Partes: 1, 2

2. Para este fin, puede utilizarse una cepa de referencia de M. gallisepticum (ATCC) u otra específicamente caracterizada, identificada y tipificada. Dicha cepa, debe ser capaz de multiplicarse en medios artificiales mostrando las características de crecimiento propias de M. gallisepticum reportadas en el Bergey´s Manual of Sistematic Bacteriology, 1984 como por ejemplo: crecimiento masivo en placa en forma de "cielo estrellado", reportado como típico de esta especie cuando es subcultivada a partir de altas concentraciones celulares, ya que se establecen fuertes relaciones de competencia por el medio y como consecuencia poco crecimiento y desarrollo de las colonias (Figura 1). Al realizar diluciones de este cultivo, puede apreciarse la conocida forma de "huevo frito" (Figura 2), reportada por Razin (1983) como característica distintiva para el género micoplasma y consistente en una zona central granular opaca embebida en el agar y una zona traslúcida periférica. Por otra parte, la cepa de M. gallisepticum debe presentar las propiedades bioquímicas descritas para su especie, siendo positiva ante las pruebas de sensibilidad a la digitonina, fermentación de la glucosa, reducción del tetrazolium, capacidad de hemoaglutinar y producción de hemólisis, y comportarse de forma negativa ante la hidrólisis de la arginina, actividad fosfatasa y producción de film y spot, así como, debe estimular convenientemente el sistema inmune del animal a fin de lograr una respuesta protectora.

    

   Figura 1. Crecimiento de la cepa S6 de M. gallisepticum en placas de agar, en forma típica de "cielo estrellado" (35 x)

   Figura 2. Crecimiento de la cepa S6 de M. gallisepticum en placas de agar, en forma típica de "huevo frito" (35 x)

    

3. Selección y caracterización de la cepa

   El Banco de Células Primario o Banco Maestro es la fuente de semillas para la inoculación de todos los cultivos pues éste sirve para preparar el Banco de Células de Trabajo (BCT) y el Banco de Células de Producción (BCP); por lo que de la calidad del Banco Primario, con un número limitado de pases del microorganismo y conservado adecuadamente depende en primer lugar el mantenimiento de la uniformidad y la consistencia de la producción (de igual forma los BCT y BCP deben tener establecido y especificado el nivel de pases que presentan). Los controles de calidad de los bancos deben contemplar tres aspectos importantes: chequeo de la autenticidad de la cepa, pureza microbiana y viabilidad de los lotes fundamentalmente. (Manual OIE, 1996; 9 CFR, 2001; Chiong, Sánchez, Rosado & Pérez, 2003).

4. Calidad de los Bancos de células
5. Medios de cultivo empleados

En el mercado internacional pueden adquirirse medios comerciales para el crecimiento de micoplasmas, como el medio PPLO (Difco) que suplementado con extracto de levadura, suero equino y glucosa se recomienda por el Manual OIE (1996) para la obtención de antígenos y vacunas de M. gallisepticum o el medio Mycoplasma base (Oxoid) también suplementado con estos componentes.

Recientemente se desarrolló un nuevo medio de cultivo (Varela et al., 2004) comercializado por BioCen, Cuba que es utilizado satisfactoriamente en el crecimiento de M. gallisepticum y otras especies de micoplasmas (Lobo, 2002; Pérez, 2004)

1.1.5 Parámetros del proceso

Entre los parámetros del proceso de fermentación de M. gallisepticum, se reporta el empleo de temperatura de incubación para el crecimiento de 37 °C (Evans & Hafez, 1992; Elfaki, Kleven, Lin & Ragland, 1993; Storm, 1995; Manual OIE, 1996), durante 24-30 horas aproximadamente en cultivo batch, con pH del medio de cultivo de 7,8 (Manual OIE, 1996).

Los micoplasmas se cultivan generalmente en frascos incubados estáticamente debido a que son microorganismos que demandan bajas concentraciones de oxígeno disuelto para su crecimiento y que al no presentar pared celular los efectos cortantes generados por la agitación pueden dañarlos, pero esto no asegura la homogeneidad del cultivo y los rendimientos obtenidos son muy pobres. Sin embargo, para la obtención de vacunas, se reportan resultados satisfactorios de crecimiento celular al cultivar cepas de M. gallisepticum en zaranda (Miles, 1992; Pérez, Sánchez, Rosado & Díaz, 1998) y en fermentadores de diferentes escalas (Sánchez, Pérez & Rosado, 1999; Sánchez, Pérez, & Rosado, 2002), logrando rendimientos celulares de hasta 5.1010 UFC/mL y velocidades de crecimiento de 0,25 h-1.

Otro aspecto importante es la relación volumen de inóculo/volumen de medio de cultivo; comúnmente se utilizan relaciones que van desde 1-10 %, reportándose por varios autores (Windsor, 1992; Elfaki et al., 1993) el empleo del 10 % de volumen de inóculo con respecto al volumen total.

1. Para la inactivación de micoplasmas se han utilizado métodos como la desintegración ultrasónica, tratamiento térmico, radiaciones y diferentes agentes químicos. Dentro de los agentes químicos inactivantes más empleados en cultivos de M. gallisepticum se encuentran: el formaldehido (Elfaki et al., 1993; Manual OIE, 1996; Vacuna MYPRAVAC. Laboratorios HIPRA, 1999), la beta-propiolactona (Yoder et al., 1983; Vacuna BIO MYCO. Catálogo del producto, Laboratorios Bioteke; Manual OIE, 1996), timerosal (Barile, 1985; Pérez, Sánchez, Rosado & Martínez, 2006), etanol (Barile, 1985), entre otros.

   Dadas las características de los micoplasmas debe seleccionarse un agente químico inactivante del microorganismo que provoque el menor efecto posible sobre las proteínas de membrana; en tal sentido Windsor (1992) recomienda no emplear en lo posible el formol ya que este puede provocar daños en la estructura de la proteínas de la superficie de las células y como resultado afectar las propiedades antigénicas y con esto la eficacia de la vacuna. Por otra parte, cuando se emplean los inactivantes como el formol y la beta-propiolactona es necesario neutralizarlos con otro agente químico después de realizado el tratamiento (Schrier, 1998).

   Para evaluar la efectividad del método de inactivación empleado, en la literatura se describen varias formas de realizar la comprobación (World Health Organization [WHO], 1973; British Pharmacopoeia, 1998), los cuales consisten en sembrar muestras del cultivo inactivado en medios de cultivo adecuados para el crecimiento de micoplasmas, incubar a 37 °C y chequear durante un número determinado de días que no se observe crecimiento de M. gallisepticum.

2. Inactivación microbiana

   Para la recuperación de la biomasa de M. gallisepticum se puede emplear la centrifugación, ultrafiltración u otro método de separación conveniente (Manual OIE, 1996), aunque generalmente se utiliza la centrifugación. Las centrífugas de flujo continuo más usadas en estos bioprocesos son las de rotor tubular y las de discos (Aroca & Zúñiga, 2000; Pérez & Sánchez, 2004).

   La masa celular obtenida de la centrifugación es utilizada para la formulación del producto vacunal, aunque en algunos procesos de obtención de bacterinas se describe que a continuación de esta etapa se realicen varios pasos de lavado del sólido con buffer fosfato salino (PBS), pH=7,1-7,2, y nuevamente se separe la masa celular a través de centrifugaciones.

3. Recuperación aséptica de la biomasa

   En esta etapa, las células concentradas son diluidas en un volumen determinado de PBS, que permita obtener el nivel apropiado de contenido de antígeno final en la vacuna. La solución de PBS puede contener además algún preservante para evitar la contaminación; se reportan para este fin antibacterianos como penicilinas (Manual OIE, 1996), timerosal (0,01%) (Barile, 1985; Elfaki et al., 1993).

4. Ajuste de la concentración microbiana al valor deseado
5. Formulación

Las bacterinas oleosas han sido muy utilizadas como método de control de la micoplasmosis aviar, aunque hay que señalar que se han evaluado bacterinas que para dispersar la fase acuosa, en lugar de aceites, emplean por ejemplo, un polisacárido sulfatado de origen natural (iota carrageenan) (Elfaki et al., 1993) y complejos inmunoestimulantes (Sundquist et al., 1996).

Generalmente las emulsiones del tipo agua en aceite (w/o) son capaces de inducir una respuesta inmune más potente que las del tipo aceite en agua (Aucouturier, Dupuis, & Ganne, 2001). Hasta el presente la mayoría de las vacunas aviares inactivadas son basadas en emulsiones agua en aceite (Schrier, 1998); específicamente para la formulación de bacterinas de M. gallisepticum diferentes adyuvantes se han empleado, reportando el Manual de la SEPPIC (1992) y Sánchez et al. (2004) el empleo de Montanide ISA-50 para la formulación de vacunas de micoplasmas.

Resulta de suma importancia que las emulsiones para vacunas permanezcan estables por largos períodos de tiempo. Un factor que dice cuán estable es o no una emulsión es el tamaño de las partículas que forman la fase dispersa, en este sentido, Muller y Heihemann (1992) prepararon emulsiones con diámetros de hasta 5 m m y como resultado obtuvieron que aquellas emulsiones con mayor número de glóbulos con diámetros de 2 m m poseen más estabilidad que las que contienen mayor cantidad de glóbulos con diámetros entre 1 y 5 m m. Por lo que para incrementar la estabilidad de emulsión vacunal (w/o), se deben obtener tamaños de gotas iguales o menores de 2 m m, lo cual depende entre otros factores del tiempo de emulsificación y de la velocidad de rotación del homogeneizador (Catálogo SEPPIC, 1993; Enríquez et al., 1995). Por otra parte, este tamaño de gota permite la difusión del antígeno en el animal inyectado hasta alcanzar de forma rápida y sistemática el tejido linfático y así desencadenar la respuesta inmune en el animal (Morris, 1999).

Existen varios métodos para conocer si una emulsión es o no satisfactoria, éstos consisten en controlar durante la fabricación de la vacuna factores tales como: la apariencia general de la emulsión, la sedimentación de la fase dispersa y la separación de la fase acuosa a través de pruebas aceleradas para estimar la estabilidad de las vacunas. Una de estas pruebas consiste en colocar las muestras a 37°C y a 56°C y verificar el tiempo que permanecen sin rotura de emulsión; la otra técnica descrita es la prueba de centrífuga, la cual consiste en centrifugar las muestras a 3 000 rpm durante 1 hora, considerando para ambas pruebas que el producto es estable si no se observa separación de líquido acuoso en el fondo del tubo, es decir, que no haya rotura de la emulsión (OPS, 1987; Enríquez et al., 1995).

2. Controles del producto final obtenido

En la Tabla 1 se pueden observar los controles propuestos para la evaluación del Producto Final según lo recomendado por el Manual OIE (1996).

Tabla 1. Controles de calidad y criterios de aceptación para la evaluación de una vacuna inactivada oleosa contra M. gallisepticum.

Indicadores de calidad	Criterios de aceptación
Características organolépticas	Emulsión oleosa de color y olor característicos
Prueba de esterilidad	Producto estéril
Prueba de inocuidad	Producto inocuo
Prueba de potencia	Protección frente a una cepa patógena de M. gallisepticum
Residualidad del agente inactivante	Concentración menor permisible, según el tipo de inactivante utilizado
Estabilidad térmica	Emulsión estable sin rotura de la misma (no separación de líquido acuoso en el fondo de los tubos)
Estabilidad mecánica	Emulsión estable sin rotura de la misma (no separación de líquido acuoso en el fondo de los tubos)

3. Medidas de protección y tratamiento de los desechos en un proceso de obtención de una bacterina contra M. gallisepticum

En la definición de una tecnología es importante la consideración del medio ambiente, en tal sentido podemos decir que M. gallisepticum es microorganismo que se ubica en el grupo de riesgo II (riesgo individual moderado y comunitario limitado), que puede provocar la enfermedad a las aves; pero tiene pocas probabilidades de entrañar un riesgo grave al personal de laboratorio, la comunidad o al medio ambiente. Teniendo en cuenta esto, se deben disponer de medidas eficaces de tratamiento y prevención.

En el laboratorio se debe trabajar bajo gabinetes de bioseguridad y usar ropa sanitaria completa, la que debe cambiarse después de concluido el trabajo, desinfectarse las manos con alcohol (70%) y posteriormente lavarlas.

Concluida cada etapa del proceso, los equipos utilizados en la misma deben ser descontaminados por calor (121°C) durante 1 hora, los residuales pasarán a un tanque y comprobada la completa inactivación del microorganismo se desecharan.

4. Evaluación económica de un proceso de obtención de una vacuna contra M. gallisepticum

Una vez que se plantea una variante factible desde el punto de vista tecnológico, debe ser sometida a un análisis complementario donde se demuestre la efectividad económica de la propuesta. En este análisis es fundamental la determinación del costo de producción y el beneficio producido por la vacunación pues el costo de una vacuna nunca deberá exceder las pérdidas en que se incurre por concepto de la enfermedad (Barreras, 2000).

Para decidir si la alternativa estudiada puede ser escogida por la empresa, debe calcularse su costo de inversión, su comportamiento en el flujo de caja, así como el plazo de recuperación de la inversión. En este análisis es fundamental la determinación del costo de producción, que es el conjunto de gastos económicos en que incurre una planta o proceso industrial, durante un período de tiempo dado, como consecuencia de la utilización de recursos materiales y humanos, que tienen lugar durante el proceso de elaboración de los productos terminados.

El costo de producción está constituido fundamentalmente por los siguientes elementos:

• Costo de la materia prima y materiales de producción.
• Costo de mantenimiento o reparación.
• Costo de la fuerza de trabajo utilizada en el proceso productivo.
• Depreciación.
• Costo de facilidades auxiliares.
• Costo de suministros de operación.
• Costos generales.
• Costo de administración o dirección.

Bibliografía

1. Aroca, G. y Zúñiga, María Elvira. (2000). Bioseparaciones. VI Curso Latinoamericano de Biotecnología. Escuela de Ing. Bioquímica - Universidad Católica de Valparaíso - Chile.
2. Aucouturier, J.; Dupuis, L. y Ganne, V. (2001). Adjuvant designed for veterinary and human vaccines. Vaccine, 19 (17-19): 2666-2672.
3. Barberà, E. (2000). Biotecnología con microorganismos. Curso de la Maestría de la Facultad de Ingeniería Química del Instituto Químico de Sarrià. Barcelona, España.
4. Barile, M. F. (1985). Immunization against Mycoplasma infections. En: The Mycoplasmas. Vol. IV. pp. 452-483.Razin, S. y Barile, M. F. (Eds.). Academic Press, Inc. Florida. USA.
5. Barreras, Maritza (2000). Vacunas. Generalidades y diseño. En: Tendencias mundiales en el desarrollo de vacunas agropecuarias. Tomo I. pp. 59-68. CENSA. MES.
6. Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology. (1984). Krieg, N. R. y Holt, J. G. (Eds.). Vol. 1. Baltimore, USA.
7. British Pharmacopoeia (Veterinary). (1998). Test for absence of mycoplasma. A-17. pp. 125-140.
8. Catálogo de la SEPPIC (1993). Adyuvantes Montanides.
9. Chiong, Adlin; Sánchez, Lilian, Rosado, Ileana y Pérez, Tania. (2003). Obtención del Banco de Producción de Mycoplasma gallisepticum. Rev. Salud Anim. 25 (1): 62-65.
10. Code of Federal Regulations (2001). 9 CFR. Parts 1 to 1999. Animal and Animal Products. Animal and Plant Health Inspection Service, USDA: 769-773.
11. Elfaki, M. G.; Kleven, S. H.; Lin, L. H. y Ragland, W. L. (1993). Protections against airsacculitis with sequential systemic and local immunization of chickens using killed M. gallisepticum bacterin with iota carrageenan adjuvant. Vaccine 11 (3): 311-317.
12. Enríquez, A.; Canales, M.; Ramos E.; Dandie, H.; Bové, O.; Soto, A. y Cabrera, D. (1995). Production of a recombinant vaccine against Boophilus microplus. En: Recombinant vaccines for the control of Cattle Tick. Fuente, J. de la (ed). Monograph. Elfos Scientific. Cuba.
13. Evans, R. D. y Hafez, Y. S. (1992). Evaluation of a Mycoplasma gallisepticum strain exhibiting reduced virulence for Prevention and Control of Poultry Mycoplasmosis. Avian Dis. 36: 197-201.
14. García, J. L. (2000). Buenas Prácticas de Vacunación. Información de enfermedades Volvac®. Boletín Técnico Avícola. Boehringer Ingelheim Vetmedica. Año 2. No. 8 noviembre.
15. Laboratorios HIPRA, S.A. (1999). Pruebas de control del producto final. Vacuna inactivada contra la micoplasmosis aviar, MYPRAVAC. pp. 2-3. Girona. España.
16. Levisohn, S. y Kleven, S. H. (2000). Mycoplasmosis aviar (Mycoplasma gallisepticum). 19 (2): 425-442.
17. Lobo, Evelyn (2002). Aislamiento y caracterización de M. pullorum como cepa de nuevo reporte para el país. Tesis en opción al Título de Doctor en Ciencias Veterinarias. CENSA.
18. Manual de la SEPPIC (1992). Montanide* ISA. Pharmac. Division. France.
19. Manual OIE (1996). Manual of Standards for diagnostic test and vaccines. Office International des Epizooties, 3rd ed. pp. 512-521. Paris, France.
20. Miles, R. J. (1992). Cell nutrition and growth. En: Mycoplasmas. Maniloff, J. (Ed). pp. 23-37. American Society for Microbiology. Washington.
21. Morris, J. H. Adyuvantes inmunológicos (1999). Rev. Cubana Invest. Biomed. 18 (2):130-137.
22. Muller, R. H. y Heihemann, S. (1992). Evaluation of microscopic and laser light scattering methods for determination of physical satiability. Fat emulsions for parenteral. Nutrition I-IV.
23. Nepomuceno da Silva, E. (2000). Nuevos conceptos en el control de Micoplasma aviar. Avicultura profesional. 18 (2):15-17.
24. OPS (1987). Producción, control de la calidad y uso de vacunas. Programa de adiestramiento en Salud Animal para América Latina.
25. Pérez, Tania (2004). Desarrollo de una tecnología para la obtención de un candidato vacunal contra la micoplasmosis aviar. Rev Salud Anim. 26 (2): 143.
26. Pérez, Tania y Sánchez, Lilian. (2004). Selection of a centrifugal separation equipment for the recovery of M. gallisepticum cells. Rev. Salud Anim. Vol. 26 (3): 188-191.
27. Pérez, Tania; Sánchez, Lilian; Rosado, Ileana y Martínez, Siomara. (2006). Obtainment of a cuban vaccine candidate against M. gallisepticum infection. En: Program and Abstracts. 16th International Congress of the IOM. 9-14 July, 2006. St. John´s College, Cambridge, UK.
28. Pérez, Tania; Sánchez, Lilian; Rosado, Ileana; Díaz, T. (1998). Efecto de la agitación sobre el crecimiento de M. gallisepticum. Rev. Salud Anim. Vol. 3 (3): 153-157.
29. Razin, S. (1983). Introductory comments. En: Methods in Mycoplasmology. Razin, S. y Tully, J. G. (eds). Vol. 1. pp. 185- 196. Academic Press. New York.
30. Rodwell, A. W. (1983). Defined and partly defined media. En: Methods in mycoplasmology. Razin, S. y Tully, J. G. (Ed.). Vol.1 Academic Press. New York.
31. Sánchez, Lilian ; Pérez, Tania y Rosado, Ileana. (2002). Producción de M. gallisepticum empleando bioreactores del tipo tanque agitado. Rev. Tecnol. Ciencia Ed. (IMIQ). 17 (1). México.
32. Sánchez, Lilian; Pérez, Tania; Rosado, Ileana; Martínez, Siomara; Correa, H.; Pérez, Aleyda y Riverón, Yamilka. (2004). Preliminary study of the adjuvant emulsion Montanide ISA-50 and M. gallisepticum antigen. Rev. Salud Animal. Vol. 26 (3): 213-215.
33. Sánchez, Lilian; Pérez, Tania y Rosado, Ileana (1999). Obtención de cultivos de Mycoplasma gallisepticum mediante fermentación. Rev. Salud Anim. Vol. 21 (3): 175-180.
34. Schrier, C. (1998). Improved inactivated vaccines. Canadian Patent CA 2216410.
35. Snell, G. C. (1981). A comparison of alternative methods to viable count for indicating growth of M. gallisepticum in liquid culture. J. Appl. Bacteriol. 50: 275-281.
36. Storm, P. K. (1995). Mycoplasma vaccine. Canadian Patent CA 1336262. Application number: 577610.
37. Sundquist, B. G.; Czifra, G. y Stipkovits, L. (1996). Protective immunity induced in chickens by a single immunization with M. gallisepticum immunoestimulating complex (ISCOMs) Vaccine. 14: 892-97.
38. Varela, A.; Paret, Alix; Pérez, Tania; Sánchez, Lilian; Rosado, Ileana y Martínez, Siomara. (2003). Medio de cultivo para el crecimiento de micoplasmas. Patente concedida por la Oficina Cubana de la Propiedad Industrial. Cuba.
39. Windsor, G. D. (1992). Productions of Vaccines. Patent. International. Publication number: WO 92/18161.
40. World Health Organization (1973). Requirements for biological substances and others set of recommendations. General requirements for the sterility of biological substance. No. 530.
41. Yoder, H. W.; Hopkins, S. R. y Mitchell, B. W. (1983). Evaluations of inactivated M. gallisepticum oil-emulsion bacterins for protections against airsacculitis in broilers. Avian Diseases. 28 (1): 224-234.

 

*Autor correspondiente:

Tania Pérez Bueno

(Investigador Auxiliar)

Edad: 36 años

Estudios realizados:

• Ingeniería Química. Instituto Superior Politécnico "José A. Echeverría" (CUJAE), Cuba, 1993.
• Master en Ingeniería de los Procesos Biotecnológicos. Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología (CIGB), Cuba, 1996.
• Doctor en Ciencias Técnicas. CUJAE, Cuba, 2002.

Sánchez M., Lilian

Rosado R., Ileana

Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA)

Carretera de Jamaica y Autopista Nacional. Apartado 10 San José de Las Lajas.

La Habana, Cuba.

Tel. (+53-47) 86 3653, fax (+53-47) 86 3206.

Categoría: Agricultura y Ganadería