Struelens, 2001).

El ADN es cortado con enzimas de restricción, y
los adaptadores de la doble hebra están ligados al final
de los fragmentos del ADN para generar la plantilla de ADN para
amplificación. La secuencia de los adaptadores y el sitio
de restricción adyacente sirve como sitios de unión
de los primer para la subsecuente amplificación de los
fragmentos de restricción (Vos et al.,
1995).

Para el análisis del AFLP solamente se necesita
una pequeña cantidad de ADN genomico purificado; este es
digerido como ya se menciono con dos enzimas de
restricción , una con una frecuencia media de corte (como
la EcoRI) y una segunda con una alta frecuencia de corte
(como la MseI o TaqI) (Savelkoul et al.,
1999). La infrecuente restricción de los sitios de
amplificación, o IRS-PCR, es otra variación de esta
propuesta que esta basada en la amplificación selectiva de
secuencias de ADN con sitios de restricción infrecuentes a
los lados.

Tiene un alto poder discriminatorio que se ajusta
fácilmente y un muy buen nivel del patrón de
reproducibilidad para un amplio rango de bacterias
patógenas tanto Gram positivas como negativas (Struelens,
2001).

Técnica de electroforesis en gel de campos
pulsantes (PFGE)

La electroforesis en gel de campos pulsantes (PFGE por
sus siglas en inglés)
fue descrita en 1984 como una herramienta para examinar el ADN
cromosómico de organismos eucariotas. Ha sido uno de los
progresos más útiles de la epidemiología
molecular en las décadas pasadas; emerge en
los 90´s como una técnica de la huella dactilar
considerada el estándar de oro para la
tipificación molecular de microorganismos, ya que ha
demostrado que es altamente efectiva para muchas especies
bacterianas tanto gram-positivas como los estafilococos,
enterococos, y mycobacterias y gram-negativas como la E.
coli
, otras Enterobacteriaceae, y pseudomonas
(Maslow et
al
, 1993; Goering, 1993; Tenover et al., 1994;
Struelens y MESGEM, 1996; Tenover et al., 1997;
Goering, 2000; Struelens, 2001; Warner y Onderdonk,
2003).

En general, la PFGE es una de las técnicas de
tipificación más reproducibles y altamente
discriminatorias en comparación con otras técnicas
moleculares (Maslow et al, 1993; Goering, 1993; Tenover
et al., 1994; Struelens and MESGEM, 1996; Tenover et
al
., 1997; Warner and Onderdonk,
2003).

En esta técnica, el genoma bacteriano, que
típicamente es de 2,000 a 5,000 pares de kb en
tamaño, es digerido con una enzima de restricción
que es relativamente de pocos sitios de reconocimiento y que
genera aproximadamente de 10 a 30 fragmentos de
restricción que van de 10 a 800 kb. Todos estos fragmentos
pueden ser separados como un patrón de distintas bandas
por PFGE, usando una cámara diseñada especialmente
que cambia de posiciones en el gel de agarosa entre tres juegos
de electrodos que forman un hexágono alrededor del
gel (Tenover et al., 1997;
Warner y Onderdonk, 2003).

La preparación del ADN genomico y la
macrorestricción son llevados a cabo en bacterias que se
ensamblan en los pozos de agarosa. Utilizando unidades de
electroforesis programables especiales, los cambios de
orientación periódica de los campos
eléctricos o electroforesis en gel de campos pulsantes,
permiten la separación y determinación del
tamaño de los fragmentos de
macrorestricción.

La PFGE escanea más del 90% del cromosoma para
reordenar fragmentos de gran tamaño tales como
duplicaciones, cancelaciones, o inserciones de secuencias que se
detectan como un cambio en el
tamaño o número del fragmento (Struelens,
2001).

Los patrones de restricción del ADN de los
aislamientos en estudio son comparados unos con otros para
determinar sus relaciones. Algunos resultados con esta
técnica pueden llevar a conclusiones diferentes entre
laboratorios, como por ejemplo, que los aislamientos puedan ser
designados como relacionados con brotes o no relacionados con
brotes de alguna enfermedad (Tenover et al.,
1995).

Las principales dificultades asociadas con esta
técnica son las relacionadas a las demandas
técnicas del procedimiento y
costos iniciales
del equipo. La preparación de ADN genomico apropiado
requiere de 1 a 3 días, dependiendo de los organismos a
examinar, y los costos del equipo requerido (incluyendo el
aparato de electroforesis y el transiluminador) varia entre 10,
000 y 20,000 dólares. Sin embargo, el método es
operacional en el laboratorio, y
puede ser aplicado a un amplio rango de especies con solo un
mínimo de modificaciones (Tenover et al.,
1997).

La Reacción en
cadena de la Polimerasa (PCR)

La Reacción en cadena de la Polimerasa
(PCR por sus siglas en inglés) es una
técnica que se utiliza comúnmente en los
laboratorios de investigación médicos y
biológicos para amplificar (crear copias múltiples
de) el ADN, sin utilizar un organismo vivo, tal como la E.
coli
o una levadura. Asimismo, se emplea en una variedad de
tareas, tales como la detección de enfermedades
hereditarias, la identificación de huellas digitales
genéticas, diagnóstico clínico, análisis
forense del ADN, detección de patógenos en el hombre,
animales, plantas, y alimentos, e
investigación en biología molecular
(Saunders et al., 2001).

La PCR fue inventada a principios de los
80´s por Kary Mullis, al cual le fue otorgado
el premio Nobel en química en octubre de
1993 por este logro, siete años después de haber
publicado sus primeras ideas. La idea de Mullis fue
la de desarrollar un proceso a
través del cual el ADN se pudiera multiplicar
artificialmente a través de ciclos repetidos duplicados
llevados a cabo por una enzima llamada ADN-Polimerasa.

La ADN-Polimerasa se produce naturalmente en los
organismos vivos, donde funciona para duplicar el ADN cuando las
células se dividen. Trabaja uniéndose
a una sola hebra de ADN y creando una hebra
complementaria.

El proceso original de PCR actualmente ha sido mejorado
mediante el uso de la ADN-Polimerasa que procede de una bacteria
termofilica que vive a temperaturas arriba de 110 °C (en
aguas termales). La ADN-Polimerasa o Taq
polimerasa tomada de estos organismos es termoestable (estable en
las altas temperaturas).

Actualmente la Taq polimerasa se utiliza
frecuentemente en la práctica de PCR. Una
desventaja de la Taq es que incurre a veces en
equivocaciones al copiar el ADN, conduciendo a mutaciones
(errores) en la secuencia del ADN (Saunders et al.,
2001).

La PCR que ha sido utilizada por varios años para
la detección directa de muchos tipos de agentes
infecciosos en muestras clínicas, ha sido adaptada para
ser usada como una herramienta de tipificación. La ventaja
de la PCR es su habilidad para producir literalmente millones de
copias de un segmento de ADN particular con alta fidelidad en un
tiempo de 3 a 4 horas (Tenover et al., 1997).

El procedimiento requiere una plantilla de ADN que puede
estar presente en la muestra en
pequeñas cantidades; dos primers oligonucleótidos
que flanquean las secuencias de la plantilla de ADN que va a ser
amplificado; y una DNA-polimerasa estable al
calentamiento.

Un ensayo
típico de PCR requiere aproximadamente de 3 horas para
completar 30 ciclos, donde cada ciclo consiste de una fase de
desnaturalización, en donde la doble hebra de ADN es
fundida en hebras únicas; una fase de alineación,
en donde los primers se unen a las secuencias blanco en las
hebras separadas; y una fase de extensión, en donde la
síntesis de ADN procede de los primers a partir de cada
hebra de la plantilla de ADN, generando dos nuevas copias de la
doble hebra de la plantilla original. Después de cada 30
ciclos , una sola copia inicial de la plantilla de ADN
teóricamente puede ser amplificado a 1 billón de
copias (Tenover et al., 1997; Saunders et al.,
2003).

El uso válido de esta técnica es
crítico para mantener la calidad de muchas
bases de datos
de ADN producidas. Es un hecho establecido que diversos factores
pueden influenciar la validez de los resultados obtenidos por
PCR, incluyendo la presencia de componentes inhibitorios, la
calidad de la plantilla de DNA, y la carencia de
optimización con respecto a componentes de la
reacción y las condiciones de los ciclos
termales.

Todos estos factores pueden comprometer la especificidad
y sensibilidad de la reacción, pudiendo llevar a
resultados falsos-negativos, falsos-positivos, o no
reproducibles. Pero menos conocido, sin embargo, es la
variación de los resultados en la PCR atribuidos debido al
subóptimo funcionamiento de los termocicladores, siendo
este el aspecto particular de la técnica que constituye
las bases de los estudios interlaboratorios (Saunders et
al
., 2003).

La Reacción en Cadena de la Polimerasa
con Primers Arbitrarios (AP-PCR)

Esta técnica simple y rápida ha sido
sucesivamente aplicada para la delineación de cepas
genotípicas y análisis de poblaciones
genéticas de un amplio rango de patógenos
microbianos, incluyendo bacterias, hongos y
protozoarios (Struelens, 1998).

La discriminación es buena y puede
correlacionarse con otras técnicas de
genotipificación. El poder discriminatorio es variable de
acuerdo al número y secuencia de los primers arbitrarios y
a las condiciones de amplificación. Aunque requiere de
varios factores técnicos para ser estrictamente
estandarizado para una reproducibilidad óptima.

La tipificación con esta técnica, y con
métodos similares como el RAPD y el DAF, están
basados en la amplificación por PCR de baja astringencia
utilizando un primer simple de secuencia arbitraria,
típicamente de 10 pares de bases. Después de varios
ciclos adicionales, se obtiene una cepa específica de
segmentos de ADN amplificados de varios tamaños
(Struelens, 1998).

Los productos
resultantes del PCR pueden representar una variedad de fragmentos
de ADN de diferentes tamaños que son visualizados a
través de electroforesis en gel de agarosa. Reportes
recientes han descrito condiciones y primers específicos
para analizar aislamientos de Staphylococcus aureus
(Ternover et al., 1997).

En la actualidad es considerado el método
más adecuado para una tipificación comparativa
rápida, pero inadecuado para bibliotecas de
tipificación en programas de vigilancia
epidemiológica.

Análisis de la secuencia de los
nucleótidos

La secuenciación de nucleótidos de genes
amplificados por PCR es el medio más preciso y sensitivo
de indexar el polimorfismo del ADN localizado para la
tipificación de cepas bacterianas. Sin embargo, el tiempo
requerido y los costos del procedimiento actualmente limitan el
uso de este método cuando se ha aplicado a varios tipos de virus
como el de la hepatitis y el
VIH, pero también a bacterias como los Streptococcus
pyogenes.
Con el rápido progreso de la automatización, es probable que en los
siguientes años la resecuenciación con PCR pueda
ser utilizada para la tipificación epidemiológica
de virus, bacterias
y otros patógenos (Struelens, 1998).

Conclusiones

El continuo crecimiento
exponencial de la comprensión de las bases
genéticas moleculares de la enfermedad humana
y animal ha sido apoyado por los progresos
tecnológicos en el desarrollo de nuevas técnicas
moleculares que han venido a substituir los
métodos intensivos de trabajo
empleados previamente.

Estas nuevas técnicas moleculares en la
actualidad le han permitido a los científicos tener un
gran avance en el área de la medicina como
de la investigación, ya que gracias al desarrollo de estas
técnicas es que se ha logrado llevar a cabo la producción de medicamentos y vacunas para
combatir una serie de enfermedades, incluso incurables, que
afectan desde hace tiempo tanto al hombre como a
los animales de manera individual como colectiva.

Si bien es cierto pues, los avances en la
comprensión de las bases biológicas de la biodiversidad
microbiana a nivel de subespecies puede mejorar el marco
conceptual requerido para una apropiada interpretación
epidemiológica de los resultados de tipificación.
Por lo que una adecuada y más amplia aplicación de
estas técnicas puede dar luz a la
epidemiología de infecciones adquiridas por el hombre y/o
animales, permitiéndole con ello tener un control
más eficaz de estas, así como llevar a cabo mejores
estrategias de prevención.

Referencias

Boxer, M. 2000. Molecular Techniques: divide or share. J
Clin Pathol. 53:19?21.

,
L., y Tabery, J.
2005. Molecular biology. Stanford Encyclopedia Philosophy.
Metaphysics
Research Lab
, CSLI,
Stanford
University
.

Goering, R. V. 1993. Molecular epidemiology of
nosocomial infection: analysis of chromosomal restriction
fragment patterns by pulsed-field gel eletrophoresis. Infect
Control Hosp Epidemiol, 14: 595-600.

Goering, R. V. 2000. The molecular epidemiology of
nosocomial infection: past, present and future. Reviews in
Medical Microbiology, 11(3): 145-152.

Warner, J. E. y Onderdonk, A. B. 2003. Method for
Optimizing Pulsed-Field Gel Electrophoresis Banding Pattern Data.
Journal of Molecular Diagnostics, Vol. 5, (1): 21-27.

Maslow, J. N., Ellis, M. M., Arbeit, R. 1993. Molecular
epidemiology: application of temporary techniques to the tiping
of microorganisms. Clin Infect Dis, 17: 153-164.

Saunders, G. C., Juliet, D., Helen, C. P., y Johanne, H.
C. 2001. Interlaboratory Study on Thermal Cycler Performance in
Controlled PCR and Random. Amplified Polymorphic DNA Analyses.
Clinical Chemistry 47 (1): 47?55 .

Savelkoul, P. H. M., Arrts, H. J. M., de Haas, J.,
Dijkshoorn, L., Duim, B., Otsen, M., Rademaker, J. L. W.,
Schouls, L., y Lenstra, J. A. 1999. Ampified-Fragment length
polymorphism analysis: the state of an art. J Clin Microbiol, 37
(10): 3083-3091.

Struelens, J., y Members of the European Study Group on
Epidemiological Markers (MESGEM). 1996. Consensus
guidelines for appropriate use and evaluation of microbial
epidemiologic typing systems. Clin Microbiology and Infect, 2
(1): 2-11.

Struelens, M. 1998. Molecular epidemiologic typing
systems of bacterial pathogens : Current issues and
perspectives.

Struelens, M. 2001. Molecular epidemiology. Laboratory
Diagnosis of Bacterial Infections. Marcel Dekker, Inc. New York.
pp. 125-145.

Tenover, F., Arbeit, R., Archer, G, et al. 1994.
Comparison of traditional and molecular methods of typing
isolates of Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol, 32:
407-415.

Tenover, F. C., Robert, D. A., Goering, R. V., Patricia
A. M., Barbara E. M., David H P., y Bala S. 1995. Interpreting
chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-field gel
electrophoresis: criteria for bacterial strain typing. Journal of
Clinical Microbiology. Vol 33 (9):2233-2239.

Tenover, F. C., Robert D. A., Goering, R. V., y the
Molecular Typing Group of the Society for Healthcare Epidemiology
of America. 1997. How to select and interpret molecular strain
typing methods for epidemiological studies of bacterial
infections: a review for healthcare epidemiologists. Infection
Control and Hospital Epidemiology. Vol. 18 (6):
426-439.

Carlos Bedolla Cedeño
?

Brenda Yudith Bedolla García
?

? Centro de Innovación y Desarrollo Educativo-Centro de
Estudios Justo Sierra. Surutato, Badiraguato. Sinaloa. México.
Facultad de Medicina Veterinaria y
Zootecnia de la Universidad
Michoacana de San Nicolás de Hidalgo. Morelia,
Michoacán. México.

? Posgrado en Conservación y Manejo de
los Recursos
Naturales. Facultad de Biología de la Universidad
Michoacana de San Nicolás de Hidalgo. Morelia,
Michoacán. México.

Biografía

Carlos Bedolla Cedeño

Es egresado de la Facultad de Medicina Veterinaria y
Zootecnia de la Universidad Michoacana de San Nicolás de
Hidalgo. Ha desempeñado sus actividades como Laboratorista
Modular y como Coordinador de Módulo. En 1994,
participó en el programa de
implementación de los estudios de postgrado en la Facultad
de Medicina Veterinaria. Ha sido responsable de varios proyectos de
investigación. Ha participado como ponente y
conferencista en diferentes instituciones
y eventos locales,
estatales y nacionales. Ha publicado diferentes artículos
en medios
locales, nacionales e internacionales. Realizó la
Maestría en Ciencias de la
Educación (con terminal en Investigación Educativa) y otra en Educación en Ciencias
Naturales (con Terminal en Biología). Diplomado en
Desarrollo Curricular y en Diseño
de Unidades de EnseñanzaAprendizaje.
Integrante del comité que llevó a cabo el cambio
del plan de estudios
actual en la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia donde
labora. Es Profesor e
Investigador Titular "A" de Tiempo Completo de la Facultad de
Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Michoacana de
San Nicolás de Hidalgo. Es Profesor Titular de las
Áreas Integradoras denominadas "Metodología de la Investigación",
"Organización y Dinámica Corporal", "Interacción Animal-Medio
Ambiente" del Nuevo Plan de Estudios de la Carrera de
Médico Veterinario Zootecnista de la FMVZ. Es Miembro de
la Red
Académica Universitaria en Educación de la
Universidad Michoacana. Tiene Diplomado en Formación de
Tutores. Es Coordinador del Programa de Tutorías en la
Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Es Candidato al
grado de Doctor en Ciencias
Agropecuarias en la Universidad Autónoma Agraria Antonio
Narro de Torreón Coahuila, México. Actualmente se
encuentra desarrollando los siguientes proyectos: 1)
Identificación y tipificación molecular de cepas de
Staphylococcus aureus aisladas de leche de vacas
con mastitis del
Municipio de Tarímbaro, Michoacán, México.
2) Epidemiología de la mastitis bovina en
Michoacán, México.

Partes: 1, 2
 Página anterior Volver al principio del trabajoPágina siguiente 

Nota al lector: es posible que esta página no contenga todos los componentes del trabajo original (pies de página, avanzadas formulas matemáticas, esquemas o tablas complejas, etc.). Recuerde que para ver el trabajo en su versión original completa, puede descargarlo desde el menú superior.

Todos los documentos disponibles en este sitio expresan los puntos de vista de sus respectivos autores y no de Monografias.com. El objetivo de Monografias.com es poner el conocimiento a disposición de toda su comunidad. Queda bajo la responsabilidad de cada lector el eventual uso que se le de a esta información. Asimismo, es obligatoria la cita del autor del contenido y de Monografias.com como fuentes de información.

Categorias
Newsletter