Organismos genéticamente modificados (OGMS): detección y cuantificación (página 2)

Detección de OGMs.

El aprovechamiento en campo de los beneficios de la
biotecnología vegetal implicó
inmediatamente la necesidad de implementar procedimientos de
campo y laboratorio
para poder
discriminar mercaderías conteniendo un nivel de OGM
superior a un umbral determinado, de aquellas que estaban por
debajo. Con el paso del tiempo se ha
avanzado sensiblemente en una serie de aspectos que han hecho
evolucionar en este sentido (http://www.acpa.org):

• Se han desarrollado protocolos
  de purificación de ADN y de PCR
  para aplicar a gran escala.
• Los métodos
  de PCR han evolucionado hacia técnicas
  cuantitativas (PCR en Tiempo Real).
• Se han desarrollado técnicas
  inmunológicas y juegos
  diagnósticos específicos de fácil
  aplicación.
• Existe más información molecular sobre los eventos y los
  cebadores específicos correspondientes.
• Se han desarrollado y aplicado programas de
  trazabilidad e identidad
  preservada para la característica
  ¨genéticamente modificado¨.
• Se discuten protocolos y materiales
  de referencia a nivel de normas de CODEX
  Alimentario, ISO
  (Internacional Standards Organization) e ISTA (Internacional
  Seed Testing Asociation), entre otras.

La detección de OGMs o derivados de OGMs puede
ser realizada detectando una molécula (ADN, ARN o
proteína) que esté asociada específicamente
o derivada de una modificación genética
de interés
(Van den Eede y cols., 2000).

Sin embargo, la mayoría de los métodos no
están dirigidos a detectar proteínas
o ARN. Esto tiene varias razones:

1. El ADN puede ser purificado y multiplicado en
   millones de copias en pocas horas, mediante la PCR.
2. La multiplicación del ARN y proteínas
   es un proceso
   más complicado y lento.
3. El ADN es una molécula muy estable, mientras
   que el ARN es inestable.
4. La estabilidad de una proteína varía y
   depende del tipo de proteína.
5. Normalmente existe una correlación linear
   entre la cantidad de OGM y ADN, si el ADN genéticamente
   modificado es nuclear, pero no, si este es
   extranuclear.
6. Normalmente no existe esta correlación entre
   la cantidad de OGM y proteína/ARN.
7. La modificación genética se realiza a
   nivel de ADN y hasta el presente, el ADN modificado
   genéticamente es nuclear en todos los OGM
   comercializados.

Los protocolos analíticos son muy sensibles, ya
que detectan un gen en decenas de miles de genes del genoma, o
una nueva proteína entre varios miles de proteínas.
Actualmente, los protocolos pueden detectar un evento o grupo de
eventos en un cultivo en particular, pero ninguno puede detectar
en un único ensayo todos
los eventos, por eso no se puede asegurar que una muestra
está libre de OGM, sólo se puede asegurar que
está libre de los eventos para los cuales se hayan
realizado los análisis pertinentes (Tozzini,
2004).

La base de cada tipo de tecnología de
detección de OGM es buscar la diferencia entre la variedad
no modificada y la planta transgénica. Existen tres
metodologías para detectar modificaciones genéticas
en los cultivos tales como soya, algodón, maíz, etc.
Una es mediante la diferenciación fenotípica. La
otra es a nivel de proteínas por técnicas
inmunológicas (tiras reactivas o ELISA), las cuales
detectan la presencia de proteínas específicas, por
la unión específica entre el antígeno expresado y el anticuerpo blanco.
El otro método
está basado en la detección a nivel de ADN,
mediante PCR. Estos dos últimos métodos muestran la
ausencia o presencia de un OGM en la muestra, pero también
pueden dar alguna indicación de cantidad (porcentaje) en
una muestra tratada (Fagan y cols., 2001; Holst-Jensen y cols.,
2003).

Detección fenotípica.

Por lo general, las plantas
genéticamente modificadas que se encuentran actualmente en
campo presentan la característica de resistencia a
herbicida y/o a insectos. La evaluación
de la resistencia a insectos de una planta se realiza mediante
ensayos
biológicos complejos y de larga duración, por eso,
esta no es una alternativa práctica para el
análisis de granos. Sin embargo, la resistencia a
herbicidas sí puede ser evaluada mediante ensayos
sencillos en laboratorio y en campo (Tozzini, 2004), pudiendo
observarse los resultados de la evaluación de la
diferencia fenotípica entre una planta
genéticamente modificada resistente a herbicida y la
planta natural.

Detección inmunológica.

Los OGMs están caracterizados por un genoma
alterado, el cual puede llevar a la expresión de una nueva
proteína; por lo tanto, los alimentos
modificados genéticamente pueden ser identificados
detectando la presencia de la nueva proteína expresada,
codificada por el material genético (Lipp y cols.,
2001).

Los ensayos inmunológicos para la
detección de OGM, básicamente se desarrollan con
dos formatos: las tiras reactivas o strips de flujo
lateral y el ELISA (ensayo de inmunodetección ligado a
enzima).

Flujo
lateral o lateral flow

En este formato se reúnen todos los reactivos en
un soporte sólido y mediante el flujo por capilaridad de
la muestra en solución se logra determinar la presencia o
ausencia de una determinada proteína (análisis
cualitativo). Este formato se ha aplicado exitosamente para la
detección de un sinnúmero de moléculas de
importancia en el diagnóstico veterinario y humano. El
resultado de estas tiras es cualitativo (positivo o negativo) y
la sensibilidad (o límite de detección) oscila
entre 0.5% y 2% para determinados eventos y de 0.1% y 0.3% para
otros.

En la banda de flujo lateral el anticuerpo de captura
está unido directamente a uno de los extremos de la banda,
mientras que el anticuerpo detector se encuentra sobre el extremo
opuesto (seco, pero no unido de manera directa a la superficie de
la banda). En este último extremo se adiciona la muestra
de interés, la cual fluye junto con el anticuerpo detector
en la dirección contraria. Si la proteína
transgénica, a la cual reconoce de manera
específica el anticuerpo de captura, se encuentra
presente, los tres elementos reaccionan entre sí (el
anticuerpo de captura con la proteína de interés y
con el anticuerpo detector) formándose una banda colorida
donde el anticuerpo detector se acumula. Si no es así,
sólo reacciona el anticuerpo de captura con el anticuerpo
detector, en una región más alejada, indicando que
la prueba fue realizada correctamente (Stave, 1999).

A pesar de ser un ensayo
cualitativo, a partir de los resultados se pueden hacer
cálculos estadísticos para determinar la probabilidad de
que la muestra tenga un contenido de granos genéticamente
modificados (GM), inferior a un determinado valor para un
nivel de confianza dado. Para esto, es imprescindible conocer la
sensibilidad del strip expresada en granos GM/granos no GM
y trabajar con submuestras que no excedan este número para
evitar resultados falsos negativos
(http://www.acpa.org).

Obviamente la gran ventaja de esta metodología de análisis radica en su
simplicidad y rapidez, (Tabla 1), por eso se le utiliza en campo
como control inicial
en la conformación de conjuntos, que
luego serán analizados por algún método
cuantitativo, o como primer control a la entrada de un proceso o
industria
(http://www.acpa.org).

Table 1: Características de las tiras de flujo
lateral (Stave, 1999; Lin y cols., 2001; Spiegelhalter y
cols., 2001; Ahmed, 2002).

Ensayo de inmunodetección ligado a enzima
(ELISA).

El método de ELISA se fundamenta en el uso de
anticuerpos específicos para capturar a la proteína
de interés. Este procedimiento es
capaz de discriminar proteínas específicas
presentes en el producto bajo
análisis, de entre cientos de proteínas distintas
presentes en la misma muestra. El método de ELISA es
extremadamente sensible, versátil y cuantitativo. En
general, este procedimiento, incluye el uso de anticuerpos que se
unen de manera específica a las proteínas de
interés (llamados anticuerpos primarios), por ejemplo a
aquellas que son sintetizadas como resultado de la introducción del nuevo ADN (llamadas
proteínas transgénicas). Una reacción
colorimétrica o fluorimétrica desencadenada por un
segundo anticuerpo (o anticuerpo secundario) permite visualizar y
medir la cantidad de la proteína de interés. El
resultado se compara con la señal emitida por
concentraciones conocidas de la misma proteína, por lo que
el ensayo no
solo es cualitativo, si no también cuantitativo. Una
restricción para el uso de pruebas de
ELISA en la detección de proteínas
transgénicas es la desnaturalización de estas
durante el procesamiento del alimento. Los resultados de esta
prueba se estima que son confiables en un 95% de los casos
sometidos (Ausubel y cols.,
1995). Todos los ELISAs detectan un rasgo genéticamente
modificado, pero no todos los rasgos pueden ser detectados o
diferenciados por un ELISA (Tabla 2) (Griffiths y cols.,
2002).

Tabla 2: Características de los métodos
ELISA en la detección de OGM (Stave, 1999; Lin y
cols., 2001; Spiegelhalter y cols., 2001; Ahmed,
2002).

Otro formato para
inmunoensayos

Otro formato para inmunoensayos es el uso de
partículas magnéticas como superficie sólida
de soporte. Las partículas magnéticas están
cubiertas con un anticuerpo de captura y la reacción es
llevada a cabo en un tubo de ensayo. Las partículas con
las proteínas unidas se separan de las proteínas no
unidas en solución, utilizando un magneto. La ventaja de
este método está dada por una cinética
superior, pues las partículas quedan libres para moverse
en la solución y se incrementa la precisión,
permitiendo la uniformidad de las partículas (Ahmed,
2002).

Métodos basados en la detección del
ADN introducido

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR):
La PCR permite la amplificación de un fragmento de ADN de
interés con una alta sensibilidad y especificidad.
Fragmentos de ADN con una longitud de 100pb hasta 1000pb son
amplificados con la ayuda de una enzima polimerasa y dos
cebadores. A través de una serie de ciclos térmicos
diferenciales la enzima ayuda a la replicación y
amplificación exponencial de la secuencia flanqueada por
los cebadores. Finalmente el fragmento amplificado está
sujeto a un gel estándar de electroforesis, cuya presencia
puede ser detectada basada en la determinación de su talla
(Atlas y Bej, 1994).

El blanco más prometedor para el análisis
del material transgénico es el ADN insertado. Esta
molécula es mucho más estable que las
proteínas y está presente en las mismas
concentraciones en todo el OGM. Aunque es imposible detectar a
moléculas individuales de ADN, estas pueden ser
amplificadas usando la técnica de la PCR. Este
método permite la amplificación de secuencias
específicas del ADN en pocas horas, facilitando el
análisis cualitativo y cuantitativo de dichas secuencias
por medio de técnicas de laboratorio comunes
(http://www.bio.davidson.edu).

Cada estrategia basada
en la detección por PCR depende de un conocimiento
detallado de la secuencia del ADN transgénico y de la
estructura
molecular del OGM, con el objetivo de
seleccionar los cebadores apropiados (Roux, 1995). Varios
ingredientes de alimentos, modificados genéticamente, han
sido analizados utilizando PCR: soya (Meyer y cols., 1996); trigo
(Allman y cols., 1993); canola y papa (Jongedijk y cols., 1992);
arroz y papaya (Yang y cols., 1996); alfalfa (Blake y cols.,
1991); maíz, azúcar
de remolacha y tomate
(Waiblinger y cols., 1997).

El ADN que ha sido introducido en el cultivo
transgénico contiene tres elementos: El promotor, el gen
que confiere el nuevo rasgo de interés agronómico y
la señal de paro de este
gen. La PCR puede usarse para detectar a cualquiera de estos
elementos, siempre y cuando el cebador utilizado (cuya secuencia
se diseña a partir de una secuencia conocida de los
elementos indicados) sea complementario a las secuencias
buscadas. El primer ciclo de la PCR "fabrica" así la
secuencia deseada. Los ciclos subsecuentes multiplican esta
secuencia. Los fragmentos de ADN amplificados son separados en un
gel por tamaño, el cual se tiñe con un compuesto
que fluoresce cuando se expone a la luz ultravioleta,
lo que permite visualizar a los fragmentos de DNA obtenidos
(http://www.bio.davidson.edu,
http://people.ne.mediaone.net).

El procedimiento de la PCR se aplica rutinariamente en
el caso de alimentos no procesados, en los que el material
genético se encuentra intacto. Su selección
se fundamenta en su extrema sensibilidad que, bajo condiciones
experimentales óptimas, permite la amplificación de
más de un billón de copias de la secuencia deseada
a partir de una sola copia del ADN original (Tabla 3). En
ocasiones su uso se puede ver limitado en el caso de los
alimentos procesados, donde es más difícil aislar
cantidades suficientes del ADN intacto y donde el material
genéticamente modificado de distintas variedades pudiera
encontrarse mezclado entre sí. Los resultados de esta
prueba se estima que son confiables en un 99.9% de los casos
sometidos (http://www.bio.davidson.edu).

Existen tres factores esenciales que determinan el
éxito
del método de detección de OGM mediante PCR. Estos
son la cantidad de ADN extraído, la calidad,
la cual se relaciona con la cantidad de daño
que ha sufrido el ADN durante los pasos de procesamiento del
alimento, antes de la purificación y la pureza, la
cual refleja la cantidad de contaminantes purificados con el ADN
(Griffiths y cols., 1992).

Una extracción optimizada del ADN resulta
fundamental para asegurar la presencia y calidad del
material a amplificar por PCR (Fig. 1) (Tabla 3). Este aspecto
resulta particularmente importante en el análisis de
alimentos que han sido altamente procesados, pues el ADN puede
degradarse durante el procesamiento, particularmente por
tratamiento térmico en presencia de agua, por lo
que la cantidad de fragmentos que aún contienen el blanco
de interés intacto, puede decrecer a medida que el
alimento es procesado. En adición el método de
purificación de ADN utilizado debe remover todas las
sustancias inhibidoras presentes en la muestra (Griffiths y
cols., 1992).

Fig. 1: Organigrama de
análisis de un OGM por PCR.

Table 3: Características generales del PCR en
la detección de OGMs (Griffiths y cols.,
1992).

Comparación de las técnicas de
detección de proteínas y detección de
ADN.

Las principales diferencias entre los métodos de
detección de proteínas (ELISA), los cuales son
preferidos en los Estados Unidos y
las técnicas basadas en el ADN (PCR), las cuales son
preferidas en Europa, se
resumen en la Tabla 4.

Tabla 4: Principales diferencias de los ensayos
basados en la detección de ADN y en la detección de
proteínas (Gryson y
cols., 2005).

Métodos cuantitativos utilizando
PCR.

En principio la cuantificación basada en PCR
puede ser desarrollada después de la culminación
del PCR (análisis del punto final), mediante el llamado
PCR cuantitativo (Raeymackers, 1993) o durante el PCR
(análisis en tiempo real) que analiza la cantidad de
producto sintetizado durante la PCR, estimado directamente por la
medida de la fluorescencia en la reacción de PCR (Studer y
cols., 1998; Jordan, 2002).

Con la introducción de la legislación
sobre el mandato de marcaje de productos
alimenticios que contengan OGMs se ha incrementado la demanda de
laboratorios de testaje que desarrollen o adopten métodos
cuantitativos de detección. A partir de los esfuerzos
realizados para lograr el etiquetado de los alimentos
genéticamente modificados, como ingredientes de los
alimentos, los métodos de detección cuantitativa,
tales como PCR cuantitativo (QC-PCR) y PCR en tiempo real
(Real-Time PCR) se aplican en los laboratorios oficiales de
control de alimentos (Hubner y cols., 2001). Aunque los OGMs
aprobados para el consumo humano
han sido analizados con pruebas científicas rigurosas y
han sido fuertemente juzgados; el etiquetado permite que los
consumidores tengan la opción de seleccionar el alimento
que deseen (Ahmed, 2002).

¿Cómo detectar OGMs en el
futuro?

En un futuro cercano serán muchos los eventos
aprobados y liberados en el mundo. En diversos ámbitos se
está discutiendo la posibilidad de introducir secuencias
no codificantes en el genoma de las plantas junto con los genes
de interés de una modificación genética,
para generar blancos de detección universales frente a la
diversidad de eventos que habrá en el futuro (Van den Eede
y cols., 2002).

Frente a esta perspectiva de diversidad de
modificación genética y tan heterogénea
mundialmente, la nueva tecnología de los
microchips, microarrays o micromatrices,
podría permitir detectar y cuantificar en un solo ensayo
la presencia de cientos o miles de secuencias.

A grandes rasgos, un microchip es un soporte
sólido de pequeño tamaño, en el cual se han
fijado puntos ordenados y microscópicos de secuencias de
simple cadena conocidas. Estas secuencias tienen la capacidad de
hibridar con su ADN complementario, y si este está marcado
con un fluoróforo, el punto de la micromatriz
quedará marcado. Luego de la hibridación con la
muestra de ADN marcado, un aparato de barrido especial realiza
la lectura
punto por punto, identificando los puntos marcados y por lo tanto
las secuencias que están presentes en la muestra bajo
análisis.

Finalmente hay que mencionar que los materiales
genéticamente modificados que no mantengan una
equivalencia sustancial con los materiales tradicionales, por
definición, van a ser segregados e identificados de
acuerdo a la nueva característica de valor y serán
producidos y etiquetados de manera tal que se asegure su pureza,
calidad y su valor de uso diferencial.

Bibliografía

2. Ahmed, F.E. (2002). Detection of genetically modified
   organisms in foods. Trends in Biotechnology, 2002.
   20(5): 215-223.
3. Allman, M.; Candrian, U.; Höfelein, C. y
   Lüthy, J. (1993). Polymerase chain reaction (PCR): a
   possible alternative to immunochemical methods assuring safety
   and quality of food. Zeitschrift für
   Lebensmittel-Untersuchung und –Forschung. 196:
   248-251.
4. Atlas, R. M. y Bej, A. K. (1994). Polymerase Chain
   Reaction. In: Gerhardt, P., Murrey,R.G.E., Wood, W.A. and
   Krieg, N.R., (Eds.) Methods for general and molecular
   bacteriology. Washington, D.C.: American Society for
   Microbiology, pp. 418-435.
5. Ausubel, F.; Brent, R.; Kingston, R.; Moore, D.;
   Seidman, J.; Smith, J. y Struhl, K. (1995). Current
   Protocols in Molecular Biology. Massachusetts General
   Hospital, Harvard Medical School. Jhohn Wiley & Sons, Inc.
   ed. Supplement 18, 30.
6. Biotechnology. Methods for detection of GMO Grain in
   Commerce (2000). .
7. Blake, N. K.; Ditterline, R. L. y Stout, R. G.
   (1991). Polymerase chain reaction used for monitoring multiple
   gene integration in JUREDFWHULXP-mediated transformation.
   Crop Science. 31: 1686-1688.
8. Fagan, J.; Schoel, B.; Haegert, A.; Moore, J. y and
   Beeby, J. (2001). Perfomance assessment under field conditions
   of a rapid immunological test for
   transgenic. Int. J. of Food Science and Technology. 36:
   357-367.
9. Griffiths, K.; Partis, L.; Croan, D.; Wang, N. y
   Emslie, K. R. (2002). Review of technologies for detecting
   genetically modified materials in commodities and food.
   Department of Agriculture, Fisheries and Forestry, Australia:
   126.
10. Gryson, N. ; Rotthier, A. y Messens, K. (2005).
    Detection of genetically modified organisms in food and feed.
    In: Advanced course in regulatory and biosafety issues of
    Agricultural Biotechnology. Hogeshool Gent.
    2005.
11. Holst-Jensen, A.; Rønning, S.; Løvseth,
    A. y Berdal, K. G. (2003). PCR technology for screening and
    quantification of genetically modified organisms (GMOs).
    Anal. Bioanal Chem. 375: 985-993.
12. Hubner, P.; Waiblinger, H. U.; Pietsch, K. y
    Brodmann, P. (2001). Validation of PCR methods for quantitation
    of genetically modified plants in food. JAOAC Int. 84
    (6): 1855- 64.
13. Jongedijk, E.; de Schutter, A. A. J. M.; Stolte, T.;
    Van den Elzen, P. J. M. y Cornelissen, B .J. C. (1992).
    Increased resistance to potato virus X and
    preservation of cultivar properties in transgenic potato under
    field conditions. BioTechnology: 422-429.
14. Jordan, J. (2000). Real Time detection of PCR
    products and microbiology. Journal in Microbiology:
    61-65.
15. Lin, H.Y.; Chiang, J. W. y. Shih, D. (2001).
    Detection of genetically modified soybeans by PCR method and
    immunoassay kits. Yaowu Shipin Fenxi/Journal of Food and
    Drug Analysis. 9(3): 160-166.
16. Lipp, M.; Bluth, A.; Eyquem, F.; Kruse, L.; Schimmel,
    H.; Van den Eede, G. y Anklam, E. (2001). Validation of a
    method based on polymerase chain reaction for the detection of
    genetically modified organisms in various processed foodstuffs.
    European Food Research Technology: 497 -504.
17. Martínez, M. C. (2002). Laboratorio de
    detección de organismos genéticamente
    modificados. (http://www.redbio.org/portal/encuentros/enc_2001/minicursos/pdf).
18. Meyer, R.; Chardonnens, F. ; Hubner, P. Y Luthy,
    J. (1996). Polymerase chain reaction (PCR) in the quality and
    safety assurance of food: detection of soybean in processed
    meat products. Zeitschrift für
    Lebensmittel-Untersuchung und – Forschung A:
    339-344.
19. Ortiz, S. (2002). (http://nappo.org/PRA-Symposium/PDF-Final/Ortiz.pdf).
20. Raeymackers, L. (1993). Quantitative PCR: theoretical
    considerations with practical implications. Analytical
    Biochemistry: 582-585.
21. Roux, K. H. (1995). Optimization and troubleshooting
    in PCR. PCR Methods and Applications:
    185-194.
22. Spiegelhalter, F.; Lauter, F.R. y Russell, J. M.
    (2001). Detection of genetically modified food products in a
    commercial laboratory. Journal of Food Science. 66(5):
    634-640.
23. Stave, J.W. (1999). Detection of new or modified
    proteins in novel foods derived form GMO – future needs.
    Food Control. 10: 367-374.
24. Studer, E.; Rhyner, C.; Lüthy, J. y Hübner,
    P. (1998).  Quantitative competitive PCR for the detection
    of genetically modified soybean and maize.  Z. Lebensm.
    Unters. Forsch. A.  207: 207-213.
25. Tozzini, A. C. (2004). Detección de OGM en la
    cadena alimentaria. (http://www.inta.gov.ar/ediciones/2004/biotec/parte9-cap4.pdf).
26. Van den Eede, G.; Lipp, M.; Eyquem, F. y Anklam, E.
    (2000).  Validation of a double competitive polymerase
    chain reaction method for the quantification of GMOs in raw
    materials.  Report published by the European
    Commission, Joint Research Centre, IHCP, Ispra,
    Italy.  EUR 19676: 40.
27. Waiblinger, H.U.; Pietsch, K.; Brodmann, P.y Wurz,
    A.(1997). A screening method for the identification of
    ‘genetically modified’ food of plant origin. In:
    Foods produced by means of genetic engineering. Schreiber, G.A.
    & Bögl, K.W. (Eds) 2nd Status Report, BgVV-Heft
    1/1997, Bunderinstitut für gesundheitlichen
    Verbraucherschutz und Veterinärmedizin, Berlin, Germany:
    118-122.
28. Yang, J. S.; Yu, T. A.; Cheng, Y. H. y Yeh, S. D.
    (1996). Transgenic papaya plants from JUREDFWHULXP-mediated
    transformation of petioles of LQ_YLWUR propagated multishoots.
    Plant Cell Reports.15: 459-464.
29. Zamudio, T. (2005). Evaluación de alimentos
    derivados de OGM. (http://www.biotech.bioetica.org/d114).

Autor:

Belkis Corona,

País y ciudad de nacimiento: La Habana,
Cuba

Estudios realizados: Licenciatura en Microbiología, Master en
Microbiología Veterinaria,
PhD en Microbiología Veterinaria.

Profesión: Investigador, Biología
Molecular

Odalys Uffo, Siomara Martínez

Grupo de Biología Molecular, División de
Microbiología.

Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria, Apartado 10,
San José de las Lajas, La Habana, Cuba.

La Habana, Cuba, Septiembre 2007