Análisis por espectrofotometría de la valeriana (página 2)
DEFINICIÓN DEL
PROBLEMAValeriana prionophylla es una
especie nativa de Mesoamérica, utilizada en Guatemala
para tratar el insomnio al igual que
Valeriana officinalisla cual es una
especie que se encuentra en varias farmacopeas del mundo y
que cuenta con muchos estudios sobre su composición
química, en especial de los compuestos
químicos llamados Valepotriatos a quienes se le
atribuye gran responsabilidad en la actividad
farmacológica. En la actualidad, se desea equipar el
uso V. prionophylla
conrelación a V.
officinalis, pero se tiene pocos estudios
dedicados a su composición química por lo que
se hace necesario realizar estudios fitoquímicos de la
especie, entre los cuales podemos incluir la
determinación de isovaltrato por
espectrofotometría de absorción ultravioleta
visible; a la vez compararlos entre materiales
cultivado y silvestre de dos localidades diferentes de
Guatemala.JUSTIFICACIÓN
Para poder
equiparar V. prionophylla con V. officinalis,
es necesario detectar e identificar los valepotriatos
presentes con el fin de establecer una relación
cualitativa de los mismos entre ambas especies; además
al generar esta información de V. prionophylla
se estará aportando datos para la
elaboración de una monografía completa de la especie, ya
que en la actualidad se están realizando estudios
sobre su composición química, actividades
farmacológicas y actividad biocida. para en el futuro
comercializarla en el mercado
garantizando la calidad de
dichos productos.En la actualidad no se encuentran reportadas
metodologías analíticas estandarizadas por
espectrofotometría de absorción tendientes a la
identificación y valoración de valepotriatos
(isovaltrato) en V. prionophylla, por lo que resulta
importante el desarrollo
del presente trabajo.
Esto será de utilidad para
analizar la calidad material vegetal destinado a la
elaboración de productos fitoterapéuticos a
base de V. prionophylla.MARCO
TEÓRICO
Familia Valerianaceae
La familia
Valerianaceae contiene cerca de 350 especies distribuidas
alrededor del mundo (excepto Nueva Zelanda y Australia). Se
caracterizan por tener flores simpetalas, ovario inferior
tricarpelar, fruto en aquenio y ausencia de endospermo.
La familia
exhibe considerable diversidad morfológica en sus frutos
y flores, la variación más perceptible en la
morfología de las flores es concerniente
al número de estambres, con rango de 1 a 4. Esta familia
parece ser originaria de Asia,
probablemente de los Himalayas y subsecuentemente se
dispersó por Europa y
todo el nuevo mundo. La presencia en muchas especies de
iridioides del tipo valepotriatos, caracterizan el grupo
(1).
El género
representativo agrupa hierbas y arbustos perennes nativos sobre
todo de las regiones templadas del hemisferio norte. Las
valerianas alcanzan una altura comprendida entre 50 cm. y 1.5 m
y forman raíces gruesas de olor acre y hojas simples o
lobadas. Las flores pequeñas, rosas o
blancas, se agrupan en inflorescencias apretadas y suelen ser
muy fragantes. La valeriana o hierba de gatos, recibe este
nombre porque el olor de sus flores atrae a los gatos. Es
nativa de Europa y el norte de Asia y se cultiva como
ornamental; de las raíces se extrae un medicamento
sedante. Es uno de los remedios naturales más utilizados
en el tratamiento de las afecciones nerviosas. El nombre
científico de la familia es Valerianaceae y el
género representativo es Valeriana. La valeriana
o hierba de gatos es la especie Valeriana officinalis
(2).
5.2 Valeriana prionophylla
Valeriana prionophylla es una especie nativa de
Mesoamérica, utilizada en Guatemala para tratar el
insomnio al igual que Valeriana officinalis la cual es
una especie que se encuentra en varias farmacopeas del mundo y
que cuenta con muchos estudios sobre su composición
química, en especial de los compuestos químicos
llamados Valepotriatos a quienes se le atribuye gran
responsabilidad en la actividad
farmacológica.
En la actualidad, se desea equiparar el uso V.
prionophylla con relación a V. officinalis,
pero se tiene pocos estudios dedicados a su composición
química por lo que se hace necesario realizar estudios
fitoquímicos de la especie, entre los cuales se pueden
incluir la detección de Isovaltrato por cromatografía en capa fina y
espectrofotometría de absorción ultravioleta
visible; a la vez compararlos entre materiales cultivados en
dos localidades diferentes de Guatemala.
Descripción Botánica:
Reino: Plantae
Subreino: Tracheobionta
División: MAGNOLIOPHYTA
Clase: Magnoliopsida
Subclase: Asteridae
Orden: Dipsacales
Familia: Valerianaceae
Genero: Valeriana
Especie: prionophylla
Nombre Científico: Valeriana prionophylla
Standl.
Nombres Comunes: Valeriana, Pericón de monte o
Ceiba
Hierba perenne erecta, a menudo bifurcada,
raíces olorosas, los tallos de 10-80 cm. de alto,
esparcidamente pilosos o casi glabros, los núcleos
pilosulosos; hojas predominantemente basal, usualmente
numerosas y aprisionadas, algunas cespitosas, las hojas in
divididas, oblongo-linear a espaluladas, de mayoría de
3-30 cm. de largo, 0.5-3 cm. de ancho, obtusas, atenuadas
hacia la base subpeciolar, los márgenes serrados,
serrado-dentado, crenada o raramente entero, usualmente
ciliado, glabra o pilosulada, hojas caulinares 2-3 pares
principalmente 2-20 cm de largo, usualmente sésiles y
envuelta en la base, algunas veces corto-peciolada;
inflorescencia largamente redunculada, las flores numerosas
dispuestas en un dicasio agregado, densa o difusa;
brácteas lineares, limbo del cáliz con 9-11
segmentos exserta, anteras aprisionadas 4-lobadas, la teca
surcada: estilo exserto aquenios 2-3 cm de longitud, lisos o
transversalmente rugulosos, glabros o piloso, el adaxial con
costillas usualmente conspicuas (3).Distribución: Chimaltenango, Guatemala,
Huehuetenango, Quetzaltenango, Sacatepéquez, San
Marcos, Sololá, Totonicapán, México (Chiapas) y
Costa
Rica.Hábitat: En campos abiertos, frío,
bosque de pino, en prados montañosos fríos y
húmedos o preferiblemente en lugares desérticos
en riscos rocosos, algunas veces sobre calizas
(4).
Usos Populares: Sedante y antiespasmódico
(4).
5.2.1 Estudios publicados.
Valeriana prionophylla es una especie a la que
se le ha atribuido actividad sedante e hipnótica, aunque
los estudios realizados son pocos tanto en relación con
su actividad farmacológica como con su
composición química, su uso popular es
externo.
Entre los estudios realizados se encuentra la
"Evaluación de la actividad biocida e
identificación química de valepotriatos en tres
plantas
reconocidas popularmente en Guatemala como valeriana",
reportó que la raíz pulverizada de V.
prionophylla originaria de Nebaj, Quiché, contiene
mayor cantidad de valepotriatos, de ácidos
hidroxivalerénico y valerénico que V.
officinalis proveniente de España;
estos compuestos forman parte del complejo químico
responsable de la actividad farmacológica de V.
officinalis, por lo que se deduce que son los que
harían parte también de la actividad
farmacológica de V. prionophylla (4).
Otro estudio, muestra que
V. prionophylla contiene prinsepiol,
8-hidroxipinoresinol-4´-O-β-D-glucopiranósido
y 8-hidroxipinoresinol, moléculas que han sido aisladas
de las raíces de V. officinalis a las cuales se
les ha atribuido parte del efecto farmacológico; los
ensayos
farmacológicos realizados muestran que el extracto
alcohólico ejerce mejor efecto que cada uno de los
componentes administrados por separado. Este estudio indica que
el extracto etanólico ejerce actividad vaso relajante y
antioxidante (5).
Otro estudio realizados confirma la presencia de
diversos Valtratos (acevaltrato, didrovaltrato, valtrato,
isovaltrato) en las raíces, constituyentes igualmente
aislados de V. officinalis y que forman parte del
conjunto de moléculas responsables de la acción farmacológica
(6).
Un estudio de caracterización de V.
prionophylla, nos describe que en el análisis fitoquímico realizado se
encontró ácido valerénico y un producto de
degradación de baldrinal (7)
Valeriana officinalis
Las raíces de V. officinalis contienen
algunos compuestos con actividad farmacológica
demostrada, estos incluyen el aceite
esencial y sus sequiterpenoides (ácido
valerénico), iridioides (valepotriatos) y sus productos
de descomposición como el baldrinal y homobaldrinal,
aminoácidos (arginina, GABA, glutamina, tirosina), y
alcaloides. V. officinalis también contiene
pequeñas cantidades de ácidos fenólicos y
flavonoides, ácido clorogénico, ácido
cafeico, colina, β-sitosterol, ácidos grasos y
varios minerales
(2).
5.3.1 Terpenoides
5.3.1.1 Aceite volátil de V. officinalis
y sus constituyentes
El aceite volátil producido por esta especie
consiste en una mezcla de mono y sesquiterpenoides. Los
sesquiterpenoides son los componentes de mayor interés
e importancia por su quimiotaxonomía y actividad
biológica que presentan. El aceite esencial se encuentra
entre 0.1 a 0.6% y su composición varía
significativamente; contiene mono y sesquiterpenos carbonados,
dentro de los constituyentes encontramos acetato de bornilo,
valerianol, valeranona, criptofauronol y valeranal.
Los sesquiterpenos tienen tres tipos de estructuras
basadas en los esqueletos de kesano, valeranona y ácido
valerénico. El ácido valerénico y sus
derivados (ácido acetoxivalerénico y ácido
hidroxivalerénico) han sido reportados como
característicos de esta especie y de sus subespecies.
Sin embargo, estos compuestos han sido encontrados en otras
especies.
Más de 150 compuestos han sido reportados en el
aceite esencial. El acetato de bornilo y el isovalerato han
sido reportados como los componentes primarios del aceite
esencial, otros componentes primarios incluyen
valeraniol, valeranona y valerenal; otros compuestos
secundarios incluyen isoborneol, borneol, acetato de
isobornilo, terpinoleno, α-pineno, β-pineno,
kanfeno, β-cariofileno y limoneno.
Las fórmulas químicas de algunos de los
componentes más frecuentemente encontrados se describen
en las Figuras 1, 2 y 3 (2).
Valepotriatos
Entre otros terpenoides no presentes en el aceite
volátil de V. officinalis están los
Valepotriatos que son triésteres de un terpenoide, el
alcohol
trihídrico; este alcohol tiene la estructura
de un iridioide ciclopentapirano con un anillo epóxido
unido. Las concentraciones de valepotriatos están entre
0.5 y 2%, sin embargo en la raíz este porcentaje puede
llegar hasta 14% dependiendo de la especie.
Los valepotriatos se degradan rápidamente,
especialmente en soluciones
ácidas. Secada cuidadosamente, V. officinalis
puede llegar a contener 0.8% de valepotriatos (8).
Figura 2. Sesquiterpenos encontrados en
Valeriana officinalis
Los valepotriatos fueron aislados por primera vez en
1996 de V. wallichii. El aislamiento de estas sustancias
fue de gran interés ya que ello proveyó algunas
respuestas en torno al efecto
sedativo tranquilizante de los extractos de valeriana, los
cuales no podían ser explicados únicamente con
base en la cantidad de aceite volátil presente
(2).
Figura 3. Derivados valerénicos
encontrados en Valeriana officinalis
El esqueleto monoterpénico de los valepotriatos
es esencialmente el mismo que el del grupo de glicósidos
monoterpénicos conocidos como iridioides, sin embargo
los valepotriatos usualmente no tienen un azúcar residual en su estructura
(2).
Los primeros tres valepotriatos aislados de V.
wallichii fueron nombrados como valtrato, acevaltrato y
didrovaltrato (2). La Figura 4 muestra un listado general de
las estructuras químicas de los iridioides.
Basados en su estructura química, los
valepotriatos pueden ser divididos en cuatro grupos: tipo
dieno, tipo monoeno, tipo hidrino-valtrato y tipo dexosi
monoeno de valepotriatos (9). Los valepotriatos son compuestos
inestables: ellos son termolábiles y se descomponen
rápidamente bajo condiciones ácidas ó
básicas, en soluciones acuosas y también en
soluciones alcohólicas. En metanol anhidro y a 20
ºC, los valepotriatos dieno muestran una estabilidad
relativa. Disolviendo en metanol o etanol, con
únicamente una pequeña cantidad de agua y
almacenando a temperatura
ambiente,
tenemos alrededor de un 90% de descomposición en pocas
semanas (10).
5.3.1.3 Productos de descomposición y
metabolitos
Los valepotriatos se hidrolizan rápidamente y
no se encuentran presentes cantidades significantes de los
mismos en soluciones acuosas o alcohólicas diluidas,
después de pocos días. Ellos también son
metabolizados en el tracto gastrointestinal y se obtienen
productos como baldrinal, homobaldrinal, deacibaldrinal y
valtroxal (11). En la Figura 5 se muestran las estructuras
químicas de estos compuestos.
Figura 4. Iridioides presentes en
Valeriana officinalis
Figura 5. Productos de
descomposición y metabolitos presentes en V.
officinalis
5.3.2 Compuestos nitrogenados
5.3.2.1 Alcaloides
En algunas plantas medicinales los alcaloide son los
metabolitos secundarios más importantes pero este no es
el caso de Valeriana, donde los alcaloides presentes se
encuentran en pocas cantidades. La presencia de alcaloides en
este género se conoce desde finales del siglo XIX, pero
no fue sino hasta 1967 que se aislaron los alcaloides
valeranina y actinidina de V. officinalis (12). En la
Figura 6 se muestran las estructuras químicas de estos
compuestos.
Figura 6. Alcaloides presentes en
Valeriana officinalis
5.3.2.2 Aminoácidos
V. officinalis contiene una cantidad apreciable
de aminoácidos. En un estudio realizado se
encontró la presencia de tirosina, glutamina y GABA
(ácido γ-amino butírico) (13). En la Figura
7 se muestran las estructuras químicas de estos
compuestos.
Figura 7. Aminoácidos presentes en
Valeriana officinalis
Técnica
cromatográficaLa cromatografía es una de las técnicas más efectivas para
separar e identificar los componentes químicos. El
método fue desarrollado por el
botánico ruso Mikhail Tswett, en 1906, que
utilizó una columna de carbonato cálcico para
la separación de pigmentos vegetales, llegando a la
conclusión de que la clorofila no era un simple
compuesto químico. Las técnicas
cromatográficas actuales tienen multitud de formas,
la mayoría de las cuales pueden ser automatizadas y
están adaptadas para el reparto de gran o
pequeña cantidad de sustancias, siendo separadas y
purificadas. .La separación consiste en un proceso
de competición donde las moléculas
tendrán que elegir en que fase residen
(estacionaria, no se mueve a lo largo del proceso de
separación, o móvil, líquida o
gaseosa). Estas diferencias a la hora de elegir son las que
aprovechamos para su separación (14). En base a la
naturaleza del soporte en el que se aloja la
fase estacionaria, se puede clasificar en:A. Cromatografía plana:
1. Cromatografía en papel
2. Cromatografía en capa fina (TLC)
B. Cromatografía en columna
1. Cromatografía de gases
(GC)2. Cromatografia líquida (LC)
a. Cromatografía líquido –
líquidob. Cromatografía sólido –
LíquidoCromatografía en Capa
Fina
La cromatografía en capa fina, o más
comúnmente TLC (thin layer chromatography, en inglés), es una técnica
cromatográfica utilizada, entre otros posibles usos,
para separar los componentes puros que forman parte de una
mezcla. Esta separación se consigue mediante la
diferencia entre las fuerzas de adhesión de las
moléculas de los componentes a una fase móvil
(normalmente, un disolvente) y a una fase estacionaria (la
llamada capa fina, que puede ser papel o gel de sílice).
Esta diferencia se traduce en un mayor o menor desplazamiento o
movilidad de cada componente individual, lo cual permite su
separación e identificación (14).
La cromatografía de capa fina es una forma de
cromatografía en columna en la cual el material
adsorbente reposa en un cristal o en una película de
plástico. Se basa en la distribución en dos fases, la
estacionaria, compuesta por una capa de hidratación y la
móvil, que se trata de un solvente orgánico. El
soporte es una capa de 0,1 a 1 mm de óxido de
silícico o celulosa,
apoyada en un subsoporte de cristal. La capa se aplica
manualmente mediante un aparato que deja una ranura regable por
la que sale la pasta denominada Silicagen, este aparato se
desliza por la placa a velocidad
constante para conseguir la textura deseada. La
cromatografía en capa fina aguanta tratamientos de
visualización muy potentes debido al subsoporte y que es
más rápida, pudiendo terminar la corrida en una
media hora.
Una vez realizada la cromatografía, hay que
identificar el compuesto. Escogemos la distancia recorrida
desde el origen, pero esta distancia depende del tiempo,
además de otros factores y, por lo tanto está muy
en función
de las condiciones experimentales. Si la relacionamos con otra,
todas las variables se
anularían, diferenciándose sólo en la en
la distancia recorrida en la cromatografía y, por tanto,
en la diferente naturaleza de los componentes. Una vez
caracterizado el parámetro, medimos con una regla y se
efectúa la relación con otro dato, hay que seguir
unos pasos para poder identificar el componente separado, los
cuales son:
Formar tablas: donde hay que tener en cuenta la
naturaleza de las fases para
una correcta tabulación.
Patrones conocidos: comparar con otras muestras
patrón ya conocidas.Reacciones específicas o colorantes: Podemos
identificar compuestos mediante reacciones específicas
de los mismos.
Cromatografía en Columna
Todas las cromatografías denominadas en
columna se caracterizan por tener una fase estacionaria que
se encuentra dentro de una columna de vidrio
de 5 a 30 mm de diámetro por la que se hace pasar
una fase móvil líquida o gaseosa que
estará en permanente movimiento. Según la afinidad de las
moléculas por la fase móvil o la
estacionaria, éstas se separaran. Después de
cada cromatografía podremos sacar información
del cromatograma tanto cualitativa (para identificar los
distintos compuestos de la mezcla) como cuantitativa (para
poder obtener la cantidad y composición de las
sustancias separadas). Las fases estacionarias pueden ser
de materiales muy distintos, existen derivados de dextranos
(sefadex), derivados de agarosa, poliacrilamida, esferas de
vidrio, sílice, etc. (15)Existen distintos tipos de cromatografía en
columna:Cromatografía de intercambio iónica:
se basa en la afinidad de los iones en solución por
los sitios de polaridad opuesta que se encuentran en la
fase estacionaria.Cromatografía de exclusión: Se basa
en la habilidad de materiales de porosidad controlada para
separar los componentes de una mezcla de acuerdo al
tamaño y forma de las moléculas.Cromatografía de afinidad: se basa en la
especificidad de algunas macromoléculas
biológicas. Éstas se unen
específicamente a la fase estacionaria y para
separar dicha macromolécula, bastará con
variar el pH una
vez que la columna este limpia y sólo se encuentre
la que nos interesa.Cromatografía de adsorción: se basa
principalmente en las diferencias en la afinidad relativa
de los compuestos por el sólido utilizado como fase
estacionaria. Las separaciones obtenidas se determinan casi
exclusivamente por interacciones polares, siendo la fase
estacionaria más polar que la fase
móvil.Cromatografía de alta resolución
(HPLC) y Cromatografía de gases.Espectrofotometría de Absorción
Ultravioleta Visible
Los métodos
espectroscópicos de análisis se basan en la
medición de la radiación
electromagnética emitida o absorbida por la materia. Los
de emisión utilizan la radiación emitida por una sustancia que
ha sido excitada por una energía térmica,
eléctrica o electromagnética, al pasar al
estado
fundamental. Esta radiación es característica del
material o compuesto emisor. Los de absorción se basan
en la disminución de potencia de
una radiación electromagnética que ha
interaccionado con la materia. Miden la relación entre
intensidad final – inicial mediante un parámetro
denominado Transmitancia. Para que haya interacción entre la radiación
electromagnética y la materia es necesario: que la
energía asociada a esa radiación
electromagnética satisfaga a la necesidad de
energía de ese salto y que exista una probabilidad
de transmisión entre niveles. También hay que
tener en cuenta el orden de adición de los reactivos,
porque puede influir en la obtención de la absorbancia
(16).
En la espectrofotometría molecular ultravioleta
visible vemos transiciones moleculares utilizando ultravioleta
visible. El rango espectral para ultravioleta va de 200 –
400nm, y para el visible va de 400 – 700 nm. El rango de
energía que abarca es de 6 e-V (electrón voltio).
En los espectros de absorción influye el estado
físico del absorbente (analito) y el tipo de disolvente
empleado. Los compuestos que absorben en ultravioleta visible
se denominan Cromóforos, dentro hay inorgánicos,
orgánicos y complejos de transferencia de
carga.
Orgánicos: Los que tienen enlaces insaturados
(dobles y triples enlaces) porque los electrones no
están tan fuertemente unidos con en los enlaces
sencillos. Los compuestos
orgánicos con oxígeno, azufre, nitrógeno o
halógenos presentan absorción en ultravioleta
porque los electrones no compartidos no están tan
fuertemente unidos, y son lo que provocan la
transición.
Inorgánicos: Tienen transición en
ultravioleta visible, los complejos formados con compuestos de
las primeras series de transición van a dar
transición en al menos algún estado de
oxidación.
Complejos de transferencia de carga: Son los grupos
donadores de electrones enlazados, los donan a un compuesto
receptor de electrones con orbitales vacíos, cuando este
compuesto donador absorbe la energía uno de estos
electrones se transfiere al orbital vacío del receptor y
se produce un estado de oxidación – reducción
interno, estos compuestos tienen absortividades molares
altísima, por lo que permiten un elevada sensibilidad,
la mayoría implican un ión metálico,
pueden ser tanto compuestos inorgánicos como
orgánicos.
Este es uno de los métodos más
utilizados en laboratorios químicos y clínicos, y
se caracteriza por la amplia aplicación a compuestos
orgánicos e inorgánicos. Tiene una sensibilidad
(límite de Detección) de entre 10-4M y 10-7M,
posee una selectividad moderada – alta, es rápido
y de fácil automatización, tiene una exactitud y
precisión razonables, con un error de entre el 1 –
3%.
Muchos de los compuestos no absorbentes
orgánicos e inorgánicos se pueden analizar
(determinar) haciéndolos reaccionar con reactivos
cromóforos que absorben fuertemente en la región
ultravioleta visible. Para que esto de buen resultado es
necesario que la reacción sea forzada hasta que se
complete.
El procedimiento
para el análisis cuantitativo conlleva determinar las
condiciones que permitan una relación reproducible entre
absorbancia – concentración del compuesto (ha de ser
lineal), para ellos hay que seguir una serie de pasos: Selección de la Longitud de Onda,
determinación de Variables que puedan influir en la
absorbancia (pH, temperatura, presencia de sustancias
interferentes, concentración de los reactivos) y
determinación de la relación entre Absorbancia
– Concentración (17).
OBJETIVOS.
6.1 OBJETIVO
GENERALContribuir con el estudio de V. prionophylla
raíz y hojas en cuanto a la determinación de
isovaltrato por cromatografía en capa fina y
espectrofotometría de absorción ultravioleta
visible.6.2 OBJETIVOS
ESPECÍFICOS6.2.1 Evaluar la presencia de isovaltrato en las
hojas de V. prionophylla cultivada y silvestre de dos
localidades de Guatemala.6.2.2 Evaluar la presencia de isovaltrato en las
raíces de V. prionophylla cultivada de dos
localidades de Guatemala.6.2.3 Comparar cualitativamente los contenidos de
isovaltrato presentes en las muestras de las dos localidades
analizadas.6.2.4 Comparar cualitativamente los perfiles de
isovaltrato obtenidos contra los reportados en la literatura
para V. officinalis.HIPÓTESIS.
Valeriana prionophylla contiene isovaltrato
en su composición química, semejante a
Valeriana officinalis, no hay diferencia en el perfil
de isovaltrato detectado por cromatografía de capa
fina y espectrofotometría ultravioleta visible, entre
muestras de V. prionophylla de dos
localidades.MATERIALES Y
MÉTODOS
8.1 Universo de
trabajo
Valeriana prionophylla cultivada y silvestre de
Guatemala.
8.2 Muestra:
Material silvestre de la localidad de Cerro Raxquim en
Totonicapán (3,221 msnm.; 14º49`59“,
91º23`31“) y material cultivado del Municipioi de
Tacaná, Aldea Vista hermosa en San Marcos.
8.3 Medios:
8.3.1 Recursos
humanos:
Autor:
Asesora: Licda. M.A. Sully Cruz.
Revisores: Lic. M.A. Rodolfo Orozco
Ing. M.Sc. José Vicente
Martínez
Recursos institucionales:
Biblioteca de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia de
la Universidad de San Carlos de
Guatemala.Laboratorio de Investigación de Productos
Naturales LIPRONAT.
8.4 Materiales:
8.4.1 Cámara para cromatografía de capa
fina
8.4.2 Beakers
8.4.3 Tubos de ensayo
8.4.4 Probetas
8.4.5 Pipetas
8.4.6 Erlenmeyers
8.4.7 Espátulas
8.4.8 Columna para cromatografìa de
vidrio
8.4.9 Placa cromatográfica de sílica
gel
8.4.10 Tijeras de jardín
8.4.11 Asperjador
8.4.12 Matraces volumétricos
8.4.13 Pipeteadora
8.4.14 Macerador de vidrio
8.4.15 Papel filtro
8.4.16 Tamiz
8.5 Equipos:
8.5.1 Balanza analítica
8.5.2 Espectrofotómetro ultravioleta
visible
8.5.3 Horno de desecación
8.5.4 Medidor de humedad
8.5.5 Campana de extracción de gases
8.5.6 Baño de María
8.6 Reactivos:
8.6.1 Diclorometano
8.6.2 Ácido clorhídrico
8.6.3 Ácido acético glacial
8.6.4 Tolueno
8.6.5 Acetato de etilo
8.6.6 Estándar de Isovaltrato
8.7 Métodos:
8.7.1 Recopilación bibliográfica: Se
realizó una revisión bibliográfica en las
diferentes fuentes y
bases de datos
acerca de Valeriana prionophylla. La información
recolectada se describió en los incisos 5.2 y 5.2.1 del
presente trabajo.
8.7.2 Obtención de la muestra: Se obtuvo
material silvestre de la localidad de Cerro Raxquim en
Totonicapán (3,221 msnm.; 14º49`59“,
91º23`31“) y material cultivado del Municipioi de
Tacaná, Aldea Vista hermosa en San Marcos.
8.7.2.1 Identificación: Se realizó
comparando las muestras con un patrón de la planta
herborizada del herbario de la Facultad de Agronomía de
la Universidad de San Carlos de Guatemala.
8.7.2.2 Cosecha: Se cosechó material sano tanto
de la raíz como de la hoja. Las partes cosechadas se
depositaron en una bolsa limpia e identificada. Figura
8.
8.7.2.3 Poscosecha: Se lavaron las partes cosechadas
por separado con agua potable
y se dejó escurrir el material para eliminar el exceso
de agua. Se cortó el material para su posterior
desecación.
8.7.2.4 Secado y almacenamiento: Se colocó el material en
bandejas, en lugar ventilado, sin exposición directa a los rayos del sol.
Tanto las hojas como las raíces se almacenaron enteras
en bolsas plásticas, limpias e identificadas.
8.7.2.5 Tamizado y molienda: Las hojas fueron pasadas
por tamiz, obteniéndose un tamaño entre 0.5
– 2.0 cm, Figura 9. Las raíces se cortaron en
trozos de entre 0.5 – 2.5 cm utilizando tijeras de
jardín. Una vez realizado este procedimiento se
procedió a la determinación de la humedad de las
muestras.
8.7.2.6 Determinación del contenido de humedad:
En una balanza de humedad marca Alojen
MB35, se determinó un valor
inicial del contenido de humedad de las muestras, luego de
tener este valor inicial se procedió a secar nuevamente
la muestra a 35 ºC por 30 minutos en un horno de
desecación, como se muestra en las Figuras 10 y
11.
Después de este secado, se procedió a
determinar la humedad final de las muestras, para proceder de
inmediato a la extracción.
8.7.3 Técnica de separación por
Cromatografía en Capa Fina: Para asegurar que el
disolvente a utilizar en el proceso de extracción por
maceración fuese el correcto, se preparó un micro
extracto y se corrió una Cromatografía en Capa
Fina de cada una de las muestras a analizar, igualmente se
corrió una muestra de polvo de Valeriana
officinalis y de estándar de isovaltrato.
Inicialmente se trataron 0.5 g de cada una de las muestras con
5 mL de diclorometano calentando a 40 ºC por 5 minutos.
Luego del calentamiento se filtró y el residuo se
lavó con 2 mL de diclorometano. Los extractos obtenidos
se combinaron y se evaporaron hasta sequedad. Al residuo
obtenido en la evaporación, se le agregó 0.2 mL
de acetato de etilo. De esta solución se aplicaron 10
mL en una placa cromatográfica de silica gel; la
fase móvil utilizada fue una mezcla de tolueno-acetato
de etilo (75:25). Para el revelado del cromatograma se
utilizó una mezcla de ácido
clorhídrico-ácido acético glacial (8:2)
asperjado sobre la placa y calentado posteriormente a 110
ºC por 10 minutos, luego del calentamiento se
revisó la placa cromatográfica tanto a la
luz visible
como a la luz ultravioleta para detectar todos los puntos que
aparecieron.
8.7.4 Técnica de extracción por
maceración: En un macerador previamente lavado, se
colocó la planta fraccionada, en el caso de las hojas
tamizadas y en el caso de las raíces troceadas. Al
recipiente se le agregó el disolvente extractor el cual
consistió en una mezcla de Tolueno-Acetato de etilo
75:25. El proceso de maceración se dejó por 48
horas. Al final del proceso, se filtro el extracto obtenido por
papel filtro y se colecto en erlenmeyers limpios e
identificados.
8.7.5 Técnica de Separación por
cromatografía en columna: Los extractos obtenidos de la
maceración, fueron sometidos a una separación por
cromatografía en columna. 5 mL de cada uno de los
extractos se hicieron pasar por una columna de vidrio empacada
con silica gel, utilizando como fase móvil una mezcla de
Tolueno-Acetato de etilo (75:25). De cada una de las corridas
cromatográficas en columna realizadas a los extractos se
obtuvieron una serie de fracciones, las cuales se colectaron
por la diferenciación en el color. A cada
una de las fracciones se les realizó una corrida
cromatográfica en capa fina, con el fin de visualizar
semejanzas entre algunas fracciones y combinarlas según
las mismas; para la cromatografía en capa fina se
utilizó como fase móvil una mezcla de
tolueno-acetato de etilo (75:25), para el revelado del
cromatograma se utilizó una mezcla de ácido
clorhídrico-ácido acético glacial (8:2)
asperjado sobre la placa y calentado posteriormente a 110
ºC por 10 minutos, luego del calentamiento se
revisó la placa cromatográfica tanto a la luz
visible como a la luz ultravioleta para detectar todos los
puntos que aparecieron.
8.7.6 Determinación de Isovaltrato por
espectrofotometría de absorción ultravioleta
visible: Cada una de las fracciones finales se sometieron a un
análisis espectrofotométrico con el fin de
determinar la presencia de isovaltrato y en lo posible hacer
una aproximación semicuantitativa del contenido de los
mismos.
8.7.7 Análisis y presentación de
resultados: Se hizo de forma descriptiva. El análisis de
los datos cromatográficos se realizó en base a
los Rf obtenidos, los cuales se compararon con el Rf del
estándar. Igualmente para los datos obtenidos por
espectrofotometría, se analizaron los valores
de las absorbancias de cada una de las fracciones determinado
los mayores contenidos por la medida más alta de
absorbancia. Los resultados de los Rf y de las absorbancias
obtenidas se presentan en forma de tablas.
8.1 Determinación del contenido de
humedad
Los resultados de humedad obtenidos en las muestras a
evaluar de V. prionophylla fueron, para la muestra de hojas de
la localidad de San marcos 14.21 % inicial y 10.12%
después de la desecación; para la muestra de
raíces de la localidad de San marcos 13.69 % inicial y
11.54% después de la desecación; para la muestra
de hojas de la localidad de Totonicapán 12.40 % inicial
y 9.83% después de la desecación y para la
muestra de raíces de la localidad de Totonicapán
11.84 % inicial y 9.40% después de la desecación.
En la Tabla 1 se muestran los resultados de los contenidos de
humedad de las muestras antes y después de ser sometidas
a secado en horno de desecación.
Tabla 1. Valores de
humedad de las muestras Valeriana prionophylla
8.2 Técnica de separación por
Cromatografía en Capa Fina
En la cromatoplaca los resultados obtenidos en las
muestras a evaluar de V. prionophylla fueron, para la muestra
de hojas de la localidad de San marcos 8 bandas; para la
muestra de raíces de la localidad de San marcos 6
bandas; para la muestra de hojas de la localidad de
Totonicapán 8 bandas y para la muestra de raíces
de la localidad de Totonicapán 6 bandas. En la Tabla 2
se muestran los Rf obtenidos.
Tabla 2. Valores de Rf obtenidos en la
cromatoplaca de V. prionophylla
En el revelado se pudo apreciar que el punto o la
mancha y el Rf correspondiente al estándar de
isovaltrato con Rf de 0.53, correspondió a todas las
muestras corridas incluida V. officinalis.
En la Figura 12 se puede observar el revelado de la
placa cromatográfica, en la Figura 13 la interpretación del cromatograma obtenido
y en la Figura 14 se aprecia un cromatograma reportado en la
literatura para V. officinalis.
8.3 Técnica de extracción por
maceración
En la Tabla 3 se muestran los detalles de pesos de
muestras y cantidad de disolvente utilizado para la
extracción.
Tabla 3. Relación peso de muestra
volumen de
disolvente en la obtención de los extractos de
Valeriana prionophylla
Las Figuras 15 y 16 muestran los diferentes extractos
obtenidos.
8.3 Técnica de Separación por
cromatografía en columna
Los extractos obtenidos de la maceración,
fueron sometidos a una separación por
cromatografía en columna, como se ilustra en la Figura
17.
De cada una de las corridas cromatográficas en
columna realizadas a los extractos se obtuvieron una serie de
fracciones, las cuales fueron colectadas por la
diferenciación en el color, la que fue muy evidente. Las
fracciones colectadas se muestran en la Figura 18.
A cada una de las fracciones se le hizo una corrida
cromatográfica en capa fina, con el fin de visualizar
semejanzas entre algunas fracciones y combinarlas según
las mimas. En las Figuras 19, 20, 21 y 22 se muestran las
placas cromatográficas obtenidas para cada una de las
fracciones de los cuatro extractos.
De las corridas cromatográficas realizadas a
las fracciones obtenidas por separación en columna de
los extractos diclorometánicos, se buscó la
semejanza en el perfil de separación para mezclar las
fracciones comunes, los resultados obtenidos de este trabajo se
muestran en la Tabla 4.
Tabla 4. Relación de fracciones
obtenidas de los extractos de V. prionophylla
Técnica de determinación
cualitativa por Espectrofotometría de
absorción ultravioleta/visible.
Luego de correr las muestras, se compararon los
espectros obtenidos y los resultados de este análisis se
describen en las Tablas 5 y 6.
Tabla 5. Longitudes de onda de mayor
absorción de los extractos de V.
prionophylla
Muestra | Longitudes de onda de mayor |
Hojas San Marcos | 282 , 414 , 670 |
Raíces San Marcos | 285 |
Hojas Totonicapán | 282 , 415 , 670 |
Raíces Totonicapán | 283 |
Los espectros obtenidos se muestran en las Figuras 23,
24, 25, 26, 27 y 28.
Las muestras de las fracciones de los extractos de las
raíces de ambas localidades, presentaron un
máximo de absorción a 284 ±2 nm y las
muestras de las fracciones de los extractos de las hojas a 284
±2 nm, 414 ±2 nm y 670 ±2 nm.
Tabla 6. Relación de valores de
absorbancia por fracciones de los extractos de V.
prionophylla
Las absorbancias obtenidas de las fracciones de los
extractos de raíces, presentan valores mayores (entre
2.3 y 2.6 AU) a 284 ±2 nm; en cambio las
absorbancias obtenidas para las fracciones de los extractos de
las hojas exhiben máximos de 0.10 a 0.15 AU.
DISCUSIÓN DE
RESULTADOSEl presente trabajo realizado sobre muestras de
V. prionophylla muestra diversos aspectos en cuanto a
la detección de isovaltrato en cromatografía en
capa fina y por espectrofotometría de absorción
ultravioleta visible, los cuales permiten establecer
relaciones comparativas cualitativas con respecto a la
especie de referencia que es V. officinalis. En la
fase previa, donde se realizó una micro
extracción de las muestras vegetales con diclorometano
y una corrida por cromatografía en capa fina de los
residuos obtenidos, se comprobó que este es un
disolvente que logra extraer los valepotriatos de forma
eficiente. Al efectuar el proceso de obtención de los
extractos por maceración, se observó que los
extractos de las hojas presentaban una coloración azul
verdosa oscura, en cambio los extractos de las raíces
eran amarillo pálido.Con respecto a la separación por
cromatografía en columna aplicada a cada uno de los
extractos obtenidos, es adecuado señalar que hubo una
verdadera separación perceptible por capas de colores
que se notaban a simple vista, las cuales fueron el punto de
medida en la obtención de las diversas fracciones
obtenidas. Estas fracciones se analizaron por
cromatografía en capa fina, con el objeto de detectar
en cuales de ellas se encontraba presente el compuesto
isovaltrato, y además para poder mezclar algunas
fracciones entre si por semejanza en los perfiles
cromatográficos obtenidos.Al realizar un análisis detallado de las
placas cromatográficas en capa fina, se observa que se
encuentran presentes otros componentes, que aunque como no se
corrió ningún otro estándar
además de isovaltrato, al comparar con el cromatograma
reportado en la literatura para V. officinalis (Figura
14), se evidencia la presencia de ácidos
valerénicos, valtrato y acevaltrato. Al efectuar las
corridas espectrofotométricas, se detectó la
presencia de isovaltrato en todas las muestras a una longitud
de onda de 284 ±2 nm, sin embargo esta resultó
más notoria en las muestras de raíces, donde la
absorción marcó
un valor alto en la escala del
espectro. Se corrió un estándar de isovaltrato
para corrobar la identidad
del mismo en las muestras. También en todas las
corridas por cromatografía en capa fina se
aplicó el estándar de isovaltrato, y en todas
ellas como se puede observar en las figuras de las placas
cromatográficas (Figuras 13, 19, 20, 21 y 22), se
evidenció la presencia de este componente.Al analizar los resultados de las lecturas
espectrofotométricas (Tablas 5 y 6), se observa que
los valores de absorbancia de las raíces son
aproximadamente 10 veces mayores que los valores obtenidos
para las hojas, lo que comprueba que las raíces
contienen mayor cantidad de isovaltrato que las hojas. El
esquema propuesto para la extracción y
separación de isovaltrato en las muestras vegetales
brindó resultados satisfactorios, ya que se obtuvieron
fracciones muy simples en las cuales se pudo detectar la
presencia de isovaltrato tanto como por cromatografía
en capa fina como por espectrofotometría de
absorción ultravioleta visible.CONCLUSIONES
Las muestras analizadas de hojas y raíces
de V. prionophylla de ambas localidades (San Marcos
y Totonicapán) tienen presente Isovaltrato, al igual
que la muestra en polvo de V.
officinallis.Las raíces contienen mayor cantidad de
Isovaltrato que las hojas, según los datos obtenidos
por espectrofotometría de absorción
ultravioleta visible.Además de Isovaltrato, podemos evidenciar
la presencia de valtrato, acevaltrato y ácidos
valerénicos en las muestras vegetales.El solvente extractor utilizado (diclorometano),
logró extraer el compuesto de interés de este
trabajo, que fue el isovaltrato.Utilizando la técnica de
espectrofotometría de absorción ultravioleta
visible, se logra la identificación de Isovaltrato a
una longitud de onda de 284 ± 2 nm.La presencia de isovaltrato y de otros
valepotriatos, justifican el uso equiparable de V.
prionophylla como planta medicinal al igual que los
usos reportados en las Farmacopeas para V.
officinalis.
Realizar un análisis cuantitativo de las
muestras objeto del estudio, utilizando la técnica
espectrofotométrica.Realizar la validación de la técnica
espectrofotométrica, para poder crear
estándares de calidad para la elaboración de
productos fitofarmacéuticos.Realizar ensayos sobre otros solventes
extractivos, con el objeto de estandarizar cual es el
solvente que extrae mejor y en mayor cantidad los
valepotriatos y en especial el Isovaltrato.Incluir en el estudio muestras de otras
localidades, para realizar un análisis comparativo
general entre las mismas.Realizar un análisis comparativo,
utilizando diversas técnicas
(Espectrofotometría ultravioleta visible,
Cromatografía Líquida de Alta
Resolución HPLC), entre diferentes muestras de
diferentes órganos de V. prionophylla y los
de V. officinalis.Incluir en la metodología la detección y
cuantificación de otros valepotriatos, para obtener
un perfil fitoquímico más amplio de la
especie.Reducir el barrido espectrofotométrico a un
rango entre 220 y 300 nm, con el fin de obtener mejores
espectros que evidencien la presencia y
cuantificación de isovaltrato
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Figura 8. Cosecha del material vegetal de
V. prionophylla de Totonicapán
Figura 9. Tamizado de las hojas de V.
prionophylla
Figura 10. Balanza de humedad marca
Halogen
Figura 11. Horno de desecación
conteniendo muestra de V. prionophylla
Figura 12. Revelado de placa
cromatográfica de V. prionophylla
Figura 13. Interpretación del
cromatograma revelado de V. prionophylla
Figura 14. Cromatograma reportado en
literatura para V. officinalis
Figura 15. Extractos de V. prionophylla obtenidos
por maceración de muestra de San
Marcos
Figura 16. Extractos de V. prionophylla obtenidos
por maceración de muestra de
Totonicapán
Figura 17. Separación por cromatografía en
columna de extractos de V. prionophylla obtenido de
muestra de hojas de San Marcos
Figura 18. Fracciones obtenidas de la
cromatografía en columna del extracto de V.
prionophylla
Figura 19. TLC de las fracciones de cromatografía
en columna del extracto de V. prionophylla de hojas de San
Marcos
Figura 20. TLC de las fracciones de cromatografía
en columna del extracto de V. prionophylla de
raíces de San Marcos
Figura 21. TLC de las fracciones de cromatografía
en columna del extracto de V. prionophylla de
hojas de Totonicapán
Figura 22. TLC de las fracciones de cromatografía
en columna del extracto de V. prionophylla de
raíces de Totonicapán
Figura 23. Espectro de Absorción de las
fracciones obtenidas del Extracto diclorométanico de las
hojas de V. prionophylla de San Marcos
Figura 24. Espectro de Absorción de las
fracciones obtenidas del Extracto diclorométanico de las
raíces de V. prionophylla de San Marcos
Figura 25. Espectro de Absorción de las
fracciones obtenidas del Extracto diclorométanico de las
hojas de V. prionophylla de Totonicapán
Figura 26. Espectro de Absorción de las
fracciones obtenidas del Extracto diclorométanico de las
raíces de V. prionophylla de
Totonicapán
Figura 27. Espectro de Absorción del
estándar de Isovaltrato
Figura 28. Espectro de Absorción del
estándar de Isovaltrato
Lic. Davinson Javier Riquett Robles
Autor
Licda. Sully Cruz, M.A.
Asesora
Ing. José Vicente Martínez,
M.Sc.
Revisor I
Lic. Rodolfo Orozco, M.A.
Revisor II
Licda. Anne Liere de Godoy, M.Sc
Directora de Escuela de
Postgrados
DEDICATORIA
A DIOS Por ser la fuente de inspiración y
sabiduría para poder llegar a ser lo que soy y cumplir con
uno de los objetivos que tiene para mí en mi vida. Para ti
Dios, muchas gracias por ayudarme a culminar esta etapa de mi
formación y de mi vida.
A MI HIJO Davinson Daniel, mi gran tesoro y a quien
dedico todos mis esfuerzos y aspiraciones; fuente de
inspiración y fortaleza. Eres lo más lindo que
tengo en la vida.
A MI MADRE Carmen, con profunda gratitud sea este un
regalo y tributo a todos tus sacrificios, trabajo, desvelos y
esperanza de que llegara a ser un gran profesional. Gracias por
creer en mí.
A MI PADRE Gilberto, infinitas gracias por los esfuerzos
para educarme. Gracias por tu inquebrantable confianza en
mí y por toda la ayuda que me has brindado en toda mi
vida.
A MIS HERMANOS Gil, Eduardo, Carmen y Diana, por todo el
cariño y la confianza que siempre han depositado en
mí.
AGRADECIMIENTOS
A MI ASESORA Licda. M.A. Sully Cruz, por compartir
conmigo sus conocimientos científicos y ayudarme en la
culminación de esta Maestría.
A MI ASESOR Lic. Armando Cáceres, por compartir
conmigo sus conocimientos científicos y ayudarme en la
culminación de esta Maestría.
A MIS PROFESORES Ing. Alvaro Orellana, Lic. Benito
Soler, Licda. Sully Cruz, Lic. Armando Cáceres, Ing.
Vicente Martínez, Lic. Linneo, Licda. Maria Eugenia
Paredes, Dr. Oscar Cóbar, Lic. Rodolfo
Orozco.
A MIS COMPAÑEROS Ing.
Benjamín Piedra Santa, Ing. Francisco Aldana, Dr. Edwin
Cann, Dr. Angel Quiñónez y Lic. Juan Carlos
Garrido, por apoyarme en el transcurso de este proyecto y
brindarme su apoyo.
A LA UNIVERSIDAD Por brindarme la oportunidad de
pertenecer a ella.
SAN CARLOS DE
GUATEMALA
DATOS DEL AUTOR:
Licenciado en Química y
Farmacia
Universidad del Atlántico, Colombia.
Maestría en Producción y Uso de Plantas
Medicinales
Universidad San Carlos de Guatemala,
Guatemala
Doctorando en Ciencias Químicas,
2,008
Atlantic Internacional University, USA
Reconocimientos:
Distinción “CUM LAUDE” por
excelencia en el desarrollo del programa MUPLAM
de la Universidad San Carlos de Guatemala,
Guatemala.
Investigaciones realizadas:
“Estudio fitoquímico y farmacológico
de la semilla de Achras sapota linn”
“Análisis por espectrofotometría de
Isovaltrato en extracto de hoja y raíz de Valeriana
prionophylla de dos localidades diferentes de
Guatemala”.
Informe de tesis
para optar al título de
MAESTRO EN PRODUCCIÓN
Y USO DE PLANTAS MEDICINALES
JUNTA DIRECTIVA
Oscar Manuel Cóbar Pinto, Ph.D. DECANO
Pablo Ernesto Oliva Soto SECRETARIO
Licda. Lillian Raquel Irving Antillón,
M.A. VOCAL I
Licda. Liliana Vides de Urizar VOCAL II
Licda. Beatriz Eugenia Batres de Jiménez VOCAL
III
Ángel Damián Reyes Valenzuela VOCAL
IV
Ángel Jacobo Conde Pereira VOCAL V
CONSEJO ACADÉMICO
SISTEMA DE ESTUDIOS DE POSTGRADO
Oscar Manuel Cóbar Pinto, Ph.D.,
DECANO
Licda. Anne Liere de Godoy, M.sc.
Dr. Jorge Luis De Leon Arana
Dr. Jorge Erwin López Gutiérrez
Félix Ricardo Veliz Fuentes, M.Sc.
Este trabajo se realizó en el laboratorio de
Investigación de Productos Naturales LIPRONAT, de la
Universidad de San Carlos de Guatemala, Guatemala, entre julio y
noviembre de 2007.
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