Fueron aisladas las cepas de Lactobacillus bulgaricus y Bacillus subtilis siguiendo los métodos tradicionales a partir del tomate alterado ya que consideramos que las cepas presentes en este sustrato son mutantes naturales adaptadas a las condiciones del pH

Estos cultivos una vez clasificados, fueron conservados en cuñas de agar para su inoculación posterior en el medio de cultivo Caldo Suero de Tomate. Para la elaboración de este medio de cultivo, sus componentes se disolvieron en un volumen mínimo de agua destilada previamente calentada a 55 ⁰C y en recipientes adecuados; se filtró a través del papel y se le añadió el suero de tomate ya filtrado hasta obtener transparencia; se completó el volumen con agua, se agitó y ajustó el pH a 5,0 mediante ácido láctico IN. Se distribuyeron en los recipientes de cultivos, se taponaron con algodón y se retaparon con papel o láminas metálicas para esterilizarlos en autoclaves a 121 ⁰C durante 30 minutos.

Este medio no se usó hasta pasadas 72 horas en que se comprobó su esterilidad. Una vez preparado el medio de cultivo y teniendo en cuenta que la producción de biopreparados debe llevarse a cabo de forma escalonada, las cuñas antes preparadas con abundante crecimiento, de forma separada para cada microorganismo, fueron suspendidas en recipientes estériles que contenían 50 ml, del medio de cultivo Caldo Suero de tomate; éste se dejó durante 3 días a temperatura de 30⁰C y al cabo de este tiempo se le añadió medio de cultivo hasta 250ml, bajo las mismas condiciones se le volvió a echar otra vez el medio de cultivo hasta alcanzar los 500 ml finalmente pasados los tres días a la misma temperatura, se completó hasta los dos litros y se dejó igualmente otros tres días más; posteriormente se le hizo el conteo de células en la cámara de Newbauer.

En nuestro caso se uso un volumen de dos litros por cada lote de producción del biopreparado, por lo que definimos que nuestra producción fue a escala de laboratorio y se preparó un total de cinco lotes de los que se tomaron de cada uno cuatro muestras de 100 ml, para el estudio de su conservación y realizarle las pruebas de estabilidad, se almacenaron a temperatura de 30 ⁰C durante su procesamiento y diariamente se les hizo el conteo celular, además de ver la presencia de algún precipitado, cambio de color, etc.

Después de esto, se ajustó la carga final de los microorganismos a 1x 10⁶ cel /ml en ambos casos con solución salina fisiológica, teniendo en cuenta el volumen deseado y se mezclaron los cultivos de Lactobacillus bulgaricus y Bacillus subtilis en el momento de la aplicación, pasándose finalmente a frascos de 110 ml, estériles a partir de los cuales se hace la inoculación práctica.

El Suero de Tomate se preparó con puré de tomate en jugo a 50 Bux, se calentó a ebullición y se filtró varias veces por papel hasta obtenerlo transparente.

Para el trabajo de aplicación del Prebiótico en el campo, se utilizaron 12 unidades de la Empresa Pecuaria Genética de Matanzas, en las cuales se seleccionaron 78 vacas en un diseño simple completamente aleatorizado, al cual se le realizó la prueba estadística por medio del programa STATSOFT, INC. (1995), los animales se encontraban en producción, eran de distintas razas, edades e igual régimen de alimentación y tenencia. Todos presentaban distintos grados de Mastitis.

Fueron divididas en dos grupos:

El primero incluía 41 vacas y 59 cuartos afectados con Mastitis Clínica en estado leve y avanzado, que fueron tratados con el preparado Probiótico. El tratamiento se aplicó por vía intramamaria y a razón de 55 ml, como dosis aplicada con cánula, jeringuilla de 20 ml, pomos de 110 ml, manguera de suero para la extracción del producto, alcohol para la desinfección de la cánula y amonio carbamida para la desinfección final de los cuartos dañados. El producto se mantuvo en refrigeración para su conservación y sólo se sacaba cuando se iba a aplicar. Los animales tratados con el producto biológico fueron ordeñados manualmente y a fondo antes de cada aplicación;

El segundo grupo incluía 37 vacas y 50 cuartos afectados con igual patología, los cuales fueron tratados con antibióticos previo antibiograma realizado (Infusión Mamaria de Cloranfenicol y Neomicina). La administración fue por vía intramamaria con una dosis de un tubo por cada cuarto afectado.

Antes de cada tratamiento em ambos grupos, se hacía una inspección clínica de la ubre, se lavaban los pezones, se realizaba el despunte y se realizaban pruebas California Mastitis Test a cada cuarto afectado. Además se tomaban muestras en tubos de ensayo estériles que se enviaban al Laboratorio de Diagnóstico de Zequeiras en Limonar para realizarles pruebas de Bacteriología, pH y Sedimentación.

Para las pruebas de bacteriología se sembraron las muestras en agar-sangre y agar-Saboureaud, se les hizo antibiogramas, comprobando la sensibilidad de los agentes etiológicos y se realizaron conteos de colonias.

Las determinaciones de pH y Sedimentación se realizaron por las técnicas conocidas y normadas. Ambos tratamientos se aplicaron en horas tempranas de la mañana, durante tres días consecutivos y una vez concluido el tratamiento se ordeñaron manualmente los animales dos veces al día hasta su total recuperación siguiendo su curso para medir el tiempo del mismo.

En esta tabla 1 puede observarse la composición del medio de cultivo obtenido, el cual permitió la viabilidad de los microorganismos Probióticos en estudio, así como su precio en moneda nacional, dosis y costo del tratamiento, se destaca el suero de tomate dentro del volumen máximo del Probiótico y con un costo de producción muy bajo lo que abarata el producto final de la dosis en $0.12.

En la tabla 2 se aprecia un resumen de los aspectos más importantes sobre la estabilidad del producto y la viabilidad de las cepas utilizadas lo más significativo es que el producto puede elaborarse a temperatura ambiente, lo que representa un ahorro de energía. No requiere de temperaturas bajas de almacenamiento durante 8-10 días, en ninguno de los lotes ensayados apareció contaminación microbiana después de 1 mes de almacenamiento a 30⁰C, las cepas fueron viables después de un mes, o sea, que se pueden aislar Lactobacillus y Bacillus con sus características originales.

El estado clínico de los animales antes del tratamiento, donde se comparan el grupo control y el tratado con Probiótico, comprobándose que ambos grupos fueron positivos a la prueba subclínica California Mastitis Test, a la prueba de Sedimentación y a los análisis Bacteriológicos tabla 3.

En la tabla 4 se observa el estado clínico de los animales de ambos grupos después de los tratamientos, incluyendo el total de recuperados y el % que representan en lo que puede constatarse que, si bien el tiempo de recuperación fue menor en el grupo control, el número de animales recuperados en ambos grupos es similar sin diferencias significativas (Métodos de la Proporciones y Prueba Duncan p<0.05)

Los microorganismos aislados y la respuesta al antibiograma, donde se aprecian los diferentes niveles de sensibilidad y resistencia a los antibióticos que fueron evaluados, siendo a la ampicilina el antibiótico que mayor grado de resistencia presentaron los microorganismos expuestos (Streptococcus agalactiae- Staphylococcus aureus).

La incidencia de los patógenos aislados se muestra en la Tabla 6, observándose que el Streptococcus agalactiae (55.17%) fue el de mayor presentación seguido del Corynebacterium pyogenes (27.58%) y el Staphylococcus aureus (17.24%) coincidiendo con lo reportado por la literatura nacional e internacional.

El reciente desarrollo de la biotecnología ha permitido conocer las características bioquímicas y genéticas de algunas bacteriocinas, así como su mecanismo de acción y por ende un mejor conocimiento de la forma en que las bacterias ácido lácticas inhiben a otros microorganismos pudiendo ser una de las causas de sus efectos benéficos para la salud. Además, cada día se descubren más bacteriocinas y se analizan sus mecanismos de acción a nivel molecular. No cabe duda que en los próximos años se tendrá un mejor entendimiento de estos péptidos que permitan aprovechar al máximo su potencial en beneficio del hombre (González, Gómez y Jiménez, 2003) coincidiendo con los autores inferimos que nuestros resultados positivos están determinados por el efecto de las bacteriocinas como plantean los autores.

Según Nader (2006) los lactobacilos son los microorganismos predominantes en el tracto gastrointestinal y urogenital del hombre y animales homeotérmicos; también se emplean en la elaboración de diferentes alimentos, lo que los categoriza como GRAS (generally regarded as safe). Se ha demostrado en animales de experimentación (ratones BALB/c hembra endocriados) que la administración intrauretral de lactobacilos no produce efectos adversos ni modificaciones estructurales o ultraestructurales, previniendo efectivamente las infecciones urinarias. Aunque el epitelio de la glándula mamaria es diferente al epitelio uretral, nosotros obtuvimos respuesta positiva al recuperar el epitelio glandular afectado por la Mastitis al utilizar la mezcla de Lactobacillus bulgaricus y Bacillus subtilis en el tratamiento .

Otro resultado interesante en el tratamiento de patologías lo reporta el trabajo realizado por Rojas (2006) al afirmar que los Probióticos son preparados que han demostrado ser efectivos en reducir la duración de la diarrea aguda en niños y adultos. El epitelio intestinal y su contenido difieren del mamario no obstante son coincidentes los resultados al solucionar patologías de ambos sistemas.

Un trabajo mas profundo en esta temática fue la realizada por Gomes (2006) al plantear que los efectos de los Probióticos son varios incluyendo la modificación de la flora evitando la colonización patógena, la prevención del desequilibrio de la flora intestinal, la reducción de la incidencia y duración de diarreas, el mantenimiento de la integridad de las mucosas, la modulación de la inmunidad al evitar la translocación bacteriana, la producción de vitaminas como la B2, B6 y biotina, la asimilación de oligoelementos y la actividad antitumoral.

• Prevención y tratamiento de enfermedades infecciosas
• Disminución de los niveles de colesterol.
• Disminución de diarreas, ya sea por virus, bacterias o parásitos.
• Tratamiento de la intolerancia a la Lactosa, actúa en la digestión de la lactosa.
• Estimulación del sistema inmune.
• Exclusión o reducción de la adherencia patógena
• Persistencia y multiplicidad.
• Producción de ácidos, peroxido de Hidrógeno y bacteriocinas antagonistas al crecimiento patógeno.
• Formación de una flora intestinal balanceada.
• Prevención de ciertas manifestaciones alérgicas
• Prevención del cáncer de Colon
• Tratamiento contra tumores
• Poseen efectos antimicrobianos.
• Poseen la habilidad de adherirse a las células

Los resultados de la investigación de la autora justifican los nuestros, ya que en la información que se muestra nos permite realizar el aporte de ser el primer resultado obtenido de la utilización de Probióticos en el tratamiento de la Mastitis bovina en Cuba utilizando como medio de cultivo el Suero de Tomate.