11. Coenzima y grupos
prostéticos
Aparte del sustrato, cuya transformación será
condicionada por la enzima, existe otra parte del sistema
enzimático, de peso moléculas bajo y por lo tanto
dializable, termostable y en general, no protéica,
adherida de mas o menos laxa a la apoenzima y a la cual se le
llama grupo
prostético, si está muy intimanente ligada a la
apoenzima – como es el caso del núcleo
porfirínico de numerosas oxidasas o la estructura
flavínica de la deshidrogenasa succínica – o
coenzima cuando la unión es débil y se separan
fácilmente, como por ejemplo el DPN y el TPN que asisten a
las funciones de
varias deshidrogenasas. Es muy grande la importancia del grupo
prostético o de la coenzima desde el punto de vista
funcional pues suelen ceder y recibir alternadamente parte de los
productos de
la reacción. Por ejemplo en las reacciones de oxido
– reducción los hidrógenos desprendidos de un
sustrato deben ser captados por una sustancia con lo que se
expulsa al sustrato oxidado y es posible recibir una nueva
molécula del sustrato con hidrógenos. Tal sustancia
es una coenzima, como el DPN, el TPN, el FAD, etc., que, a su
vez, suele cederlos a una tercera sustancia o, cuando las
reacciones son reversibles los pasan al sustrato oxidado para
reducirlo. Algunos autores denominan cosustratos a estos
agrupamientos coenzimáticos para hacer énfasis en
su carácter reversible, no catalítico y
equimolecular con respecto al sustrato. Una proporción de
las vitaminas
forman parte de moléculas mas complejas que funcionan como
coenzimas en diversas reacciones.
- Muchas enzimas
requieren una coenzima
Muchas enzimas que
catalizan la transferencia de grupos y otras
reacciones requieren, además de su sustrato, una segunda
molécula orgánica conocida como coenzima sin la
cual son inactivas. Para distinguirlas de iones metálicos
activadores y de las enzimas mismas, las coenzimas se definen
como compuestos orgánicos termoestable, de peso molecular
bajo, requeridas para la actividad de las enzimas. La mayor parte
de las coenzimas se unen a las enzimas por fuerza no
covalentes. Las que forman enlace covalentes con las enzimas se
denominan también grupos prostéticos.
Entre las reacciones que requieren coenzimas están
las oxidorreducciones, las reacciones de transferencia de grupo e
isomerización y las reacciones que forman enlaces
covalentes (claves 1,2,5 y 6;IUB). Las reacciones líticas
que comprenden reacciones hidrolíticas catalizadas por
enzimas digestivas no requieren de coenzimas.
- Las coenzimas pueden considerarse como segundo
sustrato
La coenzima puede considerarse como un segundo sustrato o
cosustrato por dos razones. En primer lugar, los cambios
químicos en la coenzima compensa exactamente a los que
realizan en el sustrato. Por ejemplo, en las reacciones o
oxidorreducción (deshidrogenasa), una molécula de
sustrato es oxidasa y una molécula de coenzima es
reducida.
Una segunda razón para dar igual énfasis a
las reacciones de la coenzima es que, en realidad, este aspecto
de la reacción es el que puede ser de significado
fisiológico fundamental. Por ejemplo, la importancia de la
capacidad del músculo que trabaja en condiciones
anaerobias para convertir el piruvato en lactato no residen en el
piruvato ni en el lactato.
La reacción sirve solamente para oxidar la coenzima
reducida NADH a NAD+. Sin NAD+ la glucólisis no puede
continuar y la síntesis anaerobias de ATP (y por tanto,
el trabajo)
tiene que cesar. En condiciones anaerobias, la reducción
del piruvato en lactato reoxida al NADH y permite la
síntesis de ATP. Otras reacciones pueden servir igualmente
bien. Por ejemplo, en las bacterias o
levaduras que crecen en medio anaerobio, algunos metabolitos
derivados del piruvato son utilizados como oxidante para el NADH
y son reducidos en el proceso.
- Las coenzimas funcionan como reactivos en la
transferencia de grupos
Las reacciones bioquímicas de transferencia de grupo
del tipo.
D – G + A = A – G + D
En la cual un grupo funcional, G es transferido de una
molécula denadora, D-G, a una molécula aceptora, A,
por lo general comprende la participación de una coenzima
como último aceptor (por ejemplo, reacciones de
dehidrogenación) o como portador intermediario del grupo
(por ejemplo, reacciones de transaminación). El esquema
siguiente muestra el
último concepto.
D-H CoE A-G
D CoE-G A
Aunque estos sugiere la formación de un complejo
sencillo CoE-G, durante el curso de la reacción global,
pueden intervenir varios complejos intermediarios CoE-G en una
reacción particular (por ejemplo,
transaminación).
Cuando el grupo transferido es el hidrógeno, es
costumbre representar sólo la "mitad izquierda de la
reacción":
D-H CoE
D CoE-H
Que esto representa en realidad sólo un caso
especial de la transferencia general de grupos puede apreciarse
mejor en términos de las reacciones que ocurren en las
células
intactas. Se pueden representar de las siguientes manera:
D-H CoE A-H
D CoE-H A
- Las coenzimas pueden clasificarse de acuerdo al grupo
cuya transferencia facilitan
Basándose en este concepto
podría clasificarse a las coenzimas como sigue:
Para la transferencia de grupos distintos del
hidrógeno:
- Fosfatos de azúcares
- CoASH
- Pirofosfato de tiamina.
- Fosfato de piridoxal
- Coenzimas del folato
- Biotina
- Coenzimas de cobamida (B12)
- Ácido lipoico
- Para la transferencia del hidrógeno:
- NAD+, DADP+
- FMN, FAD.
- Ácido lipoico
- Coenzima Q.
-Muchas coenzimas derivan de vitamina B y del monofosfato
de adenosina
Las vitaminas B
forman parte de la estructura de
numerosas coenzimas. Las vitaminas B; nicotinamida, tiamina,
riboflavina y ácido pantoténico son constituyentes
esenciales de las coenzimas para las oxidaciones y las
reducciones biológicas y las coenzimas ácido
fólico y cobamida funcionan en el metabolismo de
compuestos de un solo carbono.
Numerosas coenzimas contienen adenina, ribosa y fosfato y se
derivan del monofosfato de adenosina AMP. Los ejemplos incluyen
NAD+ y NADP+
Las enzimas son catalizadores orgánicos que disminuyen
la barrera denominada energía de activación; y por
tanto facilitan el que se inicie una reacción. Este
proceso
implica el trabajo
necesario para poner a dos moléculas en un contacto lo
suficientemente estrecho como para que reaccionen; además,
el trabajo debe realizarce sobre la unión química – una
con covalencia en sentido estricto – para que pueda
romperse y formar otros compuestos. Las enzimas, como muchos
catalizadores, son partículas de gran superficie y
muestran que tienen capacidad para atraer y captar diversas
moléculas. Cualquier factor que permita por una parte
atraer al sustrato a su centro activo se pude considerar como un
activador, además algo que permita la rápida salida
de los productos
también pude considerarse como un activador. Asi se
reconocen diversas posibilidades:
- Activación iónica. Numerosos metales
monodivalentes son necesarios para la actividad
enzimática de diversos sistemas.
Destacan entre ellos los siguientes: K+,
Mn++, Mg++, Ca++,
Fe+++, Cu+, Cu++, etc. A
menudo el metal, a estas condiciones, es el centro que permite
la unión conjunta del sustrato, de la coenzima y de la
misma apoenzima con la que forma quelatos (de chelos, garra;
complejos moleculares sostenidos por un metal) al unirse con
grupos cargados electricamente. Muy amenudo se demuestra que es
posible sustituir los metales
divalentes entre ellos, sin grandes modificaciones de la
velocidad de
la reacción.
Los metales como el hierro, el
cobre y el
molibdeno, actúan a menudo como transportadores de
electrones y no se les puede considerar activadores en el
sentido estricto pues forman parte integral del grupo
prostético. Algunos aniones también son
necesarios para la actividad de ciertas enzimas; bien conocido
es el caso del Cl-, el que puede sustituirse, a un
cuando con baja de la velocidad,
por Br-, para la amilasa salival; o el propio
radical fosfato que se requiere en reacciones de
fosforilación.
- Activación por el grupo prostético. En
determinadas reacciones estos son indispensables para el
trabajo de la enzima y constituyen, en rigor, la parte
funcional activa del sistema. - Activación de la apoenzima. Consisite en la
obtención de una correcta estructura del centro activo
de la proteina con actividad enzimática, ya referido
anteriormente.
- Integridad de los grupos funcionales del centro activo.
Destaca la relacionada con los grupos sulfhidrilo, -SH.
Cualquier alteración química que los
destruya, bloquee u oxide a disulfuro, -S-S-, puede inactivar a
las enzimas. Esto puede suceder incluso en las suaves
condiciones del trabajo celular por exposición a agentes
oxidantes o al oxigeno
mismo, aunque puede lograrse por el efecto de sustancias que
los ataquen y que combinen con ellos como la yodacetamida. En
otras ocaciones la destrucción de los grupos –SH,
aun la distancia del centro activo modifica de tal manera la
estructura tridimencional de la enzima que el centro activo se
deforma al grado de que no puede llevar a efecto su
acción sobre las sustancias reaccionantes. Existen otros
grupos funcionales cuyo bloqueo acaba por completo con la
actividad enzimatica; en tal caso estaría la
acción de inhibidores o venenos enzimáticos. - Medida de la actividad enzimática. Aparte del
problema de medir las pequeñísimas cantidades de
enzimas presentes en los tejidos; muy
pocas de ellas poseen características químicas o
espectroscópicas particulares que permita medirlas
directamente. En general, las enzimas se cuantean siguiendo la
actividad de la reacción que catalizan y se aceptan, en
principio que dicha actividad es proporcional a la cantidad de
enzima presente. Como la actividad de un enzimas sólo
rara vez se puede expresar en relación a su peso
absoluto o a la molaridad de la enzima, lo habitual es
expresarla en "unidades" fijadas de modo convencional con
relación a la proteina presente en la
preparación.
La actividad enzimática se mide por la
desaparición del sustrato o la aparición de alguno
de los productos de la reacción, siguiendo dichos cambios
en el tiempo. Sin
embargo, las condiciones del sistema no son uniformes a lo largo
del tiempo: el grado
de saturación de la enzima con el sustrato cambia
constantemente, los productos que aparecen suelen inhibir a la
enzima o se presentan modificaciones del pH que afectan
a la reacción, etc. Para evitar estos problemas se
hace la medida de la velocidad inicial, tomando en cuenta solo el
comienzo, en forma de línea recta de la gráfica, lo
que sucede en general cuando se ha consumido no más de una
cuarta parte del sustrato.
La actividad puede espresarce, una vez determinada la
reacción, en relación con el tiempo empleado por la
enzima para producir un cambio
determinado; mientras mayor sea el tiempo, la actividad de la
enzima es menor. Por lo tanto, la recíproca del tiempo (la
inversa del tiempo osea el valor que
resulta de dividir la unidad sobre el tiempo, 1/T) es una medida
de la actividad enzimática.
13. Las enzimas son
catalizadores estereoespecíficos
Casi todos los sustratos forman por lo menos tres enlaces con
las enzimas. Esta adherencia en tres puntos pueden conferir
asimetría a una molécula por otro lado
simétrica. La figura * muestra una
molécula de sustrato, representada como un átomo de
carbono que
tiene tres grupos diferentes, próximos a adherirse en tres
puntos a un sitio de la enzima. Si el sitio puede ser alcanzado
sólo desde un lado y únicamente los átomos
complementarios y los silios pueden interactuar (ambos
suposiciones válidas para las enzimas reales), la
molécula se unirá sólo en una forma. La
reacción misma puede estar confinada a los átomos
unidos en los sitios 1 y 2 aún, cuando los átomos 1
y3 sean idénticos. Girando mentalmente la molécula
de sustrato en el espacio, nótese que puede adherirse en
tres puntos a un costado del sitio planar con una sola
orientación. En consecuencia, los átomos 1 y 3
aunque sean idénticos viene a ser distintos cuando el
sustrato está adherido a la enzima. Por tanto, un cambio
químico puede afectar el átomo uno
(pero no al átomo tres) o viceversa. Esto puede explicar
el porqué la reducción, catalizada
enzimáticamente de la molécula del piruvato
ópticamente inactiva, forma L- y no D,L-lactato.
Los distintos grupos de enzimas muestran variaciones
considerables en su grado de especificidad. Algunas de ellas
muestran requerimientos estrictos tanto para el sustrato (o los
sustratos si se trata de reacciones bimoleculares) como para el
tipo de unión química sobre el que van a actuar;
pequeños cambios en cualquiera de ellos bastán para
inactivar la reacción; tal es el caso de la mayoría
de las enzimas. En otras ocaciones, la deshidrogenasa
alcohólica, que funciona con DPN como coenzima, es
absolutamente específica para el DPN, pero pude actuar
sobre diversos alcoholes
aparte del etílico que es su sustrato característico. Asi mismo, las enterasas,
las fosfatasas y ciertas peptidasas a menudo solo son
específicas para el tipo de unión atacada –
éster, peptídica, etc. – y no requieren
estructuras
definidas en el sustrato, a ambos lados de la unión. Hay
ejemplo de especificidad doble: la xantina oxidasa, altamente
específica para la xantina a la que convierte en
ácido úrico, y por otro lado muy activa, pero en
forma inespecífica, al mostrar gran capacidad para mostrar
la activación de gran variedad de aldehidos.
El requisito de estereoespecificidad para los sustratos es muy
importante. Las enzimas que habitualmente atacan a los
azúcares naturales con configuración D-, no lo
hacen sobre sus isómeros artificiales L-; las enzimas tan
activas en la naturaleza sobre
los aminoácidos comunes tipo L- so inactivas para los
aminoácidos artificiales (o muy raros en los organismos
vivos) de tipo D-. Esto es tan absoluto que cuando existen
mezclas
racémicas de isómeros D- y L-, un método
conveniente de separarlas, es el de dejar que actue sobre ellas
una enzima que degradará exclusivamente a uno de los dos
isómeros dejando al otro intacto.
Cuando el sustrato es simétrico y el producto es
asimétrico, la enzima provoca, específicamente, la
formación de uno solo de los productos asimétricos,
aquel para el que la enzima es activa; tal es el caso de la
deshidrogenasa láctica que, al actuar sobre el
ácido pirúvico (simétrico) produce
exclusivamente ácido D-láctico y no ácido
L-láctico, y el de la deshidrogenasa glutámica que
al atacar el ácido a
-cetoglutárico produce solo ácido
L-glutámico:
CH3CH3
| |
C = O HCOH
| |
COOH COOH
Ácido pirúvico Ácido
D-láctico
Existen otras formas de isomerismo geométrico
aparte del isomerismo D-, L-, suceptibles de ser reconocidas por
enzimas. Tal es la situación de los isómeros cis
– trans en que solo uno de los tipos del par es atacado. La
fumarasa introduce una molécula de agua en el
ácido fumárico trans, pero el isómero cis, o
sea el ácido maleico, no es atacado.
H – C – COOH H – C –
COOH
HOOC – C – H H – C –
COOH
Ácido fumárico (trans) Ácido
maléico (cis)
Las enzimas también pueden distinguir
moléculas que desde el puntod e vista estructural, como
compuestos químicos, son identicas. Por ejemplo, la
glicerol cinasa, por medio de ATP, convierte al glicerol en
L-grlicerol – 3- fosfato, osea produce su
fosforilación, pero exclusivamente en la posición
3, hecho que se ha demostrado con glicerol marcado con C
radiactio, C14, en las dos posiciones posibles 1 y
3.
Los mismo sucede con el ácido cítrico que
al ser oxidado y descarboxilado hasta producir
ácido a
-cetoglutárico adquiere un grupo –C=O, en uno
de los lados de la molécula, quimicamente
simétrica. Esta capacidad de la enzima para reconocer el
sustrato obedece a que debe tener por lo menos tres grupos
químicos orientados en el espaciod e tal modo que el
sustrato, aunque en apariencia simétrico, solo puede
adaptarse por completo a la enzima en una sola posición.
De todo esto se desprende por el sustrato a los sustratos
necesitan tener un patrón peculiar de grupos
químicos, específicos para cada enzima particular,
de modo que se adapte perfectamente a su centro activo; mientras
mayor y más complejo sea este requerimiento mayor
será la especificidad de la enzima.
15. Preparación y
purificación de las enzimas
Aun cuando se sabe que las propiedades de las enzimas in
situ puden ser muy diferentes a las de las enzimas puras
estudiadas en el laboratorio,
está plenamente justificada la necesidad de tener
preparaciones puras para hacer el estudio químico completo
de su actividad. En la actualidad se han cristalizado o
purificado de manera adecuada cerca de unas 200 enzimas (del
posible total de unas 5000 ) y quizas en los próximos
años aumente de modo considerable este
número.
Para extraer las enzimas de las células
que las contienen, a menudo es necesario dividir finamente el
tejido, por medio de un homogeneizador o una licuadora; los
tratamientos más enérgicos comprenden la molienda
del tejido con arena el empleo de
vibraciones ultrasónicas, los procesos
alternados de congelamiento y descongelamiento, la
autolísis , el desecado con calor o el
emmpleo de solventes como la caetona, el éter y el
tolueno. El desecado con acetona y la producción de los llamados polvos
acetónicos constituyen un excelente ejemplo de rotura de
la menbrana celualr y la obtención de un material rico en
enzimas y de fácil concervación. Cuando las enziams
están asociadas a lípidos,
como sucede con als enzimas mitocondriales, es ventajoso el
tratamiento con sustancias de tipo detergente o con butanol que
disgregan la estructura lipoprotéica y permiten la salida
de las enzimas.
La purificación de las enzimas con método de
precipitación fraccionada recurre a diversos procedimientos,
el cambio de pH quita las
nucleoproteínas y el material grueso, con lo que se
facilitan los pasos siguientes. Con el empleo del
calor a veces
se logra la desnaturalización de material protéico
inactivo; por ejemplo, en la purificación de la
transaminasa se añade el sustrato de la enzima –
ácido a –
cetoglutárico – al homogenado y se calienta hasta
65° C, con
lo que muchas enzimas se desnaturalizan y precipitan, lo que no
sucede con la transaminasa así protegida.
En otros casos se emplean solventes orgánicos
como el etanol, muy utilizado para separar diversas proteínas
del suelo
sanguíneo y la caetona; o las sales, como el sulfato de
amonio, que es muy soluble en agua, por lo
que se puede manejar a elevadas concentraciones, y en general no
ataca la estructura de las enzimas. la absorción
fraccional tiene gran utilidad para
absorver gran material indeseable o para absorber la enzima y
luego desprenderla del material absorbente en una forma
más pura; muy usado con este fin en el gel de aluminio
C.
En los últimos años se han logrado
adelantos notables en materia de
fraccionamiento protéico con el empleo de técnicas
coromatográficas en columnas que se basan en
fenómenos de absorción, de intercambio
iónoco o de una verdadera "filtración molecular".
Se agraga a una columna con el material activo la solución
de la enzima que queda fijada a dicho material; se lava la
columna con soluciones de
sales, cada vez más concentradas o con distinto pH, etc. ,
y se recogen los lavados en fracciones de volúmenes
determinadas; en alguna porción sale la enzima en estudio,
en forma más pura. Los materiales
más usados para este fin son ciertas formas de fosfato de
calcio – hidroxiapatita -, resians de intercambio
iónico, como las Amberlitas o las Dowex (aunque tienen el
inconveniente de desnaturalizar a las proteínas
y de tener poca superficie útil) y diversos derivados de
la celulosa, tales como la dietilaminoetil celulosa (DEAE –
celulosa) y la carboximetil celulosa (CM – celulosa).
Ejemplos de los filtros moleculares lo constituye el material que
está compuestod e un polisacárido que forma una
rejilla tridimensional, el Sephadex, que puede retener
proteínas con peso molecular aproximado de 25 000 hasta
200 000 según el tipo que se emplee.
El paso final de la purificación es el de la
cristalización de la enzima que debe repetirse varias
veces pues los primeros cristales suelen estar contaminados con
otras enzimas. A pesar de esto, la obtención de cristales
no demustra que la enzima esté 100% pura, es solo
obtención de una actividad específica de un
valor
constante ante las recristalizaciones repetidas la que ofrece la
seguridad de su
pureza.
El estudio de la pureza de una enzima comprende la
aplicación de las técnicas empleadas para el
estudio de la pureza de las porteínas, el análisis por ultracentrífuga, el
análisis el electroforético, etc.
Sin embargo, aún es podsible, si se somete la enzima a
fraccionamientos más sensitivos, como losd e la
electroforésis en gel de agar, de almidón, o de
acrilamida demostrar que la enzima en cuestión puede estar
formada por varias proteínas, algunas de las cuales tienen
la misma actividad enzimática, pero que por tener
propiedades físicas o estructurales diferentes se deben
considerar como isoenzimas, y otras que son proteinas que se han
procesado a lo largod e todas las etapas de
purificación.
En general las enziams se consideran especies
químicas homogéneas y puras cuando llenan
requisitos como los siguientes: su actividad no debe aumentar
después de que se la recristaliza repetidas veces; su
solubilidad no aumenta al elevar la cantidad de cristales de la
proteína problema que se pone en solución; tanto en
el análisis realizado con la ultracentrífuga como
en los diversos métodos
electroforéticos se encuentra un patrón de
mobilidad único y persistente.
Al hacer el estudio electroforético del suero
humano normal y hacer un revelado de la actividad de la
deshidrogenasa láctica se encontró distribuida en
cinco bandas diferentes; se llegó así al concepto
que es posible que en un tipo de tejido existan diversas y
múltiples formas moleculares de una enzima, a las que se
denominan isoenzimas. Son por lo tanto proteínas con
actividad catalítica que favorece la misma reacción
pero que pueden distinguirse por alguna característica
física,
estructural, inmunológica, etc. En el ejemplo antereior
sus diferencias se rejistraron en la velocidad de migración
electroforética. En otras ocaciones la diferencia eside en
las propiedades cinéticas; por ejemplo, existen dos
deshidrogenásas málicas que catalizan la misma
reacción; sin embargo, actuan de modo distinto cuando se
les pone en contacto con los análogos artificiales del DPN
y, además, una es de origen mitocondrial, la otra se
encuentra en el sobrenadante celular.
Sin embargo, este concepto tiene sus limitaciones; el
caso de la deshidrogenasa láctica es muy ilustrativo. Esta
enzima se diferencia en 5 isienzimas denominadas I, II, III, IV y
V que parecen ser características de distintos tejidos; en el
corazón
dominan el I y la II, el higado tiene un predominio de la V, etc.
al tratar la enzima –que pesa 135 000 – con
úrea o guanidina, su molécula se fragmenta en
cuatro porciones, cada una de las cuales tiene un peso molecular
de unos 35 000. Las cinco isoenzimas comunes de la hidrogenasa
láctica parecen sermezclas de dos tipos básicos A y
B, o H (de "heart", corazón) y
de m (músculo) de la siguiente manera:
HHHH Tipo I, miocárdico, H
HHHM Tipo II
HHMM Tipo III
HMMM Tipo IV
MMMM Tipo V, muscular, M
Se ha confirmado inmunológicamente su presencia;
los anticuerpos preparados contra ambas moléculas
originales H o M nomuestran reacción cruzada entre si,
pero si reaccionan con los híbridos formados de H y de M.
Del mismo modo, muestran diferencias considerables en su
composición de aminoácidos.
No solo las características fisicoquímicas
son diferentes; quizá aun más importante sea el
aspecto funcional. La actividad de las deshidrogenasas
lácticas ante sus sustratos normales, lactato, piruvato, y
ante los análogos del DPN indican el papel de la
enzima en la regulación de las relaciones
DPN/DPNH2, que a su vez, regulan funciones
celulares importantes. Es muy notable la diferencia en la
inhibición producida por un exceso de piruvato sugerente
de que, en rigor, la enzima tipo M o V funciona más bien
como una reductasa del piruvato. Esta forma (M o V) es muy
útil en los músculos voluntarios que presentan
demandas bruscas de energía proporcionadas por la
glucólisis, o en tejidos con poco oxígeno
(anaerobiosis). Por el contrario la tipo H (I) funcionan
preferentemente en músculos que deben realizar un
ejercicio sostenido y en los que las necesidades
energéticas se satisfacen por medio de un metabolismo
aeróbico intenso; este tipo, por lo tanto, está
capacitado, funcionalmente, para lograr una mayor
exidación del lactato a ácido
pirúvuco.
La distribución de la enzima con respecto a la
aerobiosis (o anaerobiosos) del tejido se ha comprobado en varios
casos: la de tipo H (I) es más abundante en la corteza
renal (cerca de 100%) que en la médula (50%) en las
papilas (10%), en razón directa con el grado deaerobiosis
de esas zonas renales. Lo mismo sucede con músculos de un
mismo animal; si tienen que trabajar constantemente muestran
grandes proporciones de la forma H (I), como el dorsal ancho de
las gallinas que casi en el 100% muestran dicha forma; el
pectoral, en cambio tiene menos del uno por ciento de ella, en
cambio, en los pectorales de las aves
migratorias que deben sostener por horas y aun días,
esfuerzoz extraordinarios, aparece nuevamente la forma H (I) de
preferencia a la M (V).
Es obio que cuando son muy marcadas las diferencias de
pesos moleculares, composición de aminoácidos,
características cineticas y otras propiedades
físicas, es dificil hablar de isoenzimas; más
conveniente es considerarlas entonces como enzimas distintas que
simplemente catalizan la misma reacción reservando el
término de isoenzima para aquellas situaciones como la de
la deshidrogenasa láctica que representan agregados
híbridos de composición relativamente
parecida.
17. Cinetica de las
reacciones enzimaticas
Aunque las leyes generales
de la catálisis debieran ser válidas para las
enzimas, el hecho de que éstas sean sustancias complejas,
de alto peso molecular, de tamaño coloidal y de
composición difícil de precisar, impide la
aplicación de dichas leyes de una
manera estricta; por ejemplo, su tamaño coloidal puede
causar fenómenos de adsorción o diversas reacciones
debidas a sus numerosas cargas eléctricas. No obstante,
los factores que afectan la velocidad de la reacción
enzimática son los ya señalados a propósito
de las reacciones químicas en general, como la temperatura y
las concentraciones de las sustancias reaccionantes que, en este
caso particular, son la enzima el sustrato. Además
intervienen el PH medio donde se realiza la reacción, la
presencia de los productos de la reacción, y otros
factores secundarios como las radiaciones y los efectos
óxido – reductores.
18. Relaciones entre la
enzima y el sustrato.
Es universalmente aceptado, que la enzima, como todo
catalizador, participa de una manera activa en la
reacción. Existen pruebas
experimentales de esta situación cuando menos para
algunos.
Un ejemplo bien conocido es el de la peroxidasa que,
en presencia de peróxido de hidrógeno,
H2O2, y un acceptor de hidrógeno
adecuado, produce la reducción del
H2O2, . La peroxidasa en ausencia de
H2O2 muestras unas bandas de
absorción características en el espectro visible;
cuando se combina con el H2O2 , pero sin
que exista el acceptor de los hidrógenos, aparece una
nueva distribución de las bandas. Si se permite
el paso de los hidrógenos a un acceptor,
automáticamente desaparecen las bandas nuevas y reaparecen
las originales de peroxidasa.
Se acepta corrientemente una hipótesis propuesta por Michaelis para
explicar la actividad enzimática, sobre la base de la
información de un compuesto de la enzima
con el sustrato (complejo enzima – sustrato), previamente
al ataque del sustrato por la enzima y a la liberación de
los productos de la reacción. El desarrollo
matemático que permitió a Michaelis formular su
hipótesis, estuvo
acorde con los datos
experimentales obtenidos una vez vencidos los enormes
obstáculos de orden técnico para llevar a cabo la
confirmación de la teoría
en el laboratorio.
Si se hace el estudio de la actividad de una enzima
en relación con la concentración de sustrato. En
ella se registran, en las abscisas, la cantidad creciente de
sustrato y, en las ordenadas, la cantidad de uno de los productos
de la reacción liberada de un tiempo dado, que expresa, en
rigor, la actividad de la enzima. La curva obtenida es la de una
hipérbola rectangular, la cual tiene algunas propiedades
interesantes; por ejemplo, la velocidad límite o velocidad
máxima, es el valor que trata de alcanzar la curva a
medida que se aumenta el sustrato y que, en la figura,
está señalada con la línea V. Existe un
punto, fijado arbitrariamente, en el que la mitad de la velocidad
límite corresponde a una concentración
específica del sustrato; esta concentración de
sustrato se representa habitualmente como KM, y se denomina
constante de Michaelis, valor característico para un par
– enzima – sustrato y que, por lo tanto, es la
concentración de sustrato con la cual se alcanza la mitad
de la velocidad límite o velocidad máxima de la
reacción. Los resultados obtenidos experimentalmente
concuerdan con los derivados de modo matemático, sobre la
hipótesis de formación de un
complejo enzima – sustrato.
La constante de Michaelis, KM, indica en
términos generales, las relaciones de afinidad entre el
sustrato y la enzima; un KM, implica la necesidad de una alta
concentración de sustrato que, al combinarse con una
enzima, produzca la mitad de la velocidad máxima, o sea,
que la afinidad por la enzima y sustrato es pobre; por el
contrario, si la concentración de sustrato que se requiere
para alcanzar la mitad de la velocidad es muy pequeña (KM
pequeña), quiere decir que el sustrato tiene una gran
afinidad por la enzima.
En ocasiones, la misma enzima puede ser más
afín a un sustrato que a otro; por ejemplo, la sacarasa es
16 veces más activa para atacar a la sacarosa que a la
rafinosa. Se conocen con exactitud los valores de
KM para muchos sustratos y enzimas, con los siguientes: la
pepsina, actuando sobre albúmina, de huevo: KM de 4.5. por
ciento; la tripsina sobre la caseína :KM de 2 por ciento;
la amilasa sobre el almidón en presencia de Cl – :
KM de 0.4 por ciento ; la sacarasa de levadura, sobre la sacarosa
: KM 0.016 a 0.04 M, etc.
La explicación de la curva hiperbólica
que implica la formación del complejo enzima –
sustrato parece depender de la existencia física, en la enzima,
de determinados sitios donde se absorbe el sustrato para ser
activado. Al principio de la curva se puede aumentar la
concentración del sustrato y la enzima es capaz de
activarlo con toda eficiencia; pero
como una vez activado el sustrato se separa en forma de los
productos, y la velocidad con la que éstos se separan no
es igual a la velocidad con la que captado el sustrato, y en
vista de la cantidad creciente del sustrato, la línea
obtenida no es una recta, sino la curva señalada. Cuando
la cantidad de sustrato ha sobrepasado la capacidad física
de la enzima para recibirlo y poder
transformarlo, la curva alcanza una meseta, lo que significa que
la reacción prosigue a la misma velocidad,
independientemente de la cantidad de sustrato adicionada. De
acuerdo con los términos ligados a la velocidad de
reacción, expresados en la página 36, se encuentra
que, al principio del experimento, la reacción depende
exclusivamente de la concentración del sustrato y se trata
de una reacción de primer orden; al final de ella, cuando
hay un exceso de sustrato, la reacción es independiente de
la cantidad de sustrato y, por lo tanto, es de orden
cero.
Otra característica en relación con la
finalidad de la enzima por el sustrato es la comprendida en el
llamado número de recambio, el cual representa los moles
de sustrato atacados por un mol de enzima en una unidad de tiempo
determinada, generalmente un minuto. Este número de
recambio, en algunas ocasiones, es muy elevado, como sucede con
la catalasa que a 0º C., tiene un número de recambio
de 2.5 millones; es decir, un mol de enzima es capaz, en un
minuto, de desdoblar dos y medio millones de moles de
H2O2 ; el citrocomo c, a 38º C, tiene
un número de recambio de 1.4 X 103 ; la
carboxialasa a 30º C., da un número de recambio de 1
X 103 , etc.
Mecanismo Ping Pong
En la transaminación, la reacción
avanza a través de los fenómenos alternos de
adición de sustrato y liberación de producto
.
Iones sustrato
Estos facilitan la fijación del sustrato y la
catálisis por creación de varias de complejo de
puente constituidos por un enzima, metal y sustrato en la que os
iones metálicos pueden actuar como catalizadores
ácidos generales o facilitar la aproximación de los
reactantes.
Si a un sistema enzimático se añaden
sustancias que impidan la realización de la actividad
propia de la enzima, se dice que el sistema ha sido inhibido, y
la sustancia usada con estos fines se denomina
inhibidor.
Muchos inhibidores son agentes que desnaturalizan a las
enzimas, ya que éstas son moléculas
proteínicas, susceptibles a una diversidad de agentes,
especialmente químicos, como aniones complejos o metales
pesados, Zn ++, Pb ++, Ag ++, etc. A menudo estos agentes que
impiden la actividad enzimática actúan sobre casi
todas las enzimas, lo que demuestra que su acción no es
específica, sino que afectan a tosa molécula
proteínica . Tal es el caso de los inhibidores de
sufhidrilos, -SH, los cuales forman parte de una gran variedad de
enzimas. Otras sustancias bloquean específicamente
determinadas reacciones enzimáticas y su especificidad es
tal, que sólo cierto sustrato y cierta enzima son los
susceptibles.
De acuerdo con esto, es posible clasificar los
fenómenos de inhibición enzimática en
diversos grupos : inhibición por competencia e
inhibición por no competencia y
ésta, a su vez, en la debida a agentes desnaturalizantes y
a agentes inespecíficos.
20. Inhibicion por
competencia
En este caso el inhibidor no permite la formación
del complejo enzima – sustrato normal, ya que se forma un
complejo enzima – inhibidor ; una vez que el inhibidor
ocupa el lugar activo de la enzima, el complejo enzima –
inhibidor, no se separa, en vista de que la enzima no tiene
acción sobre el inhibidor y, por lo tanto, queda bloqueada
la parte activa de la enzima. El sustrato no puede entrar al
lugar activo, que está ocupado por el inhibidor y, de esta
manera, se impide la acción enzimática.
El ejemplo clásico de inhibición
competitiva es el de la enzima deshidrogenasa succínica
que, en presencia de ácido succínico en
ácido fumárico, reduciendo, simultáneamente,
al acceptor de H. Diversas sustancias parecidas al ácido
succínico, como el ácido malónico, el
oxálico y el glutárico, se pueden combinar con la
enzima e impiden su acción sobre el ácido
succínico.
Al añadir el inhibidor, la actividad
enzimática disminuye sin embargo, si se añaden
cantidades mayores del sustrato natural de la enzima (en el
ejemplo anterior, de ácido succínico) nuevamente
empieza a aparecer actividad enzimática, y cuando las
cantidades de ácido succínico añadido
sobrepasan considerablemente a las presentes del inhibidor, la
actividad enzimática se restablece por completo. Esta
situación representa, aparentemente, un fenómeno de
competencia entre el sustrato natural y el inhibidor para ocupar
el sitio activo de la enzima; la cantidad presente de una
sustancia o de otra , en un momento dado, en el sitio de la
reacción , determina si se dirige en un sentido o de otro;
si hay más inhibidor, la enzima queda bloqueada por
éste, y no se lleva a cabo la reacción
enzimática ; si aún en presencia de importantes
cantidades de inhibidor existen mayores cantidades del sustrato
natural, éste domina al inhibidor y llega a desplazarlo
introduciéndose en los sitios activos de la
enzima para permitir que se reanude la actividad
catalítica.
21. Inhibicion por no
competencia
Cuando las sustancias inhibidoras actúan
independientemente de la calidad del
sustrato natural presente, se trata de inhibición por no
competencia. En este caso, el inhibidor bloquea loas sitios
activos de la
enzima de modo irreversible ; en ocasiones se trata de la
desnaturalización de la enzima, como cuando se
añaden aniones o cationes que precipitan las
proteínas. En otros casos la combinación
irreversible se hace con sustancias que actúan de manera
específica sobre ciertos grupos activos de la enzima, o
sobre la conformación o estructura completa de ella ; sin
embargo, en estas circunstancias, se ven afectadas por igual
todos o cuando menos varios tipos de enzimas.
Existen algunos inhibidores no competitivos que muestran
cierta especificidad, como los agentes bloqueadores del radical
sulfhidrilo, -SH, presente en las cadenas laterales del
aminoácido cisteína, común a todas las
moléculas proteínicas y, por lo tanto, a las
enzimas. Entre los inhibidores de sulfhidrilos más
conocidos se encuentran el ferricianuro, el yodacetato, el famoso
gas usado con
fines bélicos, la lewisita, y otras sustancias de tipo
arsenical que deben sus efectos letales a su combinación
con los grupos sulfhidrilo de proteínas y enzimas de gran
importancia fisiológica.
Hay enzimas que contienen iones metálicos
indispensables para su actividad y que son susceptibles a la
acción inespecífica de agentes que afectan dichos
iones; tal es el caso de las enzimas con hierro que son
intoxicadas por medio del cianuro o el H2S. De la
misma manera, la adición de oxalato a un sistema puede
precipitar el calcio o el magnesio, e impedir la actividad de
enzimas que los requieren.
22. Antagonismo metaboloco
(antimetabolitos)
Las enzimas pueden ser inhibidas por diversos
compuestos, especialmente los que presentan una estructura
parecida al sustrato natural, como expresó en el caso del
ácido malónico y el ácido succínico
con respecto a la deshidrogenasa succínica.
Esta inhibición se denomina metabolitos las
sustancias presentes o producidas en el curso del metabolismo
celular, y antimetabolitos las sustancias parecidas a
aquéllos, y que impiden su aprovechamiento y
utilización ; en general, se trata de sustancias que
compiten, a nivel enzimático, en vista de su parecido
estructural, con los metabolitos naturales.
Numerosos hongos,
actinomicetos, bacterias,
etc., producen sustancias que muestran actividad contra otros
microorganismos. Estas sustancias se han denominado
antibióticos y, en principio, se deben considerar como
antimetabolitos que impiden, por razones de competencia , el
crecimiento de determinadas formas microbianas. En medicina ha
resultado del mayor interés el
aislamiento y la actividad de los antibióticos, ya que en
ciertas condiciones se usan para reprimir el desarrollo de
gérmenes patógenos para los seres
humanos.
El estudio de los antimetabolitos probablemente se
inició al observar que numerosas bacterias podían
crecer en un medio que tuviera sulfanilamida, que normalmente es
un inhibidor de su crecimiento, siempre que se añadieran
grandes cantidades de ácido p-aminobenzoico, una vitamina
necesaria para la nutrición celular. En
vista del parecido estructural entre las dos moléculas, la
sulfanilamida y el ácido p-aminobenzoico, se aceptó
que los fenómenos de inhibición tenían una
base estructural.
Entre los antibióticos, existen algunos de gran
utilidad
terapéutica, como la penicilina, aislada de diversos
hongos
Penicillium ; la estreptomicina, proveniente de cultivos de
Streptomyces griseus, y las tetracilinas, sustancias que tienen
amplio campo de acción de diversas infecciones producidas
por bacterias grampositivas o gramnegativas. Químicamente,
son sustancias complejas formadas por distintos grupos :por
ejemplo, la estreptomicina contiene glucosamina, estreptosa y
estreptidina. Algunos antibióticos son péptidos, de
tipo básico, aislados de bacterias, tales como la
gramicidina y las tirocidinas. Un ejemplo peculiar de
antibiótico producido por el hongo Pemicillium notatum es
la notatina, idéntica a la enzima glucosa oxidasa que
ataca a la glucosa permitiendo su conversión a
gluconolactona y ácido glucónico ; es posible que
de esta manera ejerza su acción de
antibiótico.
Muchos antimetabolitos suelen intervenir de modo
específico a nivel de las coenzimas o de los grupos
prostéticos, cuando éstos son del tipo de las
vitaminas. Se trata, por lo tanto, en estos casos, de
antivitaminas , muy comunes en las del grupo B. Así, la
tiamina modificada en su estructura química para formar
piritiamina o oxitiamina, no participa en los procesos de
descarboxilación.
El ácido piridín – 3
sulfónico impide la acción de la vitamina natural
parecida a él, o ácido nicotínico y perturba
numerosas reacciones de deshidrogenación. La piridoxina es
antiorganizada por la desoxipiridoxina y la biotina, de la misma
manera, por la destiobiotina. Se han preparado numerosas
sustancias parecidas a las bases púricas y
pirimidínicas con la finalidad de bloquear los sistemas de
formación de proteína, que dependen de la presencia
de ácidos nucleicos que contienen dichas bases, en el
interior de la células; estos trabajos se han planeado
para deprimir la velocidad de desarrollo de células
cancerosas. Entre las sustancias obtenidas en fechas recientes se
puede señalar el grupo del 5 – fluorouracilo, que
produce inhibición tumoral por el siguiente mecanismo, que
puede ser común a un gran número de sustancias con
estas propiedades : en el tumor falta la enzima que destruye el
antimetabolito, en este caso el 5 – fluorouracilo, el cual
se vuelve muy agresivo hacia el tumor ya que no es degradado por
él; en cambio, dicha sustancia es menos tóxica para
el tejido normal que sí está en posibilidad de
destruirlo.
De gran importancia en el fenómeno de la
actividad enzimática es el hecho de que, en las
proteínas, pueden existir dos (o cuando menos dos) sitios
diferentes desde el punto de vista estereo- específico y
que, además, estén en lugares distintos. Un de
estos sitios es el centro activo, donde el sustrato es atacado
para dar origen a los productos de la reacción y por lo
tanto donde reside el aspecto funcional de la proteína. El
otro sitio denomina sitio alostérico y en él puede
acomodarse de manera complementaria – pero reversible – alguna
sustancia llamada efector alostérico ; al efectuarse esta
unión se produce una alteración discreta de la
estructura de la proteína, la transición
alostérica, que modifica la actividad biológica de
la proteína, porque altera la distancia, las propiedades
del sitio activo.
Es muy importante que el efector alostérico
normal no tiene relación química o
metabólica alguna con el sustrato de dicha enzima y que su
acción tan específica se debe a que altera de tal
modo la conformación de la proteína que modifica su
centro activo.
El efecto alostérico se ha estudiado de manera
especial en bacterias, pero ocurre también en animales
superiores. En un principio se reconoció como un efecto
inhibidor que, por su características, fue denominado "por
retro- alimentación" o "por producto final" . En
rigor, en las bacterias, es la regla que el metabolito formado al
final de un camino metabólico, resulte un poderoso
inhibidor de su propia síntesis. Parte de la
explicación de este efecto (pág. 535) se debe a que
dicho metabolito inhibe específicamente a una sola enzima
localizada en el camino metabólico que forma a dicha
sustancia, y de manera curiosa, la enzima sensible al metabolito
final es la primera de este camino metabólico.
En un ejemplo de camino A B C D E, siendo E el
metabolismo final, éste inhibiría a la primera
enzima la que forma B a partir de A. En este capítulo en
que se estudia la regulación metabólica se analizan
con detalle algunos de estos ejemplos y las reacciones
químicas individuales afectadas. La inhibición
alostérica demuestra la alta especialización de las
enzimas que reconocen tanto al sustrato como al inhibidor, siendo
muy específicas para ambos. Como químicamente el
sustrato y el efector alostérico son muy distintos, se
acepta que la unión con la enzima debe efectuarse en
sitios diferentes, lo que ha demostrado con mutantes bacterianas
no sensibles al efector alostérico . Además, no hay
interacción directa entre el sustrato y el inhibidor
puesto que los sitios receptores están muy
separados.
Las proteínas alostéricas pueden
corresponder a polímeros, es decir, a moléculas
compuestas de sub- unidades idénticas, con ejes de
simetría definidos. El hecho de que se agreguen las
subunidades, por una parte, y el que al estar en forma
polimérica adopten diversas situaciones conformaciones,
hace susceptibles a la enzima a los inhibidores, o por el
contrario, a recibir (fig. 3-10) al sustrato y llevar a efecto su
acción característica. Más aún, para
el caso de la transcarbamilasa aspártica
se ha demostrado que una subunidad se combina con el sustrato y
otra, distinta, con el inhibidor. Estos fenómenos
adquieren una importancia de tipo general, al demostrarv que es
factible modificar la acción de las enzimas por cambios en
la estructura cuaternaria de las proteínas, basados en la
asociación y disociación de subunidades. Algunos
ejemplos particulares son los siguientes : la deshidrogenasa
glutámica, con peso molecular de cerca de 1 millón
puede partirse en subunidades de 250 000 por diversos agentes :
DPN, ADP, estrógenos tiroxina y ciertos aminoácidos
. Otro ejemplo es la carboxilasa de la acetil coenzima. A, que es
activada por la adición de citrato, el cual cambia el
coeficiente de sedimentación de la enzima de 18 S a 43 S,
o sea la molécula pasa a forma de polímero activo a
partir de monómeros inactivos. Un caso ya clásico
es el de la fosforilasa inactiva que se convierte en activa
cuando se fosforila; la estructura inactiva está formada
por 2 unidades y la activa por 4.
24. Enzimas: regulacion de
actividades
La regukacion del metabolismo logra la
homeostacia
La regulación de la actividad enzimática
contribuye en gran parte a preservar la homeostasia que, mantiene
un entorno intracelular e intraorgánico relativamente
constante en presencia de fluctuaciones amplias en al medio ambiente
externo, como cambios de temperatura,
presencia o ausencia de agua o tipos específicos de
alimentos.
Como conservar la homeostasia
Las concentraciones locales de sustrato ,
compartición de enzimas y secreción como proenzimas
o cimogenos ( como por ejemplo la quimiotripsina ) sin actividad
catalítica contribuyen a la regulación de los
procesos metabólicos . Además , las alteraciones
rápidas y mínimas en la actividad catalítica
de enzimas reguladas clave tienen funciones importantes en la
canalización selectiva de metabolitos hacia uno u otro
proceso metabólico .
Las enzimas reguladoras
Tienden a ser aquellas que catalizan una reacción
temprana única ( con frecuencia la primera ) de una
secuencia determinada de reacciones metabólicas
.
La actividad catalítica de las enzimas reguladas
puede modularse por ejemplo ,cambios repetidos entre estados bajo
y alto de actividad catalítica ; cuando no hay
síntesis proteínica nueva ni degradación
proteínica .
La modulación se logra cuando matabolitos
específicos se unen en forma covalente y no covalente, a
la enzima regulada en general a sitios ( alostéricos )
bastantes separados del sitio catalítico .
Tres mecanismos generales regulan la actividad
enzimatica
Por ejemplo el flujo neto de carbono en una
reacción catalizada en una reacción
enzimática podría ser influido
- Cambiando la cantidad absoluta de enzima presente
. - Alterando el tamaño del conjunto de sustancias
reaccionantes distintas de la enzima. - Alterando la eficacia
catalítica de la enzima (estas tres opciones son
utilizadas e casi todas las formas de vida).
La modulación de actividad enzimática por
cambios en la conformación del sitio catalítico
puede incluir la alteración de Km para un sustrato de Vmax
para la reacción global o para efectos sobre los dos, Km y
Vmax.
A menudo las curvas de saturación de sustrato
para la inhibición alostérica son sigmoideas, por
ende la ecuación de Michaelis Menten no se
aplica.
- Rodwel. et alli Bioquimica de Harper, 13ª ed.,
s.d. - Laguna, Jose Bioquimica, 2ª ed., Facultad de
Medicina,
UNAM, Mexico D.F., Fournier S.A., 1969.
Tema : Enzimas
Curso : Química
Año:1999
Resumen: trata de las enzimas, que tienen el poder de
catalizar, facilitar, y agilizar determinados procesos
sintéticos y analíticos de la vida , contiene la
evolucion de la enzimologia caracteriasticas como actuan en el
organismo , etc
Trabajo enviado y realizado por:
Marco Ludeña
Universidad
Peruana Cayetano Heredia
2 año en la facultad de estomatologia
marcolud[arroba]LatinMail.com
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