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La enzimología (página 2)

Enviado por marcolud



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11. Coenzima y grupos prostéticos

Aparte del sustrato, cuya transformación será condicionada por la enzima, existe otra parte del sistema enzimático, de peso moléculas bajo y por lo tanto dializable, termostable y en general, no protéica, adherida de mas o menos laxa a la apoenzima y a la cual se le llama grupo prostético, si está muy intimanente ligada a la apoenzima – como es el caso del núcleo porfirínico de numerosas oxidasas o la estructura flavínica de la deshidrogenasa succínica – o coenzima cuando la unión es débil y se separan fácilmente, como por ejemplo el DPN y el TPN que asisten a las funciones de varias deshidrogenasas. Es muy grande la importancia del grupo prostético o de la coenzima desde el punto de vista funcional pues suelen ceder y recibir alternadamente parte de los productos de la reacción. Por ejemplo en las reacciones de oxido – reducción los hidrógenos desprendidos de un sustrato deben ser captados por una sustancia con lo que se expulsa al sustrato oxidado y es posible recibir una nueva molécula del sustrato con hidrógenos. Tal sustancia es una coenzima, como el DPN, el TPN, el FAD, etc., que, a su vez, suele cederlos a una tercera sustancia o, cuando las reacciones son reversibles los pasan al sustrato oxidado para reducirlo. Algunos autores denominan cosustratos a estos agrupamientos coenzimáticos para hacer énfasis en su carácter reversible, no catalítico y equimolecular con respecto al sustrato. Una proporción de las vitaminas forman parte de moléculas mas complejas que funcionan como coenzimas en diversas reacciones.

  • Muchas enzimas requieren una coenzima

Muchas enzimas que catalizan la transferencia de grupos y otras reacciones requieren, además de su sustrato, una segunda molécula orgánica conocida como coenzima sin la cual son inactivas. Para distinguirlas de iones metálicos activadores y de las enzimas mismas, las coenzimas se definen como compuestos orgánicos termoestable, de peso molecular bajo, requeridas para la actividad de las enzimas. La mayor parte de las coenzimas se unen a las enzimas por fuerza no covalentes. Las que forman enlace covalentes con las enzimas se denominan también grupos prostéticos.

Entre las reacciones que requieren coenzimas están las oxidorreducciones, las reacciones de transferencia de grupo e isomerización y las reacciones que forman enlaces covalentes (claves 1,2,5 y 6;IUB). Las reacciones líticas que comprenden reacciones hidrolíticas catalizadas por enzimas digestivas no requieren de coenzimas.

  • Las coenzimas pueden considerarse como segundo sustrato

La coenzima puede considerarse como un segundo sustrato o cosustrato por dos razones. En primer lugar, los cambios químicos en la coenzima compensa exactamente a los que realizan en el sustrato. Por ejemplo, en las reacciones o oxidorreducción (deshidrogenasa), una molécula de sustrato es oxidasa y una molécula de coenzima es reducida.

Una segunda razón para dar igual énfasis a las reacciones de la coenzima es que, en realidad, este aspecto de la reacción es el que puede ser de significado fisiológico fundamental. Por ejemplo, la importancia de la capacidad del músculo que trabaja en condiciones anaerobias para convertir el piruvato en lactato no residen en el piruvato ni en el lactato.

La reacción sirve solamente para oxidar la coenzima reducida NADH a NAD+. Sin NAD+ la glucólisis no puede continuar y la síntesis anaerobias de ATP (y por tanto, el trabajo) tiene que cesar. En condiciones anaerobias, la reducción del piruvato en lactato reoxida al NADH y permite la síntesis de ATP. Otras reacciones pueden servir igualmente bien. Por ejemplo, en las bacterias o levaduras que crecen en medio anaerobio, algunos metabolitos derivados del piruvato son utilizados como oxidante para el NADH y son reducidos en el proceso.

  • Las coenzimas funcionan como reactivos en la transferencia de grupos

Las reacciones bioquímicas de transferencia de grupo del tipo.

D – G + A = A – G + D

En la cual un grupo funcional, G es transferido de una molécula denadora, D-G, a una molécula aceptora, A, por lo general comprende la participación de una coenzima como último aceptor (por ejemplo, reacciones de dehidrogenación) o como portador intermediario del grupo (por ejemplo, reacciones de transaminación). El esquema siguiente muestra el último concepto.

D-H CoE A-G

D CoE-G A

Aunque estos sugiere la formación de un complejo sencillo CoE-G, durante el curso de la reacción global, pueden intervenir varios complejos intermediarios CoE-G en una reacción particular (por ejemplo, transaminación).

Cuando el grupo transferido es el hidrógeno, es costumbre representar sólo la "mitad izquierda de la reacción":

D-H CoE

D CoE-H

Que esto representa en realidad sólo un caso especial de la transferencia general de grupos puede apreciarse mejor en términos de las reacciones que ocurren en las células intactas. Se pueden representar de las siguientes manera:

D-H CoE A-H

D CoE-H A

  • Las coenzimas pueden clasificarse de acuerdo al grupo cuya transferencia facilitan

Basándose en este concepto podría clasificarse a las coenzimas como sigue:

Para la transferencia de grupos distintos del hidrógeno:

  • Fosfatos de azúcares
  • CoASH
  • Pirofosfato de tiamina.
  • Fosfato de piridoxal
  • Coenzimas del folato
  • Biotina
  • Coenzimas de cobamida (B12)
  • Ácido lipoico
  • Para la transferencia del hidrógeno:
  • NAD+, DADP+
  • FMN, FAD.
  • Ácido lipoico
  • Coenzima Q.

-Muchas coenzimas derivan de vitamina B y del monofosfato de adenosina

Las vitaminas B forman parte de la estructura de numerosas coenzimas. Las vitaminas B; nicotinamida, tiamina, riboflavina y ácido pantoténico son constituyentes esenciales de las coenzimas para las oxidaciones y las reducciones biológicas y las coenzimas ácido fólico y cobamida funcionan en el metabolismo de compuestos de un solo carbono. Numerosas coenzimas contienen adenina, ribosa y fosfato y se derivan del monofosfato de adenosina AMP. Los ejemplos incluyen NAD+ y NADP+

12. Activadores

Las enzimas son catalizadores orgánicos que disminuyen la barrera denominada energía de activación; y por tanto facilitan el que se inicie una reacción. Este proceso implica el trabajo necesario para poner a dos moléculas en un contacto lo suficientemente estrecho como para que reaccionen; además, el trabajo debe realizarce sobre la unión química – una con covalencia en sentido estricto – para que pueda romperse y formar otros compuestos. Las enzimas, como muchos catalizadores, son partículas de gran superficie y muestran que tienen capacidad para atraer y captar diversas moléculas. Cualquier factor que permita por una parte atraer al sustrato a su centro activo se pude considerar como un activador, además algo que permita la rápida salida de los productos también pude considerarse como un activador. Asi se reconocen diversas posibilidades:

  • Activación iónica. Numerosos metales monodivalentes son necesarios para la actividad enzimática de diversos sistemas. Destacan entre ellos los siguientes: K+, Mn++, Mg++, Ca++, Fe+++, Cu+, Cu++, etc. A menudo el metal, a estas condiciones, es el centro que permite la unión conjunta del sustrato, de la coenzima y de la misma apoenzima con la que forma quelatos (de chelos, garra; complejos moleculares sostenidos por un metal) al unirse con grupos cargados electricamente. Muy amenudo se demuestra que es posible sustituir los metales divalentes entre ellos, sin grandes modificaciones de la velocidad de la reacción.

Los metales como el hierro, el cobre y el molibdeno, actúan a menudo como transportadores de electrones y no se les puede considerar activadores en el sentido estricto pues forman parte integral del grupo prostético. Algunos aniones también son necesarios para la actividad de ciertas enzimas; bien conocido es el caso del Cl-, el que puede sustituirse, a un cuando con baja de la velocidad, por Br-, para la amilasa salival; o el propio radical fosfato que se requiere en reacciones de fosforilación.

  • Activación por el grupo prostético. En determinadas reacciones estos son indispensables para el trabajo de la enzima y constituyen, en rigor, la parte funcional activa del sistema.
  • Activación de la apoenzima. Consisite en la obtención de una correcta estructura del centro activo de la proteina con actividad enzimática, ya referido anteriormente.
  • Integridad de los grupos funcionales del centro activo. Destaca la relacionada con los grupos sulfhidrilo, -SH. Cualquier alteración química que los destruya, bloquee u oxide a disulfuro, -S-S-, puede inactivar a las enzimas. Esto puede suceder incluso en las suaves condiciones del trabajo celular por exposición a agentes oxidantes o al oxigeno mismo, aunque puede lograrse por el efecto de sustancias que los ataquen y que combinen con ellos como la yodacetamida. En otras ocaciones la destrucción de los grupos –SH, aun la distancia del centro activo modifica de tal manera la estructura tridimencional de la enzima que el centro activo se deforma al grado de que no puede llevar a efecto su acción sobre las sustancias reaccionantes. Existen otros grupos funcionales cuyo bloqueo acaba por completo con la actividad enzimatica; en tal caso estaría la acción de inhibidores o venenos enzimáticos.
  • Medida de la actividad enzimática. Aparte del problema de medir las pequeñísimas cantidades de enzimas presentes en los tejidos; muy pocas de ellas poseen características químicas o espectroscópicas particulares que permita medirlas directamente. En general, las enzimas se cuantean siguiendo la actividad de la reacción que catalizan y se aceptan, en principio que dicha actividad es proporcional a la cantidad de enzima presente. Como la actividad de un enzimas sólo rara vez se puede expresar en relación a su peso absoluto o a la molaridad de la enzima, lo habitual es expresarla en "unidades" fijadas de modo convencional con relación a la proteina presente en la preparación.

La actividad enzimática se mide por la desaparición del sustrato o la aparición de alguno de los productos de la reacción, siguiendo dichos cambios en el tiempo. Sin embargo, las condiciones del sistema no son uniformes a lo largo del tiempo: el grado de saturación de la enzima con el sustrato cambia constantemente, los productos que aparecen suelen inhibir a la enzima o se presentan modificaciones del pH que afectan a la reacción, etc. Para evitar estos problemas se hace la medida de la velocidad inicial, tomando en cuenta solo el comienzo, en forma de línea recta de la gráfica, lo que sucede en general cuando se ha consumido no más de una cuarta parte del sustrato.

La actividad puede espresarce, una vez determinada la reacción, en relación con el tiempo empleado por la enzima para producir un cambio determinado; mientras mayor sea el tiempo, la actividad de la enzima es menor. Por lo tanto, la recíproca del tiempo (la inversa del tiempo osea el valor que resulta de dividir la unidad sobre el tiempo, 1/T) es una medida de la actividad enzimática.

13. Las enzimas son catalizadores estereoespecíficos

Casi todos los sustratos forman por lo menos tres enlaces con las enzimas. Esta adherencia en tres puntos pueden conferir asimetría a una molécula por otro lado simétrica. La figura * muestra una molécula de sustrato, representada como un átomo de carbono que tiene tres grupos diferentes, próximos a adherirse en tres puntos a un sitio de la enzima. Si el sitio puede ser alcanzado sólo desde un lado y únicamente los átomos complementarios y los silios pueden interactuar (ambos suposiciones válidas para las enzimas reales), la molécula se unirá sólo en una forma. La reacción misma puede estar confinada a los átomos unidos en los sitios 1 y 2 aún, cuando los átomos 1 y3 sean idénticos. Girando mentalmente la molécula de sustrato en el espacio, nótese que puede adherirse en tres puntos a un costado del sitio planar con una sola orientación. En consecuencia, los átomos 1 y 3 aunque sean idénticos viene a ser distintos cuando el sustrato está adherido a la enzima. Por tanto, un cambio químico puede afectar el átomo uno (pero no al átomo tres) o viceversa. Esto puede explicar el porqué la reducción, catalizada enzimáticamente de la molécula del piruvato ópticamente inactiva, forma L- y no D,L-lactato.

14. Especificidad enzimática

Los distintos grupos de enzimas muestran variaciones considerables en su grado de especificidad. Algunas de ellas muestran requerimientos estrictos tanto para el sustrato (o los sustratos si se trata de reacciones bimoleculares) como para el tipo de unión química sobre el que van a actuar; pequeños cambios en cualquiera de ellos bastán para inactivar la reacción; tal es el caso de la mayoría de las enzimas. En otras ocaciones, la deshidrogenasa alcohólica, que funciona con DPN como coenzima, es absolutamente específica para el DPN, pero pude actuar sobre diversos alcoholes aparte del etílico que es su sustrato característico. Asi mismo, las enterasas, las fosfatasas y ciertas peptidasas a menudo solo son específicas para el tipo de unión atacada – éster, peptídica, etc. – y no requieren estructuras definidas en el sustrato, a ambos lados de la unión. Hay ejemplo de especificidad doble: la xantina oxidasa, altamente específica para la xantina a la que convierte en ácido úrico, y por otro lado muy activa, pero en forma inespecífica, al mostrar gran capacidad para mostrar la activación de gran variedad de aldehidos.

El requisito de estereoespecificidad para los sustratos es muy importante. Las enzimas que habitualmente atacan a los azúcares naturales con configuración D-, no lo hacen sobre sus isómeros artificiales L-; las enzimas tan activas en la naturaleza sobre los aminoácidos comunes tipo L- so inactivas para los aminoácidos artificiales (o muy raros en los organismos vivos) de tipo D-. Esto es tan absoluto que cuando existen mezclas racémicas de isómeros D- y L-, un método conveniente de separarlas, es el de dejar que actue sobre ellas una enzima que degradará exclusivamente a uno de los dos isómeros dejando al otro intacto.

Cuando el sustrato es simétrico y el producto es asimétrico, la enzima provoca, específicamente, la formación de uno solo de los productos asimétricos, aquel para el que la enzima es activa; tal es el caso de la deshidrogenasa láctica que, al actuar sobre el ácido pirúvico (simétrico) produce exclusivamente ácido D-láctico y no ácido L-láctico, y el de la deshidrogenasa glutámica que al atacar el ácido a -cetoglutárico produce solo ácido L-glutámico:

CH3CH3

| |

C = O HCOH

| |

COOH COOH

Ácido pirúvico Ácido D-láctico

Existen otras formas de isomerismo geométrico aparte del isomerismo D-, L-, suceptibles de ser reconocidas por enzimas. Tal es la situación de los isómeros cis – trans en que solo uno de los tipos del par es atacado. La fumarasa introduce una molécula de agua en el ácido fumárico trans, pero el isómero cis, o sea el ácido maleico, no es atacado.

H – C – COOH H – C – COOH

HOOC – C – H H – C – COOH

Ácido fumárico (trans) Ácido maléico (cis)

Las enzimas también pueden distinguir moléculas que desde el puntod e vista estructural, como compuestos químicos, son identicas. Por ejemplo, la glicerol cinasa, por medio de ATP, convierte al glicerol en L-grlicerol – 3- fosfato, osea produce su fosforilación, pero exclusivamente en la posición 3, hecho que se ha demostrado con glicerol marcado con C radiactio, C14, en las dos posiciones posibles 1 y 3.

Los mismo sucede con el ácido cítrico que al ser oxidado y descarboxilado hasta producir ácido a -cetoglutárico adquiere un grupo –C=O, en uno de los lados de la molécula, quimicamente simétrica. Esta capacidad de la enzima para reconocer el sustrato obedece a que debe tener por lo menos tres grupos químicos orientados en el espaciod e tal modo que el sustrato, aunque en apariencia simétrico, solo puede adaptarse por completo a la enzima en una sola posición. De todo esto se desprende por el sustrato a los sustratos necesitan tener un patrón peculiar de grupos químicos, específicos para cada enzima particular, de modo que se adapte perfectamente a su centro activo; mientras mayor y más complejo sea este requerimiento mayor será la especificidad de la enzima.

15. Preparación y purificación de las enzimas

Aun cuando se sabe que las propiedades de las enzimas in situ puden ser muy diferentes a las de las enzimas puras estudiadas en el laboratorio, está plenamente justificada la necesidad de tener preparaciones puras para hacer el estudio químico completo de su actividad. En la actualidad se han cristalizado o purificado de manera adecuada cerca de unas 200 enzimas (del posible total de unas 5000 ) y quizas en los próximos años aumente de modo considerable este número.

Para extraer las enzimas de las células que las contienen, a menudo es necesario dividir finamente el tejido, por medio de un homogeneizador o una licuadora; los tratamientos más enérgicos comprenden la molienda del tejido con arena el empleo de vibraciones ultrasónicas, los procesos alternados de congelamiento y descongelamiento, la autolísis , el desecado con calor o el emmpleo de solventes como la caetona, el éter y el tolueno. El desecado con acetona y la producción de los llamados polvos acetónicos constituyen un excelente ejemplo de rotura de la menbrana celualr y la obtención de un material rico en enzimas y de fácil concervación. Cuando las enziams están asociadas a lípidos, como sucede con als enzimas mitocondriales, es ventajoso el tratamiento con sustancias de tipo detergente o con butanol que disgregan la estructura lipoprotéica y permiten la salida de las enzimas.

La purificación de las enzimas con método de precipitación fraccionada recurre a diversos procedimientos, el cambio de pH quita las nucleoproteínas y el material grueso, con lo que se facilitan los pasos siguientes. Con el empleo del calor a veces se logra la desnaturalización de material protéico inactivo; por ejemplo, en la purificación de la transaminasa se añade el sustrato de la enzima – ácido a - cetoglutárico – al homogenado y se calienta hasta 65° C, con lo que muchas enzimas se desnaturalizan y precipitan, lo que no sucede con la transaminasa así protegida.

En otros casos se emplean solventes orgánicos como el etanol, muy utilizado para separar diversas proteínas del suelo sanguíneo y la caetona; o las sales, como el sulfato de amonio, que es muy soluble en agua, por lo que se puede manejar a elevadas concentraciones, y en general no ataca la estructura de las enzimas. la absorción fraccional tiene gran utilidad para absorver gran material indeseable o para absorber la enzima y luego desprenderla del material absorbente en una forma más pura; muy usado con este fin en el gel de aluminio C.

En los últimos años se han logrado adelantos notables en materia de fraccionamiento protéico con el empleo de técnicas coromatográficas en columnas que se basan en fenómenos de absorción, de intercambio iónoco o de una verdadera "filtración molecular". Se agraga a una columna con el material activo la solución de la enzima que queda fijada a dicho material; se lava la columna con soluciones de sales, cada vez más concentradas o con distinto pH, etc. , y se recogen los lavados en fracciones de volúmenes determinadas; en alguna porción sale la enzima en estudio, en forma más pura. Los materiales más usados para este fin son ciertas formas de fosfato de calcio – hidroxiapatita -, resians de intercambio iónico, como las Amberlitas o las Dowex (aunque tienen el inconveniente de desnaturalizar a las proteínas y de tener poca superficie útil) y diversos derivados de la celulosa, tales como la dietilaminoetil celulosa (DEAE – celulosa) y la carboximetil celulosa (CM – celulosa). Ejemplos de los filtros moleculares lo constituye el material que está compuestod e un polisacárido que forma una rejilla tridimensional, el Sephadex, que puede retener proteínas con peso molecular aproximado de 25 000 hasta 200 000 según el tipo que se emplee.

El paso final de la purificación es el de la cristalización de la enzima que debe repetirse varias veces pues los primeros cristales suelen estar contaminados con otras enzimas. A pesar de esto, la obtención de cristales no demustra que la enzima esté 100% pura, es solo obtención de una actividad específica de un valor constante ante las recristalizaciones repetidas la que ofrece la seguridad de su pureza.

El estudio de la pureza de una enzima comprende la aplicación de las técnicas empleadas para el estudio de la pureza de las porteínas, el análisis por ultracentrífuga, el análisis el electroforético, etc. Sin embargo, aún es podsible, si se somete la enzima a fraccionamientos más sensitivos, como losd e la electroforésis en gel de agar, de almidón, o de acrilamida demostrar que la enzima en cuestión puede estar formada por varias proteínas, algunas de las cuales tienen la misma actividad enzimática, pero que por tener propiedades físicas o estructurales diferentes se deben considerar como isoenzimas, y otras que son proteinas que se han procesado a lo largod e todas las etapas de purificación.

En general las enziams se consideran especies químicas homogéneas y puras cuando llenan requisitos como los siguientes: su actividad no debe aumentar después de que se la recristaliza repetidas veces; su solubilidad no aumenta al elevar la cantidad de cristales de la proteína problema que se pone en solución; tanto en el análisis realizado con la ultracentrífuga como en los diversos métodos electroforéticos se encuentra un patrón de mobilidad único y persistente.

16. Isoenzimas

Al hacer el estudio electroforético del suero humano normal y hacer un revelado de la actividad de la deshidrogenasa láctica se encontró distribuida en cinco bandas diferentes; se llegó así al concepto que es posible que en un tipo de tejido existan diversas y múltiples formas moleculares de una enzima, a las que se denominan isoenzimas. Son por lo tanto proteínas con actividad catalítica que favorece la misma reacción pero que pueden distinguirse por alguna característica física, estructural, inmunológica, etc. En el ejemplo antereior sus diferencias se rejistraron en la velocidad de migración electroforética. En otras ocaciones la diferencia eside en las propiedades cinéticas; por ejemplo, existen dos deshidrogenásas málicas que catalizan la misma reacción; sin embargo, actuan de modo distinto cuando se les pone en contacto con los análogos artificiales del DPN y, además, una es de origen mitocondrial, la otra se encuentra en el sobrenadante celular.

Sin embargo, este concepto tiene sus limitaciones; el caso de la deshidrogenasa láctica es muy ilustrativo. Esta enzima se diferencia en 5 isienzimas denominadas I, II, III, IV y V que parecen ser características de distintos tejidos; en el corazón dominan el I y la II, el higado tiene un predominio de la V, etc. al tratar la enzima –que pesa 135 000 – con úrea o guanidina, su molécula se fragmenta en cuatro porciones, cada una de las cuales tiene un peso molecular de unos 35 000. Las cinco isoenzimas comunes de la hidrogenasa láctica parecen sermezclas de dos tipos básicos A y B, o H (de "heart", corazón) y de m (músculo) de la siguiente manera:

HHHH Tipo I, miocárdico, H

HHHM Tipo II

HHMM Tipo III

HMMM Tipo IV

MMMM Tipo V, muscular, M

Se ha confirmado inmunológicamente su presencia; los anticuerpos preparados contra ambas moléculas originales H o M nomuestran reacción cruzada entre si, pero si reaccionan con los híbridos formados de H y de M. Del mismo modo, muestran diferencias considerables en su composición de aminoácidos.

No solo las características fisicoquímicas son diferentes; quizá aun más importante sea el aspecto funcional. La actividad de las deshidrogenasas lácticas ante sus sustratos normales, lactato, piruvato, y ante los análogos del DPN indican el papel de la enzima en la regulación de las relaciones DPN/DPNH2, que a su vez, regulan funciones celulares importantes. Es muy notable la diferencia en la inhibición producida por un exceso de piruvato sugerente de que, en rigor, la enzima tipo M o V funciona más bien como una reductasa del piruvato. Esta forma (M o V) es muy útil en los músculos voluntarios que presentan demandas bruscas de energía proporcionadas por la glucólisis, o en tejidos con poco oxígeno (anaerobiosis). Por el contrario la tipo H (I) funcionan preferentemente en músculos que deben realizar un ejercicio sostenido y en los que las necesidades energéticas se satisfacen por medio de un metabolismo aeróbico intenso; este tipo, por lo tanto, está capacitado, funcionalmente, para lograr una mayor exidación del lactato a ácido pirúvuco.

La distribución de la enzima con respecto a la aerobiosis (o anaerobiosos) del tejido se ha comprobado en varios casos: la de tipo H (I) es más abundante en la corteza renal (cerca de 100%) que en la médula (50%) en las papilas (10%), en razón directa con el grado deaerobiosis de esas zonas renales. Lo mismo sucede con músculos de un mismo animal; si tienen que trabajar constantemente muestran grandes proporciones de la forma H (I), como el dorsal ancho de las gallinas que casi en el 100% muestran dicha forma; el pectoral, en cambio tiene menos del uno por ciento de ella, en cambio, en los pectorales de las aves migratorias que deben sostener por horas y aun días, esfuerzoz extraordinarios, aparece nuevamente la forma H (I) de preferencia a la M (V).

Es obio que cuando son muy marcadas las diferencias de pesos moleculares, composición de aminoácidos, características cineticas y otras propiedades físicas, es dificil hablar de isoenzimas; más conveniente es considerarlas entonces como enzimas distintas que simplemente catalizan la misma reacción reservando el término de isoenzima para aquellas situaciones como la de la deshidrogenasa láctica que representan agregados híbridos de composición relativamente parecida.

17. Cinetica de las reacciones enzimaticas

Aunque las leyes generales de la catálisis debieran ser válidas para las enzimas, el hecho de que éstas sean sustancias complejas, de alto peso molecular, de tamaño coloidal y de composición difícil de precisar, impide la aplicación de dichas leyes de una manera estricta; por ejemplo, su tamaño coloidal puede causar fenómenos de adsorción o diversas reacciones debidas a sus numerosas cargas eléctricas. No obstante, los factores que afectan la velocidad de la reacción enzimática son los ya señalados a propósito de las reacciones químicas en general, como la temperatura y las concentraciones de las sustancias reaccionantes que, en este caso particular, son la enzima el sustrato. Además intervienen el PH medio donde se realiza la reacción, la presencia de los productos de la reacción, y otros factores secundarios como las radiaciones y los efectos óxido – reductores.

18. Relaciones entre la enzima y el sustrato.

Es universalmente aceptado, que la enzima, como todo catalizador, participa de una manera activa en la reacción. Existen pruebas experimentales de esta situación cuando menos para algunos.

Un ejemplo bien conocido es el de la peroxidasa que, en presencia de peróxido de hidrógeno, H2O2, y un acceptor de hidrógeno adecuado, produce la reducción del H2O2, . La peroxidasa en ausencia de H2O2 muestras unas bandas de absorción características en el espectro visible; cuando se combina con el H2O2 , pero sin que exista el acceptor de los hidrógenos, aparece una nueva distribución de las bandas. Si se permite el paso de los hidrógenos a un acceptor, automáticamente desaparecen las bandas nuevas y reaparecen las originales de peroxidasa.

Se acepta corrientemente una hipótesis propuesta por Michaelis para explicar la actividad enzimática, sobre la base de la información de un compuesto de la enzima con el sustrato (complejo enzima – sustrato), previamente al ataque del sustrato por la enzima y a la liberación de los productos de la reacción. El desarrollo matemático que permitió a Michaelis formular su hipótesis, estuvo acorde con los datos experimentales obtenidos una vez vencidos los enormes obstáculos de orden técnico para llevar a cabo la confirmación de la teoría en el laboratorio.

Si se hace el estudio de la actividad de una enzima en relación con la concentración de sustrato. En ella se registran, en las abscisas, la cantidad creciente de sustrato y, en las ordenadas, la cantidad de uno de los productos de la reacción liberada de un tiempo dado, que expresa, en rigor, la actividad de la enzima. La curva obtenida es la de una hipérbola rectangular, la cual tiene algunas propiedades interesantes; por ejemplo, la velocidad límite o velocidad máxima, es el valor que trata de alcanzar la curva a medida que se aumenta el sustrato y que, en la figura, está señalada con la línea V. Existe un punto, fijado arbitrariamente, en el que la mitad de la velocidad límite corresponde a una concentración específica del sustrato; esta concentración de sustrato se representa habitualmente como KM, y se denomina constante de Michaelis, valor característico para un par – enzima – sustrato y que, por lo tanto, es la concentración de sustrato con la cual se alcanza la mitad de la velocidad límite o velocidad máxima de la reacción. Los resultados obtenidos experimentalmente concuerdan con los derivados de modo matemático, sobre la hipótesis de formación de un complejo enzima – sustrato.

La constante de Michaelis, KM, indica en términos generales, las relaciones de afinidad entre el sustrato y la enzima; un KM, implica la necesidad de una alta concentración de sustrato que, al combinarse con una enzima, produzca la mitad de la velocidad máxima, o sea, que la afinidad por la enzima y sustrato es pobre; por el contrario, si la concentración de sustrato que se requiere para alcanzar la mitad de la velocidad es muy pequeña (KM pequeña), quiere decir que el sustrato tiene una gran afinidad por la enzima.

En ocasiones, la misma enzima puede ser más afín a un sustrato que a otro; por ejemplo, la sacarasa es 16 veces más activa para atacar a la sacarosa que a la rafinosa. Se conocen con exactitud los valores de KM para muchos sustratos y enzimas, con los siguientes: la pepsina, actuando sobre albúmina, de huevo: KM de 4.5. por ciento; la tripsina sobre la caseína :KM de 2 por ciento; la amilasa sobre el almidón en presencia de Cl – : KM de 0.4 por ciento ; la sacarasa de levadura, sobre la sacarosa : KM 0.016 a 0.04 M, etc.

La explicación de la curva hiperbólica que implica la formación del complejo enzima – sustrato parece depender de la existencia física, en la enzima, de determinados sitios donde se absorbe el sustrato para ser activado. Al principio de la curva se puede aumentar la concentración del sustrato y la enzima es capaz de activarlo con toda eficiencia; pero como una vez activado el sustrato se separa en forma de los productos, y la velocidad con la que éstos se separan no es igual a la velocidad con la que captado el sustrato, y en vista de la cantidad creciente del sustrato, la línea obtenida no es una recta, sino la curva señalada. Cuando la cantidad de sustrato ha sobrepasado la capacidad física de la enzima para recibirlo y poder transformarlo, la curva alcanza una meseta, lo que significa que la reacción prosigue a la misma velocidad, independientemente de la cantidad de sustrato adicionada. De acuerdo con los términos ligados a la velocidad de reacción, expresados en la página 36, se encuentra que, al principio del experimento, la reacción depende exclusivamente de la concentración del sustrato y se trata de una reacción de primer orden; al final de ella, cuando hay un exceso de sustrato, la reacción es independiente de la cantidad de sustrato y, por lo tanto, es de orden cero.

Otra característica en relación con la finalidad de la enzima por el sustrato es la comprendida en el llamado número de recambio, el cual representa los moles de sustrato atacados por un mol de enzima en una unidad de tiempo determinada, generalmente un minuto. Este número de recambio, en algunas ocasiones, es muy elevado, como sucede con la catalasa que a 0º C., tiene un número de recambio de 2.5 millones; es decir, un mol de enzima es capaz, en un minuto, de desdoblar dos y medio millones de moles de H2O2 ; el citrocomo c, a 38º C, tiene un número de recambio de 1.4 X 103 ; la carboxialasa a 30º C., da un número de recambio de 1 X 103 , etc.

Mecanismo Ping Pong

En la transaminación, la reacción avanza a través de los fenómenos alternos de adición de sustrato y liberación de producto .

 Iones sustrato

Estos facilitan la fijación del sustrato y la catálisis por creación de varias de complejo de puente constituidos por un enzima, metal y sustrato en la que os iones metálicos pueden actuar como catalizadores ácidos generales o facilitar la aproximación de los reactantes.

19. Accion de inhibidores.

Si a un sistema enzimático se añaden sustancias que impidan la realización de la actividad propia de la enzima, se dice que el sistema ha sido inhibido, y la sustancia usada con estos fines se denomina inhibidor.

Muchos inhibidores son agentes que desnaturalizan a las enzimas, ya que éstas son moléculas proteínicas, susceptibles a una diversidad de agentes, especialmente químicos, como aniones complejos o metales pesados, Zn ++, Pb ++, Ag ++, etc. A menudo estos agentes que impiden la actividad enzimática actúan sobre casi todas las enzimas, lo que demuestra que su acción no es específica, sino que afectan a tosa molécula proteínica . Tal es el caso de los inhibidores de sufhidrilos, -SH, los cuales forman parte de una gran variedad de enzimas. Otras sustancias bloquean específicamente determinadas reacciones enzimáticas y su especificidad es tal, que sólo cierto sustrato y cierta enzima son los susceptibles.

De acuerdo con esto, es posible clasificar los fenómenos de inhibición enzimática en diversos grupos : inhibición por competencia e inhibición por no competencia y ésta, a su vez, en la debida a agentes desnaturalizantes y a agentes inespecíficos.

20. Inhibicion por competencia

En este caso el inhibidor no permite la formación del complejo enzima – sustrato normal, ya que se forma un complejo enzima – inhibidor ; una vez que el inhibidor ocupa el lugar activo de la enzima, el complejo enzima – inhibidor, no se separa, en vista de que la enzima no tiene acción sobre el inhibidor y, por lo tanto, queda bloqueada la parte activa de la enzima. El sustrato no puede entrar al lugar activo, que está ocupado por el inhibidor y, de esta manera, se impide la acción enzimática.

El ejemplo clásico de inhibición competitiva es el de la enzima deshidrogenasa succínica que, en presencia de ácido succínico en ácido fumárico, reduciendo, simultáneamente, al acceptor de H. Diversas sustancias parecidas al ácido succínico, como el ácido malónico, el oxálico y el glutárico, se pueden combinar con la enzima e impiden su acción sobre el ácido succínico.

Al añadir el inhibidor, la actividad enzimática disminuye sin embargo, si se añaden cantidades mayores del sustrato natural de la enzima (en el ejemplo anterior, de ácido succínico) nuevamente empieza a aparecer actividad enzimática, y cuando las cantidades de ácido succínico añadido sobrepasan considerablemente a las presentes del inhibidor, la actividad enzimática se restablece por completo. Esta situación representa, aparentemente, un fenómeno de competencia entre el sustrato natural y el inhibidor para ocupar el sitio activo de la enzima; la cantidad presente de una sustancia o de otra , en un momento dado, en el sitio de la reacción , determina si se dirige en un sentido o de otro; si hay más inhibidor, la enzima queda bloqueada por éste, y no se lleva a cabo la reacción enzimática ; si aún en presencia de importantes cantidades de inhibidor existen mayores cantidades del sustrato natural, éste domina al inhibidor y llega a desplazarlo introduciéndose en los sitios activos de la enzima para permitir que se reanude la actividad catalítica.

21. Inhibicion por no competencia

Cuando las sustancias inhibidoras actúan independientemente de la calidad del sustrato natural presente, se trata de inhibición por no competencia. En este caso, el inhibidor bloquea loas sitios activos de la enzima de modo irreversible ; en ocasiones se trata de la desnaturalización de la enzima, como cuando se añaden aniones o cationes que precipitan las proteínas. En otros casos la combinación irreversible se hace con sustancias que actúan de manera específica sobre ciertos grupos activos de la enzima, o sobre la conformación o estructura completa de ella ; sin embargo, en estas circunstancias, se ven afectadas por igual todos o cuando menos varios tipos de enzimas.

Existen algunos inhibidores no competitivos que muestran cierta especificidad, como los agentes bloqueadores del radical sulfhidrilo, -SH, presente en las cadenas laterales del aminoácido cisteína, común a todas las moléculas proteínicas y, por lo tanto, a las enzimas. Entre los inhibidores de sulfhidrilos más conocidos se encuentran el ferricianuro, el yodacetato, el famoso gas usado con fines bélicos, la lewisita, y otras sustancias de tipo arsenical que deben sus efectos letales a su combinación con los grupos sulfhidrilo de proteínas y enzimas de gran importancia fisiológica.

Hay enzimas que contienen iones metálicos indispensables para su actividad y que son susceptibles a la acción inespecífica de agentes que afectan dichos iones; tal es el caso de las enzimas con hierro que son intoxicadas por medio del cianuro o el H2S. De la misma manera, la adición de oxalato a un sistema puede precipitar el calcio o el magnesio, e impedir la actividad de enzimas que los requieren.

22. Antagonismo metaboloco (antimetabolitos)

Las enzimas pueden ser inhibidas por diversos compuestos, especialmente los que presentan una estructura parecida al sustrato natural, como expresó en el caso del ácido malónico y el ácido succínico con respecto a la deshidrogenasa succínica.

Esta inhibición se denomina metabolitos las sustancias presentes o producidas en el curso del metabolismo celular, y antimetabolitos las sustancias parecidas a aquéllos, y que impiden su aprovechamiento y utilización ; en general, se trata de sustancias que compiten, a nivel enzimático, en vista de su parecido estructural, con los metabolitos naturales.

Numerosos hongos, actinomicetos, bacterias, etc., producen sustancias que muestran actividad contra otros microorganismos. Estas sustancias se han denominado antibióticos y, en principio, se deben considerar como antimetabolitos que impiden, por razones de competencia , el crecimiento de determinadas formas microbianas. En medicina ha resultado del mayor interés el aislamiento y la actividad de los antibióticos, ya que en ciertas condiciones se usan para reprimir el desarrollo de gérmenes patógenos para los seres humanos.

El estudio de los antimetabolitos probablemente se inició al observar que numerosas bacterias podían crecer en un medio que tuviera sulfanilamida, que normalmente es un inhibidor de su crecimiento, siempre que se añadieran grandes cantidades de ácido p-aminobenzoico, una vitamina necesaria para la nutrición celular. En vista del parecido estructural entre las dos moléculas, la sulfanilamida y el ácido p-aminobenzoico, se aceptó que los fenómenos de inhibición tenían una base estructural.

Entre los antibióticos, existen algunos de gran utilidad terapéutica, como la penicilina, aislada de diversos hongos Penicillium ; la estreptomicina, proveniente de cultivos de Streptomyces griseus, y las tetracilinas, sustancias que tienen amplio campo de acción de diversas infecciones producidas por bacterias grampositivas o gramnegativas. Químicamente, son sustancias complejas formadas por distintos grupos :por ejemplo, la estreptomicina contiene glucosamina, estreptosa y estreptidina. Algunos antibióticos son péptidos, de tipo básico, aislados de bacterias, tales como la gramicidina y las tirocidinas. Un ejemplo peculiar de antibiótico producido por el hongo Pemicillium notatum es la notatina, idéntica a la enzima glucosa oxidasa que ataca a la glucosa permitiendo su conversión a gluconolactona y ácido glucónico ; es posible que de esta manera ejerza su acción de antibiótico.

Muchos antimetabolitos suelen intervenir de modo específico a nivel de las coenzimas o de los grupos prostéticos, cuando éstos son del tipo de las vitaminas. Se trata, por lo tanto, en estos casos, de antivitaminas , muy comunes en las del grupo B. Así, la tiamina modificada en su estructura química para formar piritiamina o oxitiamina, no participa en los procesos de descarboxilación.

El ácido piridín – 3 sulfónico impide la acción de la vitamina natural parecida a él, o ácido nicotínico y perturba numerosas reacciones de deshidrogenación. La piridoxina es antiorganizada por la desoxipiridoxina y la biotina, de la misma manera, por la destiobiotina. Se han preparado numerosas sustancias parecidas a las bases púricas y pirimidínicas con la finalidad de bloquear los sistemas de formación de proteína, que dependen de la presencia de ácidos nucleicos que contienen dichas bases, en el interior de la células; estos trabajos se han planeado para deprimir la velocidad de desarrollo de células cancerosas. Entre las sustancias obtenidas en fechas recientes se puede señalar el grupo del 5 – fluorouracilo, que produce inhibición tumoral por el siguiente mecanismo, que puede ser común a un gran número de sustancias con estas propiedades : en el tumor falta la enzima que destruye el antimetabolito, en este caso el 5 – fluorouracilo, el cual se vuelve muy agresivo hacia el tumor ya que no es degradado por él; en cambio, dicha sustancia es menos tóxica para el tejido normal que sí está en posibilidad de destruirlo.

23. Inhibicion alosterica

De gran importancia en el fenómeno de la actividad enzimática es el hecho de que, en las proteínas, pueden existir dos (o cuando menos dos) sitios diferentes desde el punto de vista estereo- específico y que, además, estén en lugares distintos. Un de estos sitios es el centro activo, donde el sustrato es atacado para dar origen a los productos de la reacción y por lo tanto donde reside el aspecto funcional de la proteína. El otro sitio denomina sitio alostérico y en él puede acomodarse de manera complementaria - pero reversible - alguna sustancia llamada efector alostérico ; al efectuarse esta unión se produce una alteración discreta de la estructura de la proteína, la transición alostérica, que modifica la actividad biológica de la proteína, porque altera la distancia, las propiedades del sitio activo.

Es muy importante que el efector alostérico normal no tiene relación química o metabólica alguna con el sustrato de dicha enzima y que su acción tan específica se debe a que altera de tal modo la conformación de la proteína que modifica su centro activo.

El efecto alostérico se ha estudiado de manera especial en bacterias, pero ocurre también en animales superiores. En un principio se reconoció como un efecto inhibidor que, por su características, fue denominado "por retro- alimentación" o "por producto final" . En rigor, en las bacterias, es la regla que el metabolito formado al final de un camino metabólico, resulte un poderoso inhibidor de su propia síntesis. Parte de la explicación de este efecto (pág. 535) se debe a que dicho metabolito inhibe específicamente a una sola enzima localizada en el camino metabólico que forma a dicha sustancia, y de manera curiosa, la enzima sensible al metabolito final es la primera de este camino metabólico.

En un ejemplo de camino A B C D E, siendo E el metabolismo final, éste inhibiría a la primera enzima la que forma B a partir de A. En este capítulo en que se estudia la regulación metabólica se analizan con detalle algunos de estos ejemplos y las reacciones químicas individuales afectadas. La inhibición alostérica demuestra la alta especialización de las enzimas que reconocen tanto al sustrato como al inhibidor, siendo muy específicas para ambos. Como químicamente el sustrato y el efector alostérico son muy distintos, se acepta que la unión con la enzima debe efectuarse en sitios diferentes, lo que ha demostrado con mutantes bacterianas no sensibles al efector alostérico . Además, no hay interacción directa entre el sustrato y el inhibidor puesto que los sitios receptores están muy separados.

Las proteínas alostéricas pueden corresponder a polímeros, es decir, a moléculas compuestas de sub- unidades idénticas, con ejes de simetría definidos. El hecho de que se agreguen las subunidades, por una parte, y el que al estar en forma polimérica adopten diversas situaciones conformaciones, hace susceptibles a la enzima a los inhibidores, o por el contrario, a recibir (fig. 3-10) al sustrato y llevar a efecto su acción característica. Más aún, para el caso de la transcarbamilasa aspártica se ha demostrado que una subunidad se combina con el sustrato y otra, distinta, con el inhibidor. Estos fenómenos adquieren una importancia de tipo general, al demostrarv que es factible modificar la acción de las enzimas por cambios en la estructura cuaternaria de las proteínas, basados en la asociación y disociación de subunidades. Algunos ejemplos particulares son los siguientes : la deshidrogenasa glutámica, con peso molecular de cerca de 1 millón puede partirse en subunidades de 250 000 por diversos agentes : DPN, ADP, estrógenos tiroxina y ciertos aminoácidos . Otro ejemplo es la carboxilasa de la acetil coenzima. A, que es activada por la adición de citrato, el cual cambia el coeficiente de sedimentación de la enzima de 18 S a 43 S, o sea la molécula pasa a forma de polímero activo a partir de monómeros inactivos. Un caso ya clásico es el de la fosforilasa inactiva que se convierte en activa cuando se fosforila; la estructura inactiva está formada por 2 unidades y la activa por 4.

24. Enzimas: regulacion de actividades

La regukacion del metabolismo logra la homeostacia

La regulación de la actividad enzimática contribuye en gran parte a preservar la homeostasia que, mantiene un entorno intracelular e intraorgánico relativamente constante en presencia de fluctuaciones amplias en al medio ambiente externo, como cambios de temperatura, presencia o ausencia de agua o tipos específicos de alimentos.

Como conservar la homeostasia

Las concentraciones locales de sustrato , compartición de enzimas y secreción como proenzimas o cimogenos ( como por ejemplo la quimiotripsina ) sin actividad catalítica contribuyen a la regulación de los procesos metabólicos . Además , las alteraciones rápidas y mínimas en la actividad catalítica de enzimas reguladas clave tienen funciones importantes en la canalización selectiva de metabolitos hacia uno u otro proceso metabólico .

Las enzimas reguladoras

Tienden a ser aquellas que catalizan una reacción temprana única ( con frecuencia la primera ) de una secuencia determinada de reacciones metabólicas .

La actividad catalítica de las enzimas reguladas puede modularse por ejemplo ,cambios repetidos entre estados bajo y alto de actividad catalítica ; cuando no hay síntesis proteínica nueva ni degradación proteínica .

La modulación se logra cuando matabolitos específicos se unen en forma covalente y no covalente, a la enzima regulada en general a sitios ( alostéricos ) bastantes separados del sitio catalítico .

Tres mecanismos generales regulan la actividad enzimatica

Por ejemplo el flujo neto de carbono en una reacción catalizada en una reacción enzimática podría ser influido

  1. Cambiando la cantidad absoluta de enzima presente .
  2. Alterando el tamaño del conjunto de sustancias reaccionantes distintas de la enzima.
  3. Alterando la eficacia catalítica de la enzima (estas tres opciones son utilizadas e casi todas las formas de vida).

La modulación de actividad enzimática por cambios en la conformación del sitio catalítico puede incluir la alteración de Km para un sustrato de Vmax para la reacción global o para efectos sobre los dos, Km y Vmax.

A menudo las curvas de saturación de sustrato para la inhibición alostérica son sigmoideas, por ende la ecuación de Michaelis Menten no se aplica.

25. Bibliografia

  1. Rodwel. et alli Bioquimica de Harper, 13ª ed., s.d.

  2. Laguna, Jose Bioquimica, 2ª ed., Facultad de Medicina, UNAM, Mexico D.F., Fournier S.A., 1969.

Tema : Enzimas

Curso : Química

Año:1999

Resumen: trata de las enzimas, que tienen el poder de catalizar, facilitar, y agilizar determinados procesos sintéticos y analíticos de la vida , contiene la evolucion de la enzimologia caracteriasticas como actuan en el organismo , etc

Trabajo enviado y realizado por:
Marco Ludeña
Universidad Peruana Cayetano Heredia
2 año en la facultad de estomatologia
marcolud[arroba]LatinMail.com


Partes: 1, 2


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